Teléfono directo Análisis de Ciclo de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos que usan la acústica Attune Centrándose citómetro y Vybrant DyeCycle ADN Violet Stain

Resumen

Un protocolo para el análisis del ciclo celular en vivo de Drosophila Tejidos usando la Acoustic Attune citómetro de enfoque se describe. Este protocolo proporciona simultáneamente información sobre el tamaño relativo de células, el número de células, y el tipo de contenido de ADN celular a través de rastreo de linaje o expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes In vivo.

Resumen

La citometría de flujo ha sido ampliamente utilizado para obtener información sobre el contenido de ADN en una población de células, para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular. Esta técnica se ha ampliado con éxito a los tejidos mitóticas del organismo modelo Drosophila melanogaster para los estudios genéticos de la regulación del ciclo celular in vivo. Cuando se combina con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico y manipulaciones genéticas, se puede obtener información detallada acerca de los efectos sobre el número de células, el tamaño celular y el ciclo celular en la eliminación in vivo. Sin embargo este método en vivo de células se ha basado en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante, limitar a los usuarios a citómetros de flujo equipado con un láser UV. Hemos modificado este protocolo para utilizar un tinte más reciente en vivo de células de ADN, Vybrant DyeCycle Violet, compatible con el láser violeta 405nm más común. El protocolo presentado aquí permite el análisis del ciclo celular eficiente junto con célulastipo, tamaño relativo de células y la información de número de células, en una variedad de tejidos de Drosophila. Este protocolo se extiende la técnica útil para el análisis del ciclo celular de Drosophila tejidos en vivo para un pequeño analizador de sobremesa, la acústica Attune citómetro de enfoque, que puede ser gestionado y mantenido en una escala de laboratorio-único.

Introducción

La citometría de flujo puede ser utilizado para las mediciones de la viabilidad celular, tamaño de la celda relativa, contenido de ADN y la expresión de la proteína fluorescente en las poblaciones de células vivas. Debido a la replicación de ADN nuclear durante la fase S, la información sobre el contenido de ADN en una población de células puede ser usado para inferir porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular ^1-3. Este método se ha convertido en una piedra angular del análisis del ciclo celular en sistemas modelo de la levadura a los mamíferos.

La mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un excelente sistema modelo para la genética en los análisis in vivo de la regulación del ciclo celular. Las amplias herramientas genéticas disponibles en las moscas permiten manipulaciones tejido elegante específicos y regulado temporalmente de los reguladores del ciclo celular, junto con la fluorescente linaje a base de proteínas vivo trazado ^4-6. La citometría de flujo se ha utilizado para estudiar el contenido de ADN en un número de tipos de células de Drosophila, incluyendo endoreplcélulas cultivadas y células mitóticas icating ^7,8. Un avance importante para los estudios del ciclo celular in vivo fue hecha por de la Cruz y Edgar, con el desarrollo de un protocolo para el análisis citométrico de flujo de discos imaginales de Drosophila diploides vivo ^9,10, un protocolo que se ha utilizado y adaptado por muchos laboratorios. Esta técnica, cuando se combina con linaje genético en el rastreo in vivo a través de la expresión de proteína inducible fluorescente y el etiquetado específico de tejido, permite obtener información acerca de la manipulación de genes efectos sobre el tiempo de duplicación celular global, tamaño de celda y para determinar el momento exacto de fases del ciclo celular in vivo ^{9 , 11.} Sin embargo, este método se ha basado hasta ahora en el uso de la célula permeable al colorante Hoechst 33342 ADN-intercalante para teñir y cuantificar el ADN en las células vivas, lo que ha limitado los usuarios fluyan citómetros con un láser UV capaz de excitar el colorante Hoechst. Estos generalmente se encuentran sólo en los clasificadores (es decir BD FACS Vantage, BD FACSAria) o costosos sistemas de sobremesa multicolor (es decir BD LSR), por lo general requieren el apoyo de las instalaciones básicas de flujo institucionales.

Hemos modificado el protocolo Hoechst basado en utilizar un nuevo tinte de ADN de células vivas de Invitrogen, Vybrant DyeCycle violeta. Este colorante es compatible con un láser violeta de 405 nm, más común en los analizadores de sobremesa más pequeños y están disponibles en el pequeño analizador de sobremesa autónomo, la acústica Attune Centrándose citómetro. Aquí se presenta un protocolo detallado para el análisis del ciclo celular que se puede acoplar con el tipo de células, tamaño de celda, el número de células y el análisis de linaje en una variedad de tejidos de Drosophila durante las diversas etapas de desarrollo utilizando DyeCycle violeta y la Attune. Este protocolo se expande el número de citómetros adecuados para este tipo de análisis con los tejidos de Drosophila y proporciona ejemplos de cómo este tipo de análisis del ciclo celular en vivo puede ser modificado para tipos de tejidos adicionales y etapas de desarrollo.

Protocolo

1. Fly Ganadería

1. Cruz vuela de genotipos deseados en viales de plástico estrechas con 10 ml de levadura-glucosa Medio ³ u otros medios de comunicación ricos en proteínas de su elección. Las amplias herramientas de Drosophila transgénicas disponibles para la expresión específica de tejido y el linaje en el rastreo con expresión de la proteína fluorescente in vivo se describen en detalle en otra parte ^4,5. Transfiera los padres a viales frescas todos los días para obtener una serie de 24 colecciones progenie hora, o para la estadificación más precisa, recolectar embriones en placas de agar y la transferencia de larvas recién eclosionadas a viales como se describe ^10. Para garantizar condiciones uniformes a través de experimentos y evitar el hacinamiento, el número total de plantas de la F1 en un solo vial no debe ser mayor de 100. Dependiendo del diseño genético del experimento, mantener viales en una incubadora apropiada hasta que la fase de desarrollo deseada.
2. Recoger los animales de experimentación: necesitará larvas maduran en la 3 ^ª larvalestadio (L3), a unos 110 a 120 horas de desarrollo para las disecciones de larvas o prepupa blanco (WPP) para la puesta en escena de pupa exacta. Cambios del ciclo celular dramáticas, incluyendo un cambio a un estado no proliferativo se producen en distintos puntos de tiempo durante la metamorfosis ^12,13. Por lo tanto correcta puesta en escena de pupa (a menos de 1 hora del desarrollo) es esencial para el ciclo celular de datos reproducibles durante la metamorfosis. WPP corresponde a 0 horas después de la formación de la pupa (0 h APF) como se muestra en la Figura 1, panel de E. Recoger WPP en una placa de Petri de 35 mm en un Kimwipe doblado húmeda con 2,5 ml de agua para mantener algo de humedad. Edad pupa hasta la etapa (horas APF) deseada a la temperatura adecuada. Tenga en cuenta que el desarrollo procede 1,2 veces más rápido a 29 ° C y 2,2 veces más lentamente a 18 ° C que a la estándar de 25 ° C ^14.
3. Animales Heat-shock para activar de choque térmico flipasa (hs-FLP) inducida por la recombinación de clones linaje rastreo si es necesario ^9,11. Para el choque térmico de larva, sumerjaviales en un baño de agua (regulado a 37 ° C) y garantizar las larvas están completamente sumergidos. Para el choque térmico de pupa, sellar la placa de Petri con Parafilm y totalmente sumérjala en la cubeta de agua. Asegúrese de retirar Parafilm después del choque térmico, para permitir el intercambio de oxígeno suficiente para la supervivencia de los animales. Duración de la de choque térmico depende de la actividad del transgén flipasa utilizado y el número de clones deseados. Nosotros usamos 7-8 min para inducir "pierdan los estribos" linaje trazado clones ¹⁵ en larvas con la hs-FLP transgén en el primer cromosoma y 2-4 min de choque térmico de las pupas en placas de 35 mm, mientras que la hs-FLP transgén en el segundo cromosoma requiere un 20 min. choque térmico para obtener un número similar de clones.

La tasa de división celular y el momento de la disección determina el tamaño de clon en cada tejido. En condiciones normales, nos encontramos con que los clones inducidos en el ala de larvas con un mínimo de choque térmico 20 (usando el HS-flp transgén en el segundo cromosoma) y disecciónTed 48 horas más tarde, contienen aproximadamente 20-30 clones bien separadas con tamaños que van desde 10 células por clon a dos células por clon, con un promedio de alrededor de cuatro células por clon. En contraste, un 7 min de choque térmico con la misma hs-FLP transgén de pupas en una cápsula Petri a la 0 hora APF diseccionó 36 horas más tarde, los rendimientos de los clones bien separados (aproximadamente 15-25) que van de uno a cuatro células con un promedio de 2,2 células por clon. Tales datos pueden ser utilizados para determinar el tiempo medio de duplicación de células para el tejido en estudio.

2. Disección

1. Transferir suavemente las larvas / pupas a un plato de disección de vidrio transparente que contiene 1X PBS.
2. Utilizando un microscopio de disección y mucha luz, agarre suavemente una larva por el abdomen con un fuerte Inox # 5 fórceps, corte el tercio anterior con micro-tijeras, e invertir el tercio anterior presionando la zona interior la boca hacia la parte posterior, mientras que la celebración de la larva cutícula constante (Figura 1A). Retire con cuidado opaque grasa corporal y cualquier intestino restante para aumentar la visibilidad de los tejidos deseados, tales como ala, ojo o el cerebro. Diseccionar los tejidos deseados, eliminar limpiamente alas de la tráquea y la cutícula con unas pinzas, los ojos de la boca-ganchos o el cerebro de los ojos (Figura 1G).
3. Para diseccionar pupa, el uso de una pinza para agarrar suavemente una pupa de la punta anterior de la envoltura pupal donde hay una burbuja de aire, para evitar dañar la pupa dentro (Figura 1C). Pinzas o micro-tijeras en la mano opuesta se pueden utilizar para ayudar a posicionar la pupa flotante para agarrar adecuada. Corte limpio a través de la punta posterior de la pupa con micro-tijeras. Este corte transversal se debe hacer en un ligero ángulo hacia la parte dorsal del animal, para liberar la presión interna sin forzar la grasa histolyzed en los tejidos deseados en el tórax y la cabeza. Recorte cuidadosamente a lo largo de la mediana dorsal, evitando las alas y el complejo ojo-cerebro anterior. Retire con cuidado la pupa de la pupacaso, tome el borde posterior de la epidermis de pupa y tirando de ella fuera de la caja de pupa (Figura 1D). Haga un pequeño agujero en la parte anterior cutícula para el complejo ojo-cerebro con fórceps. Usando una pipeta Pasteur de vidrio con una pera de goma, lave suavemente la disección solución PBS a través de la pupa parcialmente cortada para extraer la grasa histolyzed y cualquier tejido intestinal restante. Esto también lubrica eficazmente la pipeta de vidrio con los lípidos y proteínas, lo que reduce la incidencia de los tejidos disecados se pegue al interior de la pipeta de vidrio más tarde.
4. Para obtener alas pupal, la cutícula que envuelve el ala y la propia ala debe hacer palanca de la pupa (Figura 1E). Esto se puede hacer mediante la celebración de la pupa hacia abajo por la cabeza con una pinza de fórceps durante el uso de otra a cualquiera de captar la punta más posterior de la cutícula ala y tirando hacia fuera o maniobras del fórceps bajo el ala cerca de la bisagra antes de que se desprenda desde el lado de los la carcasa (Figura 1 E). El ala puede entonces ser cortado o rasgado en la bisagra para quitarlo del cuerpo y poner en una pila de distancia de los canales y otros materiales.
5. Para obtener los ojos de pupas o el cerebro, lave la pupa hasta el complejo ojo-cerebro se sale y libre de la pupa (Figura 1F, 1H). Usando una pinza, tire suavemente el ojo pupa fuera del cerebro y salvar el tejido deseado.
6. No tome más de 45 minutos para diseccionar cada muestra, ya que los resultados se vuelve menos precisa de las células más largas se dejan en PBS después de la apertura de los animales.

3. La disociación de tejidos y ADN de tinción

1. Utilizando una pipeta Pasteur lubricado, transfiera cuidadosamente los tejidos disecados en 0,5 ml de solución de tinción de ADN en vivo en un tubo de poliestireno de 5 ml (Figura 1G). Transferencia de tan poco como sea posible PBS (menos de 300 l) en la solución de tinción de ADN, como la dilución de tripsina se inhibir la disociación del tejido.
2. Incubar los tubos con Shaking a 23 ° C a 500 rpm (usamos un Thermomixer de Eppendorf).
3. Incubar durante 70 min, a continuación vórtice suavemente durante 5 segundos a una velocidad media (ajuste de 5). Agitación excesiva puede causar la ruptura celular y escombros forma, mientras que bajo-agitación dará lugar a grupos de células. Devolver las muestras a agitación a 23 ° C a 500 rpm para un adicional de 15 a 20 min antes de vórtex una vez más durante 5 segundos a velocidad 5.
4. Para encéfalo y los ojos pupal mayores de 36hAPF, se requiere un protocolo modificado. Disociar tejidos en solución de tinción de ADN a 23 ° C a 500 rpm durante 45-60 min en tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. A continuación, uno por uno se disocian manualmente grandes trozos de tejido mediante la transferencia a la disección plato junto con alrededor de 50 l solución de tinción de ADN y de pipeteado rápido hacia arriba y abajo con una pipeta Pasteur dibujado manualmente ¹⁶ (de aproximadamente 100-150 m de apertura). Transferir cada espécimen disocian con el resto de la 0,5 ml de solución de tinción de ADN en un tubo de 5 ml. Incubar un 45 adicional-30 Min (hasta 90 minutos de tiempo total de incubación) a 23 ° C con agitación a 500 rpm hasta que grumos ya no son visibles.
5. Muestras totalmente disociados deberían tener muy pocos grandes trozos visibles de tejido, aunque tenga en cuenta que la acelular transparente cutícula ala pupal no disociar.

4. Citometría de Flujo

1. Encienda el citómetro Attune y abra el software Attune. El láser del citómetro deben ser entregados a través del menú de inicio, y una prueba de rendimiento diario se deben realizar con bolas de seguimiento de rendimiento con calificaciones adecuadas antes de cada día de la adquisición de datos. Los niveles de líquidos debe ser de al menos la mitad y vaciar los residuos antes de la prueba de rendimiento. Detalles para el arranque, la calibración adecuada y el funcionamiento de la Attune se pueden encontrar en la Guía del usuario Attune ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
2. Diseñar un nuevo template creando 4 gráficos de puntos y 2 histogramas en un espacio de trabajo en blanco con los parámetros indicados en el punto 4.3, o seleccione una plantilla diseñada previamente adecuado para el experimento e indique el número de muestras que deben recogerse. Hemos proporcionado Attune plantillas (archivos. Obtener el formato) para el análisis del ciclo celular Drosophila en vivo con Vybrant DyeCycle Violeta y GFP o RFP expresión en el Apéndice I.
3. Las plantillas que se ofrecen incluyen cuatro gráficos de puntos y dos histogramas con los parámetros indicados en la figura 2. Canales para la detección incluyen: FSC y SSC - dispersión frontal y lado de dispersión que indica el tamaño celular y la complejidad de membrana, VL1 altura (H), ancho (W) y el área (A) - que indica excitación láser violeta de Violet tinción DyeCycle el ADN, y BL1 -A - Blue laser Canal 1 Área, lo que indica la fluorescencia de GFP. La plantilla proporcionada para el análisis de RFP es idéntica a la plantilla para el análisis de GFP, excepto que se utiliza el canal de láser azul 3 (BL3-A), que es optimizaciónzed para detectar RFP.
4. Los diagramas de puntos en las plantillas tienen puertas para restringir el análisis a las poblaciones deseadas y para limitar los desechos de células y grupos de análisis (Figura 2). Puerta 1 excluye escombros y grupos sobre la base de SSC frente a FSC (Figura 2A). Gate 2 excluye las células no teñidas, células apoptóticas G1 sub y grupos de células en base a la identificación de singletes (VL1Area vs VL1Width) (Figura 2B). Puerta 3 es una puerta derivada, que abarca las células dentro de las puertas 1 y 2, e identifica GFP (o RFP) las células negativas vs contenido de ADN basado en VL1Height (Figura 2C). Puerta 4 es una puerta derivada, que abarca las células dentro de las puertas 1 y 2, e identifica GFP (o RFP) células positivas vs contenido de ADN (Figura 2C). Representaciones gráficas de puntos de tamaño de celda, medido por GFP (o RFP) frente a dispersión frontal (FSC) se utilizan para generar Gates, 5 y 6 (Figura 2D). Los dos histogramas parcela contenido de ADN en el recuento del eje X y celular en la Y-axis para las poblaciones definidas por la Puerta 3 y la Puerta 4. (Figura 2E y 2F) histogramas también pueden ser incluidos para tamaño de la celda si se desea (no mostrado). En los histogramas de tamaño de celda, las poblaciones deben fijarse a Gates, 5 y 6, el trazado del FSC en el eje X y cuenta con el eje y.
5. Ajuste de grabación para parar en 10,000 eventos positivos GFP o RFP (esta será la puerta 4, la Puerta derivada de la puerta 1, puerta 2 y la puerta segura de GFP o RFP). El rango va de 6000 - 10.000 GFP acontecimientos positivos han sido tradicionalmente el objetivo de los perfiles de calidad de publicación ^9,11. Le sugerimos usar un mínimo de 15 alas o los ojos, que son aproximadamente el 50% GFP positivos para obtener suficiente Puerta 4 eventos ¹⁰ para perfiles de alta calidad. Sin embargo, hemos logrado obtener datos claros para el análisis preliminar del ciclo celular de tan sólo 6 alas (Figura 3). Ajuste el volumen de adquisición de 300 l, esto se utilizan alrededor de 460 l de la muestra total de 0,5 ml. Tatabla 2 muestra los valores de umbral y el voltaje adecuados que se proporcionan en la plantilla para el ejemplo en la Figura 2.
6. Ejecutar las muestras a la sensibilidad estándar o de alta sensibilidad 100 l / min y grabar. Encontramos poca o ninguna diferencia en nuestro análisis con los diferentes niveles de sensibilidad. Debido a la acústica de enfoque de las células, esta citómetro puede medir con precisión muestras a muy altas velocidades de flujo. A diferencia de citómetros tradicionales, no encontramos datos comprometidos con la adquisición a velocidades de hasta 1500 eventos por segundo. Los archivos de datos grabados generados por el software Attune están en formato. FCS, que es compatible con la mayoría de software de modelado del ciclo celular.

5. Análisis de Datos

1. Los histogramas de tamaño de celda y el contenido de ADN para GFP (o RFP) poblaciones positivas y negativas pueden ser comparados. Se pueden superponer manualmente copiando y pegando con el software Adobe Photoshop. Si el eje está configurado en automático, el eje Y se escala con la highest recuento para cada muestra. La superposición de dos gráficos con el eje Y conjunto de autoescala crea una superposición de histogramas con los ejes establecidos para el máximo global para cada población. Esto permite la comparación visual fácil para los cambios relativos en la puesta en fase del ciclo celular, incluso cuando el número de células totales de GFP positivos y negativos poblaciones GFP no son equivalentes (por ejemplo, en la Figura 3B). Alternativamente, una costumbre del eje y (opción manual eje y) se puede ajustar a un valor fijo para los histogramas. En este caso los números de células relativos de dos poblaciones se pueden comparar. A medida que el Attune utiliza un volumen definido de la muestra por ciclo, la cuantificación absoluta de las células para cada ejecución, en cada puerta con porcentajes de la población total, se puede obtener de la tabla de estadísticas generado automáticamente durante la carrera en el espacio de trabajo (por ejemplo, en la Figura 3F ). Las gráficas de puntos e histogramas también puede ser fácilmente capas en el software Attune, simplemente arrastrando y soltando diferentes muestras de thmenú archivo de ejemplo e en la derecha en la gráfica deseada de una muestra abierta de comparación. Sin embargo, para superponer las subpoblaciones desde dentro de una sola muestra (es decir, GFP y GFP positiva negativa dentro de la misma muestra), utilizamos Photoshop.
2. Dos métodos se pueden utilizar para encontrar porcentajes relativos en diferentes fases del ciclo celular de una población. El método de aproximación se basa en las regiones definidas por el usuario para delinear los límites de G1, S, G2 y G2> picos. Este método permite que las estimaciones rápidas y fáciles de porcentajes en las regiones definidas por el usuario (Figura 3E). Nos pusimos nuestras regiones sobre la base de una prueba directa de células de Drosophila Kc, etiquetado para la fase S con etinil-desoxiuridina (UDE) la incorporación. El segundo método utiliza el software de modelado de tercera parte para la estimación de la distribución del ciclo celular. Se utilizó el software ModFitLT (Verity Software House), por ejemplo, en la Figura 3F.

Resultados

La Figura 2 muestra los resultados representativos de una muestra de ala larvas, que expresan GFP en la mitad posterior del tejido, usando la plantilla proporcionada GFP. Se obtienen resultados similares con el mismo tipo de tejido y el patrón de expresión de RFP usando la plantilla proporcionada RFP (Figura 3A). Las plantillas y los voltajes suministrados (Tabla 2) son adecuados para el análisis de los ojos de larvas (Figura 3B), cerebros y las alas, así como los o...

Discusión

El protocolo se describe aquí permite el análisis de ciclo celular, tamaño de celda relativo y el número relativo de células en los tejidos de Drosophila en directo en diversas etapas de desarrollo. Cuando este análisis se acopla con el tipo de célula expresión de la proteína fluorescente específico o linaje de rastreo, la información detallada se puede obtener sobre las respuestas celulares a ciclo celular discreta o perturbaciones de crecimiento. Como prueba de principio, hemos desbaratado quiescen...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube	BD Falcon	352058	5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Table 1. Required reagents and instruments.
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Threshold (x1000) 100 10 10 10 Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.