Жить анализ клеточного цикла<em&gt; Drosophila</em&gt; Тканей с использованием акустической Attune Фокусировка Цитометр и Vybrant DyeCycle Фиолетовое пятно ДНК

Резюме

Протокол для клеточного цикла анализа живых Drosophila Тканей с использованием Attune акустической фокусировки цитометра описано. Этот протокол одновременно предоставляет информацию о относительный размер ячейки, число клеток, содержание ДНК и клеточного типа с помощью отслеживания клонов или ткани специфической экспрессии флуоресцентных белков В естественных условиях.

Аннотация

Проточная цитометрия широко используется для получения информации о ДНК в популяции клеток, чтобы вывести относительное процентное в различных фазах клеточного цикла. Этот метод был успешно распространен на митотических тканях модельного организма дрозофилы для генетических исследований регуляции клеточного цикла в естественных условиях. В сочетании с сотового типа конкретных флуоресцентных экспрессии белка и генетических манипуляций, можно получить подробную информацию о влияние на количество клеток, размеров клеток и клеточного цикла постепенно в естественных условиях. Однако эта живых клеток метод опирается на использование клетки проницаемыми Hoechst 33342 ДНК-интеркалирующего красителя, ограничивая пользователей проточных цитометров оснащен УФ-лазера. Мы модифицировали этот протокол использовать новые живых клеток ДНК краситель, Vybrant DyeCycle фиолетовый, совместимый с более распространенными фиолетовый 405 нм лазер. Протокол, представленные здесь позволяет проводить эффективный анализ клеточного цикла в сочетании с ячейкитип, относительный размер ячейки и информация количество клеток, в различных тканях дрозофилы. Этот протокол расширяет полезную клеточного цикла анализа для живых тканей Drosophila в небольшой настольный анализатор, Attune Акустическая Цитометр фокусировки, которая может быть запущена и поддерживается на одном-лабораторном масштабе.

Введение

Проточная цитометрия может быть использован для измерения жизнеспособности клеток, относительный размер ячейки, содержание ДНК и флуоресцентные экспрессии белка в клеточной популяции живых. Благодаря репликации ядерной ДНК во время S-фазы, информацию о содержание ДНК в популяции клеток может быть использована для вывода относительное процентное в различных фазах клеточного цикла ^1-3. Этот метод стал краеугольным камнем анализа клеточного цикла в модельных системах от дрожжей до млекопитающих.

Плодовой мушки дрозофилы стал отличным модели системы для генетического анализа в естественных условиях регуляции клеточного цикла. Обширные генетические инструменты, доступные в мухи позволяют элегантные ткани и во времени конкретных манипуляций регулируется регуляторов клеточного цикла, а также в естественных условиях флуоресцентного белка на основе отслеживания клонов ^4-6. Проточная цитометрия был использован для изучения ДНК в число типов Drosophila клеток, включая endoreplicating клетки и культивируемые клетки митотического ^7,8. Важный шаг вперед в естественных исследований клеточного цикла был сделан де ла Круз и Эдгар, с развитием протокола для анализа методом проточной цитометрии живых диплоидных Drosophila дисков имагинальных ^9,10, протокол, который был использован и адаптирован многих лабораторий. Этот метод, в сочетании с генетической линии в естественных условиях трассировки через индуцибельной экспрессии белка флуоресцентные и тканей конкретных маркировки, позволяет получить информацию о генной инженерии воздействие на общее время удвоения клетки, размер ячейки и определить точную синхронизацию фаз клеточного цикла в естественных условиях ^{9 11.} Однако этот метод до сих пор полагались на использование клетки проницаемыми Hoechst 33342 ДНК-интеркалирующего красителя для окрашивания и количественной оценки ДНК в живых клетках, которая ограничивает пользователей течь цитометрии с помощью УФ лазер, способным возбуждать краситель Hoechst. Как правило, они встречаются только в сортировщики (т.е. BD FACS VantaGE, BD FACSAria) или дорогие многоцветные настольных систем (т.е. BD LSR), как правило, требующие поддержки со стороны институциональных средств основного потока.

Мы модифицировали Hoechst протокол на основе использования новых живых клеток ДНК красителя из Invitrogen, Vybrant DyeCycle фиолетового. Этот краситель совместим с фиолетовыми 405 нм лазер, чаще в небольших настольных анализаторов и доступны в небольших автономных настольный анализатор, Attune Акустическая Фокусировка Цитометр. Здесь мы представляем подробный протокол для сотовых анализ цикла, которое может быть связано с типом клеток, размер ячейки, номер клетки и линии анализа в различных тканях дрозофилы на различных этапах развития с использованием DyeCycle Фиолетовый и Attune. Этот протокол расширяет количество цитометры подходящих для такого анализа с тканями Drosophila и примеры того, как этот тип живого анализа клеточного цикла могут быть модифицированы для дополнительных типов тканей и стадиях развития.

протокол

1. Fly хозяйство

1. Крест летит желаемых генотипов в узкие пластиковые флаконы по 10 мл дрожжевой среде с ^{глюкозой-3} или другие богатые белком СМИ по вашему выбору. Обширная трансгенные дрозофилы инструментов, доступных для конкретной ткани выражения и отслеживания клонов с в естественных условиях флуоресцентного белка выражения, подробно описанной в ^4,5. Передача родителей на свежий флаконов в день, чтобы получить серию из 24 коллекций HR потомства, или для более точной постановки, собирать эмбрионы на агара и передачи только что вылупившиеся личинки флаконах ^10, как описано. Для обеспечения равномерного условия в экспериментах и ​​избежать переполнения, общее число потомства F1 в одном флаконе должна быть не более 100. В зависимости от генетической конструкции эксперимента не держать флаконы в соответствующем инкубаторе до желаемого стадии развития.
2. Сбор экспериментальных животных: Вам понадобится взрослых личинок на ^3-й личиночнойвозраста (L3) около 110-120 часов развития для вскрытия личиночной или белый предкуколка (WPP) для точной постановки куколки. Драматические изменения клеточного цикла, включая переход на непролиферативную состоянии происходят в различных временных точках во время метаморфоза ^12,13. Поэтому правильная постановка куколки (в течение 1 ч развития) имеет важное значение для воспроизводимой клеточного цикла данных во время метаморфоза. WPP соответствует 0 часов после формирования куколки (0 ч APF), как показано на рисунке 1, панель я. Сбор WPP в 35 мм чашки Петри на сложенный Kimwipe мокрый от 2,5 мл воды для поддержания некоторых влажности. Возраст куколки до определенной стадии (часы НПФ) при соответствующей температуре. Следует отметить, что развитие происходит в 1,2 раза быстрее при 29 ° С и 2,2 раз медленнее при 18 ° С, чем при стандартной температуре 25 ° С ^14.
3. Теплового шока животных для активации теплового шока flipase (HS-ФЛП)-индуцированной рекомбинации для трассировки линии клонов, если это необходимо ^9,11. Для теплового шока личинки, погрузитьфлаконов в водяной бане (при 37 ° C) и убедитесь, личинки полностью погружен. Для теплового шока куколки, запечатать чашку Петри парафильмом и погрузите ее в водяную баню. Не забудьте удалить парафильмом после теплового шока, чтобы обеспечить достаточное количество кислорода для обмена животного выживания. Продолжительность теплового шока зависит от активности трансгена flipase использованы и количество клонов желательно. Мы обычно используют 7-8 минут для индукции "FlipOut" отслеживания клонов клонов ¹⁵ личинок с HS-FLP трансгена на первой хромосоме и 2-4 мин для теплового шока куколок в 35 блюд мм, тогда как HS-FLP трансгена на второй хромосоме требует 20 мин. теплового шока получить одинаковое число клонов.

Скорость деления клеток и сроков вскрытия определяет клон размером в каждой ткани. При нормальных условиях, мы находим, что клоны индуцированных в личиночной крыло с 20 мин теплового шока (с помощью HS-ФЛП трансгенов на второй хромосоме) и диссекцииTed 48 ч позже, содержат примерно 20-30 хорошо разделены клона с размерами от 10 клеток на два клона клеток на клон, в среднем около четырех клеток на клона. В противоположность этому, 7 мин теплового шока с той же HS-FLP трансген куколок в чашке Петри при 0 час APF расчлененный 36 часов позже, дает хорошо разделены клонов (приблизительно 15-25) в диапазоне от 3:59 клетки со средним 2,2 клеток на клона. Такие данные могут быть использованы для определения среднего времени удвоения ячейку для ткани при исследовании.

2. Рассечение

1. Аккуратно передачи личинок / куколки четкое рассечение блюдо стекла, содержащего 1X PBS.
2. Использование рассекает светового микроскопа и достаточно, мягко понять личинки живота с резким Inox № 5 щипцов, вырезать передней трети с микро-ножницы, и инвертировать передней трети нажатием внутрь области рта к заднему удерживая личиночной кутикулы устойчивый (рис. 1А). Осторожно снимите opaquэлектронной жир и оставшиеся кишки, улучшающая видимость желаемой ткани, такие, как крыло, глаз или мозг. Проанализируйте нужной ткани; чисто удаления крыльев от трахеи и кутикулы щипцами, глаза из уст-крючки, или мозг от глаз (рис. 1G).
3. Для рассечения куколки, использование щипцов, чтобы мягко понять куколки на передний конец куколки случае, где есть воздушный пузырь, чтобы не повредить куколки внутри (рис. 1в). Щипцы или микро-ножниц в противоположные стороны, могут быть использованы, чтобы помочь положение плавающей куколки для правильного захвата. Аккуратно вырезать через задний кончик куколки с микро-ножниц. Этот поперечный разрез должны быть сделаны под небольшим углом по отношению к спинной части животного, чтобы освободить внутреннее давление не заставляя histolyzed жира в желаемую тканей в области грудной клетки и головы. Cut тщательно вдоль спинной медиана, избегая крыльев и переднего отдела глаза, мозг комплекса. Осторожно снимите куколки из куколкислучае, взявшись за задний край куколки эпидермиса и он вывел ее из куколки случае (рис. 1D). Poke небольшое отверстие в кутикулу впереди глаз-мозг комплекса щипцами. Использование стеклянной пипетки Пастера с резиновой грушей, аккуратно вымыть PBS рассечение раствора через частично расчлененный куколки для удаления жира и histolyzed любые оставшиеся ткани кишечника. Это также эффективно смазывает стеклянной пипетки с липидов и белков, что снижает заболеваемость расчлененный тканей от прилипания к внутренней части стеклянной пипетки позже.
4. Для получения куколки крылья, обволакивающий кутикулу крыло и крыло само должно быть вынута из куколки (рис. 1д). Это может быть сделано путем проведения куколки вниз головой с одним щипцов при использовании другой щипцов либо понять наиболее заднем конце крыла кутикулу и вытягивания или маневрировании щипцов под крылом рядом с шарниром перед его смещение со стороны каркас (Figure 1E). Крыло может быть нарезанной или разорванной на шарнире, чтобы удалить его из тела и положить в кучу от туши и другие материалы.
5. Для получения куколки глаза или мозг, мыть куколки до глаз-мозг комплекса не отсоединился и свободного от Куколка (рис. 1F, 1H). Использование щипцов, осторожно потяните куколки глаз от мозга и сохранить нужную ткань.
6. Не дольше, чем 45 минут, чтобы рассекать каждого образца, а результаты становятся менее точными чем дольше клетки остаются в PBS после вскрытия животных.

3. Ткань диссоциации и окрашивания ДНК

1. С помощью пипетки Пастера смазкой, тщательно передачи расчлененный тканей в 0,5 мл Живая ДНК пятна Решение в 5 мл полистирола трубки (рисунок 1G). Передача всего PBS, насколько возможно (менее 300 мкл) в ДНК пятна решение, так как разбавление трипсина будет препятствовать ткани диссоциации.
2. Инкубируйте пробирки с Шекинг при 23 ° C при 500 оборотов в минуту (мы используем термомиксере Eppendorf).
3. Инкубируют в течение 70 мин, затем осторожно вихрь в течение 5 секунд на средней скорости (установка 5). Чрезмерное встряхивание вызовет разрушение клеток и форм мусора, в то время как под-вихреванием приведет к скопления клеток. Возврат образцы встряхивании при 23 ° C при 500 оборотах в минуту в течение дополнительных 15 до 20 мин перед встряхиванием их еще раз в течение 5 сек при скорости 5.
4. Для мозги и глаза куколки старше 36hAPF, модифицированный протокол не требуется. Диссоциируют тканей в ДНК пятна решение при 23 ° C при 500 оборотах в минуту в течение 45-60 мин в 1,7 мл микроцентрифужных пробирок. Затем один за другим вручную отделить большие куски ткани путем перечисления на рассекает блюдо вместе с примерно 50 мкл ДНК пятен и быстрое решение пипетки вверх и вниз с нарисованных вручную пипетки Пастера ¹⁶ (около 100-150 мкм открытия). Передача каждого диссоциированных образца с остальной 0,5 мл ДНК пятна раствора в 5 мл трубки. Инкубируют еще 45-30 Мин (до 90 мин Общее время инкубации) при 23 ° С с перемешиванием при 500 оборотах в сгустки, пока больше не видно.
5. Полностью диссоциированными образцы должны иметь очень немногие большие видимые куски ткани, хотя внимание, что бесклеточная прозрачной кутикулы куколки крыло не отделит.

4. Проточной цитометрии

1. Включите Attune цитометром и откройте Attune программного обеспечения. Цитометром лазеров должна будет включить с помощью меню загрузки, а также ежедневный тест производительности должно быть выполнено с помощью системного отслеживания Бисер с адекватной оценки, до каждого дня сбора данных. Уровни жидкостей должны быть по крайней мере наполовину опустели и отходов до теста производительности. Подробнее о запуске, правильной калибровке и эксплуатации Attune можно найти в руководстве пользователя Attune ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
2. Создать новый TEmplate путем создания 4 точки участков и 2 гистограммы в пустое рабочее пространство с параметрами, указанными в п. 4.3, или выберите ранее разработанный шаблон, подходящий для эксперимента, а также указать количество образцов должны быть собраны. Мы предоставили Attune шаблоны (файлы в формате. Получить формата) для анализа живой клеточный цикл дрозофилы с Vybrant DyeCycle Фиолетовый GFP и RFP или выражение в Приложение I.
3. Шаблонам включают четыре точки участков и две гистограммы с параметрами, указанными на рисунке 2. Каналы для обнаружения включают: FSC и SSC - рассеяния вперед и бокового рассеяния указывает размер ячейки и мембранных сложности, VL1 высота (H), ширина (W) и площади (А) - с указанием Фиолетовый лазерного возбуждения окрашивания Фиолетовый DyeCycle ДНК и BL1 -A - синий лазерный канал 1 уголок, указывающий GFP флуоресценции. Специальный шаблон для анализа RFP идентичный шаблон для анализа GFP, за исключением того, что он использует канал синего лазера 3 (BL3-A), которая является оптимизациейЮНЕСКО нашла для выявления ППП.
4. Точка участков в шаблоны имеют ворота ограничивать анализ нужной населения и ограничить мусора и скопления клеток из анализа (рис. 2). Gate 1 исключает и скопления мусора на основе SSC против FSC (рис. 2А). Gate 2 исключает неокрашенные клетки, суб G1 апоптоза клеток и скопления клеток основана на идентификации синглетами (VL1Area против VL1Width) (рис. 2В). Выход 3 является производным ворота, охватывающий клеток в воротах 1 и 2, и идентифицирует GFP (или RFP) негативных клетках по сравнению с содержанием ДНК на основе VL1Height (фиг.2С). Выход 4 является производным ворота, охватывающий клеток в воротах 1 и 2, и идентифицирует GFP (или RFP)-положительных клеток по сравнению с содержанием ДНК (рис. 2С). Dot участки размером ячейки как измерено GFP (или RFP) против прямого рассеяния (FSC) используются для создания затворов № 5 и 6 (рис. 2D). Две гистограммы содержания ДНК участок на оси Х и количество элементов на Y-Аксис для населения определяется подъезд № 3 и 4. (Рис. 2Е и 2F) Гистограммы также могут быть включены в размер ячейки при желании (не показан). Для гистограмм размер ячейки, население должно быть установлено в ворота 5 и 6, построение FSC на оси Х и рассчитывает на оси у.
5. Установите остановку записи при 10000 GFP или RFP позитивных событий (это будет Gate 4, производный Ворота Ворота 1, 2 ворот и GFP или RFP положительные ворота). Диапазоны от 6000 - 10000 GFP положительные события традиционно были цели для публикации качество профилей ^9,11. Мы рекомендуем использовать минимум 15 крыльев или глаз, что примерно 50% GFP положительные для получения достаточного Gate 4 события ¹⁰ для высококачественных профилей. Тем не менее, мы успешно получили четких данных для предварительного анализа клеточного цикла при использовании всего 6 крыльев (рис. 3А). Установите для приобретения объема 300 мкл, это будет использовать около 460 мкл общего 0,5 мл образца. TaBLE 2 показаны соответствующие настройки порога и напряжения, предоставленными в шаблоне для примера на рисунке 2.
6. Выполнить образцов при стандартной чувствительности или высокой чувствительностью 100 мкл / мин и записи. Мы находим практически нет разницы в наш анализ с различным уровнем чувствительности. За счет фокусировки акустических клеток, это цитометра может точно измерять образцы при очень высоких скоростях потока. В отличие от традиционных цитометрах, мы не находим никаких данных компромисс, приобретая со скоростью до 1500 событий в секунду. Записанные данные файлы, созданные в Attune программного обеспечения в формате. FCS формате, который совместим с большинством мобильных программного обеспечения для моделирования цикла.

5. Анализ данных

1. Гистограмма размера ячейки и содержания ДНК для GFP (или RFP) положительных и отрицательных популяций могут быть сопоставлены. Они могут быть слоистые вручную путем копирования и вставки с помощью Adobe Photoshop программного обеспечения. Если Y-оси установлен автоматический, Y-ось будет масштабироваться с чighest счетчик для каждого образца. Наложение двух графиков с Y-оси установлен в авто-масштабирования создает наложения гистограммы с осями установлен глобального максимума для каждой группы населения. Это позволяет легко для визуального сравнения относительные изменения клеточного цикла постепенно, даже если общее количество ячейке GFP положительные и отрицательные GFP популяции не являются эквивалентными (например, в рис. 3В). Кроме того, пользовательский оси (ось у ручного) может быть установлено фиксированное значение для гистограмм. В этом случае относительное количество клеток в течение двух популяций могут быть сопоставлены. Как Attune использует определенный объем образца в перспективе, абсолютный количественный клеток для каждого запуска, в каждых ворот с процентах от общей численности населения, могут быть получены из таблицы статистики автоматически генерируется во время пробега в рабочей области (например, на рис 3F ). Dot участков и гистограммы также может быть легко слоистых в Attune программного обеспечения, просто перетаскиванием различных образцов из йОБРАЗЕЦ файла меню справа на желаемый график открытых образец для сравнения. Однако для наложения субпопуляции внутри одного образца (т.е. GFP положительные и отрицательные GFP в пределах одного образца), мы используем Photoshop.
2. Два метода могут быть использованы, чтобы найти относительное процентное в различных фазах клеточного цикла для населения. Приближении метод основан на пользователей определенных регионах, чтобы очертить границы G1, S, G2 и> G2 пиков. Этот метод позволяет быстро и легко оценкам проценты в течение определенного пользователем регионах (рис. 3Е). Мы ставим регионов основано на прямых тестов с клетками Drosophila Кс, предназначенного для S-фазы с использованием Этинил-дезоксиуридином (EDU) включение. Второй метод использует третью партию программного обеспечения для моделирования для оценки распределения клеток цикла. Мы использовали ModFitLT (Verity Software House) программного обеспечения, например, на рис 3F.

Результаты

На рисунке 2 показаны результаты для представителя личиночной образца крыло, выражая GFP в задней половине ткани, используя предоставленный GFP шаблона. Аналогичные результаты получены с тем же типом ткани и экспрессии для RFP помощью предоставленного RFP шаблон (фиг. 3А). П...

Обсуждение

Протокол, описанный здесь позволяет анализ клеточного цикла, относительного размера ячейки и относительные количества клеток в живых тканях дрозофилы на различных стадиях развития. Когда этот анализ в сочетании с сотового типа конкретных флуоресцентных экспрессии белка или отс...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube	BD Falcon	352058	5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Table 1. Required reagents and instruments.
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Threshold (x1000) 100 10 10 10 Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.