Análise do Ciclo de células vivas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecidos usando o acústico Attune Focando Cytometer e Vybrant DyeCycle Violeta DNA Stain

Resumo

Um protocolo para a análise do ciclo celular viva Drosophila Tecidos utilizando o Attune Acústico Cytometer Foco é descrito. Este protocolo prevê, simultaneamente, informações sobre o tamanho da célula familiar, número de celular, conteúdo de DNA e tipo de célula via linhagem traçado ou expressão específica de tecido de proteínas fluorescentes In vivo.

Resumo

A citometria de fluxo foi utilizada para obter informação sobre o conteúdo de ADN numa população de células, para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular. Esta técnica tem sido aumentado com sucesso para os tecidos mitóticas do organismo-modelo de Drosophila melanogaster para estudos genéticos de regulação do ciclo celular in vivo. Quando combinada com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula e manipulações genéticas, pode-se obter informações detalhadas sobre os efeitos sobre o número de células, o tamanho da célula e do ciclo celular phasing in vivo. No entanto, este método de células vivas foi contado com a utilização da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante, limitando aos utilizadores citómetros de fluxo equipado com um laser de UV. Nós modificamos este protocolo para usar uma tintura nova célula viva DNA, Vybrant DyeCycle Violet, compatível com o violeta do laser 405nm mais comum. O protocolo aqui apresentado permite a análise do ciclo celular eficiente juntamente com célulastipo, o tamanho relativo da célula e informação do número de células, em uma variedade de tecidos de Drosophila. Este protocolo estende a técnica útil para a análise do ciclo celular de tecidos vivos de Drosophila para um pequeno analisador de bancada, a Focagem Citómetro Attune acústica, o que pode ser executado e mantidas numa escala de um único laboratório.

Introdução

A citometria de fluxo pode ser usado para as medições de viabilidade celular, o tamanho da célula relativo, teor de ADN e expressão de proteína fluorescente em populações de células vivas. Devido à replicação do ADN nuclear durante a fase S, as informações sobre o conteúdo de ADN numa população de células pode ser usada para inferir percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular ^1-3. Este método tornou-se um elemento fundamental da análise do ciclo celular, em sistemas modelo de leveduras aos mamíferos.

A mosca da fruta Drosophila melanogaster, tornou-se um sistema modelo excelente para a análise in vivo genética de regulação do ciclo celular. As extensas ferramentas genéticas disponíveis em moscas permitir manipulações tecido elegante específicas e temporalmente regulada de reguladores do ciclo celular, juntamente com a linhagem baseada em proteína fluorescente vivo rastreamento ^4-6. A citometria de fluxo foi utilizado para estudar o conteúdo de DNA numa série de tipos de células de Drosophila, incluindo endoreple células mitóticas cultivadas icating ^7,8. Um avanço importante para estudos do ciclo celular in vivo foi realizada por de la Cruz e Edgar, com o desenvolvimento de um protocolo de análise por citometria de fluxo directo diplóides ^9,10 discos imaginais de Drosophila, um protocolo que foi usado e adaptado por muitos laboratórios. Esta técnica, quando acoplado com material genético in vivo linhagem rastreio através da expressão da proteína fluorescente indutível e rotulagem tecido específico, permite a obtenção de informações sobre os efeitos de manipulação de genes no tempo de duplicação celular em geral, o tamanho das células e determinar a temporização precisa de fases do ciclo celular in vivo ^{9 , 11.} No entanto, este método tem, até agora, baseou-se no uso da célula permeável corante de ADN Hoechst 33342-intercalante ao manchar e quantificar o DNA em células vivas, o que tem limitado a utilizadores citómetros de fluxo com um laser de UV capaz de excitar o corante de Hoechst. Estes são geralmente encontradas apenas em classificadores (ou seja BD FACS Vantage, BD FACSAria) ou caro multicolor sistemas de bancada (ou seja BD LSR), geralmente necessitando de apoio institucional por instalações do núcleo de fluxo.

Nós modificamos o protocolo baseado em Hoechst usar um corante de DNA de células vivas de novo Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violeta. Este é compatível com o corante violeta de 405 nm, um laser, mais comum em analisadores de bancada menores e disponíveis no analisador de bancada pequena auto-contido, o acústico Attune Focando Citómetro. Aqui é apresentado um protocolo detalhado para a análise do ciclo celular, que pode ser acoplado com o tipo de célula, o tamanho da célula, o número de células e a análise da linhagem de uma variedade de tecidos de Drosophila durante várias fases de desenvolvimento, utilizando o violeta e DyeCycle Attune. Este protocolo expande o número de citómetros adequados para esta análise com os tecidos de Drosophila e fornece exemplos de como este tipo de análise de ciclo de células vivas pode ser modificado para tipos adicionais dos tecidos e estágios de desenvolvimento.

Protocolo

1. Fly Pecuária

1. Cruz voa de genótipos desejados em frascos de plástico estreitas com 10 ml de levedura-Glucose Médio ³ ou outros meios de comunicação ricos em proteínas de sua escolha. As extensas Drosophila transgénicas ferramentas disponíveis para a expressão específica de tecido e da linhagem de rastreio com a expressão da proteína fluorescente in vivo estão descritos em detalhe noutro local ^4,5. Transfira os pais frascos frescos diariamente para obter série de 24 coleções de progênie RH ou para o estadiamento mais preciso, coletar embriões em placas de ágar e transferir larva recém eclodida para frascos, conforme descrito ^10. Para garantir condições uniformes de experimentos e evitar a aglomeração, o número total de descendência F1 num frasco deve ser não mais do que 100. Dependendo da estrutura genética do experimento, manter os frascos num incubador adequada até que o estádio de desenvolvimento desejado.
2. Coletar animais experimentais: você vai precisar larvas maduras no 3 ^º larvalinstar (L3) em cerca de 110-120 horas de desenvolvimento para dissecções larvas ou branco prepupa (WPP) para o preparo de pupa preciso. Alterações do ciclo celular dramáticas, incluindo uma mudança para um estado não-proliferativa ocorrer em instantes distintos durante a metamorfose ^12,13. Portanto preparo correto de pupa (dentro de 1 hr de desenvolvimento) é essencial para os dados do ciclo celular reprodutíveis durante a metamorfose. WPP corresponde a 0 horas depois da formação de crisálidas (0 hr APF), como mostrado na Figura 1, o painel I. Recolha WPP em de 35 mm sobre uma placa de Petri Kimwipe desistiu molhado com 2,5 ml de água para manter uma certa humidade. Idade pupa até o estágio (horário APF) desejado em temperatura adequada. Note-se que o desenvolvimento prossegue, 1,2 vezes mais rápida a 29 ° C e 2,2 vezes mais lentamente a 18 ° C do que no padrão de 25 ° C ^14.
3. Animais de choque térmico para ativar choque térmico flipase (hs-flp) induzida por recombinação de clones linhagem de rastreamento, se necessário ^9,11. Para o choque térmico de larva, mergulhefrascos em um banho de água (a 37 ° C) e garantir larvas são totalmente submerso. Para o choque térmico de pupa, selar a placa de Petri com Parafilm e mergulhe-o em banho-maria por completo. Certifique-se de remover Parafilm após o choque térmico, para permitir a troca de oxigênio suficiente para a sobrevivência animal. A duração do choque de calor depende da actividade do transgene flipase utilizado e do número de clones desejados. Rotineiramente usamos 7-8 min para induzir "Flipout" linhagem rastreamento clones ¹⁵ em larvas com o hs-flp transgene no primeiro cromossomo e 2-4 min por choque térmico de pupas em 35 milímetros pratos, enquanto o hs-flp transgene em o segundo cromossoma requer de 20 minutos. choque térmico para se obter um número semelhante de clones.

A taxa de divisão celular e de sincronização de dissecção determina o tamanho do clone em cada tecido. Em condições normais, nós achamos que clones induzido na asa larval com 20 min de choque térmico (usando o hs-flp transgene no segundo cromossomo) e dissecçãoted 48 horas mais tarde, contêm cerca de 20-30 clones bem separados, com tamanhos que variam de 10 células por clone de duas células por clone, com uma média de cerca de quatro células por clone. Em contraste, a 7 minutos de choque de calor com a mesma hs-flp transgene de pupas numa placa de Petri, a 0 hr APF dissecados 36 horas mais tarde, os rendimentos de clones bem separadas (aproximadamente 15-25), variando de um a quatro células, com uma média de 2,2 células por clone. Tais dados podem ser utilizados para determinar o tempo de duplicação médio de célula para o tecido em estudo.

2. Dissecação

1. Gentilmente transferir as larvas / pupas de uma clara dissecação prato de vidro contendo 1X PBS.
2. Usando um microscópio e muita luz dissecando, segure suavemente a larva pelo abdômen com um Inox afiada º 5 pinça, corte do terço anterior com micro-tesoura, e inverter a terceira anterior, empurrando para dentro área da boca em direção ao posterior, mantendo a larval cutícula constante (Figura 1A). Remova cuidadosamente opaque gordura corporal e qualquer intestino remanescente para aumentar a visibilidade dos tecidos desejados, tais como asa, olho ou cérebro. Dissecar os tecidos desejados; limpa remoção asas da traquéia e cutícula com uma pinça, os olhos da boca-ganchos, ou cérebro dos olhos (Figura 1G).
3. Para dissecar pupa; utilizar uma pinça para agarrar uma pupa suavemente pela ponta anterior da pupa caso em que existe uma bolha de ar, para evitar danificar a pupa dentro (Figura 1C). Pinça ou micro-tesouras no lado oposto pode ser utilizada para ajudar a posicionar a pupa flutuante para agarrar apropriada. Cleanly cortar a ponta posterior da pupa com micro-tesoura. Este corte transversal deve ser feita em um pequeno ângulo para a parte dorsal do animal, para liberar a pressão interna sem forçar a gordura histolyzed nos tecidos desejados no tórax e na cabeça. Corte cuidadosamente ao longo da mediana dorsal, evitando as asas e do complexo olho-cérebro anterior. Remova cuidadosamente a pupa da pupacaso, segurando a borda posterior da epiderme pupa e puxando-o para fora do caso de pupa (Figura 1D). Picar um pequeno buraco no anterior cutícula ao complexo olho-cérebro com uma pinça. Usando um vidro Pasteur pipeta com uma pêra de borracha, lave delicadamente solução dissecção PBS através da pupa parcialmente dissecado para remover a gordura histolyzed e qualquer tecido do intestino remanescente. Isto também eficazmente lubrifica a pipeta de vidro com lípidos e proteínas, o que reduz a incidência de tecidos dissecados de furar para o interior da pipeta de vidro posterior.
4. Para obter asas de pupa, a cutícula envolvendo o ala e da própria ala deve ser erguida a partir da pupa (Figura 1E). Isto pode ser feito segurando a pupa por baixo da cabeça com uma pinça, enquanto utilizando uma outra pinça para agarrar a ponta ou mais posterior da cutícula da asa e puxar para fora ou manobrar o fórceps sob a asa perto da dobradiça antes desalojando-o do lado de a carcaça (Figura 1E). A asa pode então ser cortada ou rasgada na dobradiça para removê-la a partir do corpo e colocado numa pilha de distância das carcaças e outros materiais.
5. Para obter olhos pupa ou cérebro, lave a pupa até o complexo olho-cérebro torna-se desalojado e livre da pupa (Figura 1F, 1H). Usando uma pinça, puxe o olho pupal longe do cérebro e salvar o tecido desejado.
6. Não demorar mais de 45 minutos para dissecar cada amostra, os resultados torna-se menos precisa das células maiores são deixados em PBS após a abertura dos animais.

3. A dissociação de tecidos e de DNA de Coloração

1. Usando uma pipeta Pasteur lubrificado, transferir cuidadosamente os tecidos dissecados em 0,5 ml de solução de coloração de ADN vivo num tubo de 5 ml de poliestireno (Figura 1G). Transferência tão pouco quanto possível de PBS (menos do que 300 ul) à solução corante de ADN, como a diluição de tripsina irá inibir a dissociação de tecidos.
2. Incubar os tubos com shaking a 23 ° C a 500 rpm (usamos um Thermomixer de Eppendorf).
3. Incubar por 70 min, em seguida, vortex suavemente durante 5 segundos a uma velocidade média (criação de 5). Vórtex excessiva causará ruptura celular e detritos forma, enquanto que sob-vórtex conduzirá a aglomerados de células. Retorno as amostras a agitação a 23 ° C a 500 rpm durante mais 15 a 20 minutos antes de vórtex se mais uma vez durante 5 segundos na velocidade 5.
4. Para cérebros e olhos pupa mais de 36hAPF, é necessário um protocolo modificado. Separar os tecidos em solução de coloração de ADN a 23 ° C a 500 rpm durante 45-60 min em tubos de microcentrífuga de 1,7 ml. Em seguida, um-a-um dissociar manualmente grandes pedaços de tecido, transferindo para prato de dissecação, juntamente com cerca de 50 mL da solução de DNA de manchas e rápido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de Pasteur, desenhada manualmente ¹⁶ (abertura de cerca de 100-150 um). Transferir cada espécime dissociados com o resto do 0,5 ml da solução de coloração de ADN para um tubo de 5 ml. Incubar mais 45-30 Min (até 90 minutos do tempo total de incubação) a 23 ° C com agitação a 500 rpm até aglomerados já não são visíveis.
5. Totalmente amostras dissociados deve ter muito poucas grandes pedaços visíveis de tecido, embora note que o acelular transparente cutícula asa pupa não se dissociam.

4. Citometria de Fluxo

1. Ligue o citômetro Attune e abrir o software Attune. Os lasers citómetro deve ser ligada através do menu de inicialização, e um teste de desempenho diário deve ser realizado com os grânulos acompanhamento de desempenho com pontuações adequadas antes de cada dia de aquisição de dados. Níveis de fluido deve ser pelo menos meio cheio e resíduos esvaziado antes do teste de performance. Detalhes para inicialização, calibração adequada e operação do Attune podem ser encontradas no Guia do Usuário do Attune ( http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/cms_082577.pdf )
2. Projetar uma nova template criando quatro gráficos de pontos e dois histogramas em um espaço em branco com os parâmetros indicados no item 4.3, ou selecionar um modelo previamente elaborado adequado para o experimento, e indicar o número de amostras a serem coletadas. Temos desde modelos sintonizar (arquivos em formato. Obter) para análise ao vivo do ciclo celular Drosophila com Vybrant DyeCycle Violeta e GFP ou expressão RFP no Apêndice I.
3. Os modelos fornecidos incluem quatro gráficos de pontos e dois histogramas com os parâmetros indicados na Figura 2. Canais para detecção incluem: FSC e SSC - dispersão para a frente e dispersão lateral indica o tamanho e complexidade da membrana celular, VL1 altura (H), largura (W) e área (A) - indicando excitação laser violeta de coloração violeta DyeCycle o DNA, e BL1 -A - Azul Canal 1 Área de laser, que indica fluorescência da GFP. O molde fornecido para análise RFP é idêntico ao modelo de análise de GFP, excepto que se utiliza o canal de laser azul 3 (BL3-A), que é optimized para detecção de RFP.
4. Os gráficos de pontos nos modelos têm portas de análise de restrição para as populações pretendidas e para limitar e detritos de células aglomerados a partir de análise (Figura 2). Portão 1 exclui detritos e aglomerados baseados em FSC vs SSC (Figura 2A). Gate 2 exclui células não coradas, as células em apoptose G1 sub e aglomerados de células com base em identificação de singlets (VL1Area vs VL1Width) (Figura 2B). Portão 3 é derivada de um portão, as células que engloba dentro portões 1 e 2, e identifica a GFP (ou RFP), células negativas contra o conteúdo de ADN com base em VL1Height (Figura 2C). Portão 4 é um derivado do portão, as células que engloba dentro portões 1 e 2, e identifica a GFP (ou RFP) células positivas versus conteúdo de DNA (Figura 2C). Os gráficos de pontos de tamanho de célula medido por GFP (ou RFP) versus dispersão frontal (FSC), são usados ​​para gerar portões 5 e 6 (Figura 2D). O conteúdo de DNA trama dois histogramas no eixo X e contagem de células no Y-axis para as populações definidas pelo portão 3 e Portão 4. (Figura 2E e 2F) histogramas pode também ser incluído para se desejado, o tamanho da célula (não mostrado). Para histogramas tamanho da célula, as populações devem ser definidos para portões 5 e 6, traçando FSC no eixo X e conta com o eixo-y.
5. Conjunto de gravação para parar a 10.000 GFP ou RFP eventos positivos (este será Gate 4, o Portão derivado de Portão 1, Portão 2 eo portão positivo GFP ou RFP). Varia de 6000 - 10.000 GFP eventos positivos têm sido tradicionalmente o objetivo de perfis de qualidade de publicação ^9,11. Sugerimos utilizar um mínimo de 15 asas ou olhos, que são aproximadamente 50% GFP positivo para obter Portão suficiente 4 eventos para ¹⁰ perfis de alta qualidade. No entanto, temos obtido êxito dados claros para a análise do ciclo celular preliminar de tão poucos como seis asas (Figura 3A). Defina o volume de aquisição de 300 ml, este irá utilizar cerca de 460 mL do total de 0,5 ml da amostra. Tatabela 2 mostra as definições de limiar e tensão adequadas previstas no molde para o exemplo na Figura 2.
6. Executar amostras a sensibilidade padrão ou de alta sensibilidade de 100 mL / min e registro. Encontramos pouca ou nenhuma diferença em nossa análise com os diferentes níveis de sensibilidade. Devido à acústica foco de células, este citômetro pode medir com precisão amostras em altas taxas de fluxo. Ao contrário cytometers tradicionais, encontramos nenhum compromisso com a aquisição de dados em velocidades de até 1.500 eventos por segundo. Os ficheiros de dados gravados gerados pelo software Attune estão no formato. FCS, que é compatível com a maioria dos softwares de modelagem de ciclo celular.

5. Análise de Dados

1. Os histogramas do tamanho das células e o conteúdo de DNA para GFP (ou RFP) populações positivas e negativas podem ser comparados. Eles podem ser colocados em camadas manualmente copiando e colando usando o software Adobe Photoshop. Se o eixo-y é definido como automático, o eixo Y será ampliado com a highest contagem para cada amostra. Sobreposição de dois gráficos com o conjunto do eixo Y para autoscale cria uma sobreposição de histogramas com os eixos definidos para o máximo global para cada população. Isto permite a comparação fácil visual para modificações relativas na faseamento do ciclo celular, mesmo quando o número total de células de GFP positivas e negativas GFP populações não são equivalentes (exemplo na Figura 3B). Alternativamente, um costume eixo y (opção manual eixo y) pode ser ajustado para um valor fixo para os histogramas. Neste caso, podem ser comparados aos números de células relativos de duas populações. Como o Attune utiliza um volume definido de amostra de cada corrida, a quantificação absoluta de células para cada experiência, em cada porta, com percentagens do total da população, pode ser obtida a partir da tabela de estatísticas gerado automaticamente, durante o funcionamento, no espaço de trabalho (exemplo na Figura 3F ). Gráficos de pontos e histogramas também podem ser facilmente em camadas no software Attune, simplesmente arrastando e soltando diferentes amostras a partir de diamenu de arquivo de amostra e à direita para o gráfico desejado de uma amostra aberta para comparação. No entanto, para sobrepor subpopulações de dentro de uma única amostra (isto é, a GFP e GFP positivo negativa dentro da mesma amostra), usamos Photoshop.
2. Dois métodos podem ser usados ​​para encontrar a percentagens relativas em diferentes fases do ciclo celular de uma população. O método de aproximação baseia-se em regiões definidas pelo usuário para delinear os limites do G1, S, G2 e G2> picos. Este método permite que as estimativas rápidas e fáceis de percentagens nas regiões definidas pelo usuário (Figura 3E). Montamos nossas regiões com base em um teste direto com células Kc Drosophila, marcado para a fase S com etinil-deoxiuridina (UDE) incorporação. O segundo método usa o software de modelagem de terceiros para a estimativa da distribuição do ciclo celular. Nós usamos software ModFitLT (Verity Software House), por exemplo, na Figura 3F.

Resultados

A Figura 2 mostra resultados representativos para uma amostra de larvas de asa, expressando GFP na metade posterior do tecido, utilizando o modelo previsto a GFP. Resultados semelhantes são obtidos com o mesmo tipo de tecido e padrão de expressão para a RFP, utilizando o modelo de RFP fornecida (Figura 3A). Os modelos e voltagens fornecidas (Tabela 2) são adequados para análise de olhos larvais (Figura 3B), cérebros e asas, assim como os olhos, cérebros pupa

Discussão

O protocolo aqui descrito permite a análise do ciclo celular, o tamanho da célula relativo e número relativo de células em tecidos de Drosophila vivo em vários estágios de desenvolvimento. Quando esta análise é acoplado com a expressão da proteína fluorescente tipo específico de célula ou linhagem rastreamento, informações detalhadas podem ser obtidas sobre respostas celulares ao ciclo celular discreta ou perturbações de crescimento. Como prova de princípio, interrompido quietude no cérebro da...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12x75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube	BD Falcon	352058	5 ml tubes
Attune Acoustic Focusing Cytometer	Life Technologies/ Applied Biosystems	4445315	Blue / Violet configuration
Attune Cytometer Software (version 1.2.5)	Life Technologies/ Applied Biosystems	Free	PC only
Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml)	Life Technologies/ Applied Biosystems	4449754	For daily performance test
Dumont #5 Inox forceps	Fine Science Tools	11251-20
Embryo dishes 30 mm x 12mm	Electron Microscopy Sciences	70543-30	Glass dissection dishes
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	022670051
Trypsin-EDTA Solution (10x)	Sigma	T4174
Vannas-Tübingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	Straight 5mm Cutting Edge
Vybrant DyeCycle Violet Stain	Life Technologies/ Invitrogen	V35003
Table 1. Required reagents and instruments.
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 9 ml 10X Trypsin-EDTA (Sigma) 5 μl Invitrogen Vybrant DyeCycle Violet (note that this is 0.25X the recommended concentration for mammalian cells. We find that higher concentrations are toxic to Drosophila cells.) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2
FSC SSC BL1 VL1 Threshold (x1000) 100 10 10 10 Voltage (mV) 2950 4250 1800 1150 Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2.