Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Resumen

Macrófagos derivados de monocitos son células importantes del sistema inmune innato. A continuación, describimos un fácil de utilizar In vitro Modelo para generar estas células. Uso de centrifugación en gradiente, el aislamiento negativa de la microesfera y las condiciones específicas de cultivo de células, los macrófagos derivados de los monocitos se pueden generar para los estudios fenotípicos y funcionales.

Resumen

Macrófagos derivados de monocitos representan un tipo de célula importante del sistema inmune innato. Los modelos de ratón que estudian la biología de los macrófagos sufren de las diferencias fenotípicas y funcionales entre los macrófagos derivados de monocitos murinos y humanos. Por lo tanto, aquí describimos un modelo in vitro para generar y estudiar los macrófagos humanos primarios. En pocas palabras, después de centrifugación en gradiente de densidad de sangre periférica extraída de una vena del antebrazo, los monocitos se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica mediante el aislamiento del grano magnético negativo. Estos monocitos se cultivaron a continuación durante seis días en condiciones específicas para inducir diferentes tipos de diferenciación de los macrófagos o de polarización. El modelo es fácil de usar y evita los problemas causados ​​por las diferencias de cada especie, entre el ratón y el hombre. Por otra parte, está más cerca de las condiciones in vivo que el uso de líneas celulares inmortalizadas. En conclusión, el modelo descrito aquí es adecuado para estudiar macrófagos dee biología, identificar mecanismos de la enfermedad y nuevas dianas terapéuticas. A pesar de que no sustituir completamente a los experimentos con animales o tejidos humanos obtenidos post mortem, el modelo descrito aquí permite la identificación y validación de los mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas que pueden ser altamente relevantes para diversas enfermedades humanas.

Introducción

Macrófagos derivados de monocitos representan un importante componente celular del sistema inmune innato y contribuyen a muchos procesos inflamatorios agudos o crónicos ^1. Los macrófagos juegan un papel importante en muchas enfermedades inflamatorias como la aterosclerosis o el cáncer ^2. Los macrófagos muestran un alto grado de plasticidad y son capaces de asumir diferentes fenotipos dependiendo de la micromilieu locales ^3. Por lo tanto, el estudio de la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad es esencial para aumentar nuestro conocimiento de la fisiopatología de muchas enfermedades y para permitir la identificación de nuevas dianas terapéuticas y el desarrollo de terapias novedosas.

En muchos casos, los modelos murinos se utilizan para investigar la fisiopatología de las enfermedades específicas. Sin embargo, el estudio de la biología de los macrófagos utilizando modelos de ratón se acompaña de varios defectos: (1) La proporción de los números de subconjuntos de leucocitos (por ejemplo, monocitos y granulocitos) en peripheral sangre de los ratones o seres humanos difiere significativamente sugiriendo diferentes funciones de los monocitos en la fisiopatología murino y humano. (2) Existen diferencias sustanciales en la expresión génica entre los monocitos de sangre periférica murinos y humanos sugieren diferencias sustanciales en su función durante la salud y la enfermedad ^4. (3) Un número de marcadores que se utilizan para identificar los monocitos murinos y macrófagos (F4/80, LyC, etc.) No existe en las células mieloides humanas, por lo que la transferencia de los resultados en modelos de ratón a la situación humana bastante difícil.

Por lo tanto, con el fin de aumentar nuestra comprensión de la diferenciación de los macrófagos y la heterogeneidad en la enfermedad humana, tenemos que hacer uso de modelos de trabajo con los macrófagos humanos. Por lo tanto, aquí describimos un modelo de generación de macrófagos primaria humana que es fácil de usar y permite el estudio de los macrófagos derivados de los monocitos humanos in vitro en diversas condiciones resultantes en diferentes macrófagos potipos vascularización. En varios estudios, hemos utilizado el modelo in vitro de los macrófagos derivados de los monocitos humanos primarios para analizar la biología de los macrófagos y su potencial relevancia para la aterosclerosis humana ^5-7.

A pesar de que no sustituir completamente a los experimentos con animales o tejidos humanos obtenidos post mortem, el modelo descrito aquí permite la identificación y validación de los mecanismos de la enfermedad y dianas terapéuticas que pueden ser altamente relevantes para diversas enfermedades humanas.

Protocolo

1. Protocolo

1. Prepare Buffers la siguiente manera:
   1. Preparar tampón para aislar PBMC: "Tampón de lavado" = 0,02% de EDTA en PBS (uso 0,5 M EDTA).
   2. Preparar tampón para el aislamiento de monocitos: "tampón MACS aclarado" = 0,5% de BSA (250 mg) + 2 mM de EDTA (200 l) + PBS (50 ml). Desgasifica la memoria intermedia.
   3. Preparar tampón de tinción FACS y almacenamiento de las células: "tampón FACS" = 10% de FCS en PBS y "tampón de fijación" = 1% de PFA en PBS.
2. Dibuja 30 ml de sangre entera de una vena del antebrazo. Usa EDTA como anticoagulante.
3. Aislar PBMC (Histopaque) de la siguiente manera:
   1. Preparar dos tubos estériles de 50 ml (sin poli-estireno).
   2. Diluir la sangre desde el paso 2 con PBS 1:01.
   3. Añadir 25 ml Histopaque + 25 ml de sangre entera / PBS por tubo. Asegúrese de que Histopaque y la sangre no se mezclan.
   4. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA, sin freno.
   5. Aspirar plasma y descarte.
   6. Aspirar interfaz opaca y pipeta en limpio 50 ml bañerae.
   7. Añadir 20 ml de 0,02% de EDTA en PBS.
   8. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 4 ° C.
   9. Desechar el sobrenadante.
   10. Añadir 10 ml de 0,02% de EDTA en PBS.
4. Contar las células como sigue:
   1. Mezclar bien con un vórtex durante 10 s.
   2. Tomar 200 l de suspensión celular + 300 l 0,02% de EDTA en PBS + 500 l de azul de tripano (200-500 células/10 plazas, de lo contrario cambiar el factor de dilución).
5. Realizar el aislamiento negativo de los monocitos de la siguiente manera:
   1. Centrifugar las células obtenidas en la etapa 3.10 durante 10 min, 120 x g. Desechar el sobrenadante.
   2. Lavar 2x sedimento celular mediante la adición de 10 ml de PBS + 0,02% de EDTA y se centrifuga durante 10 min, 120 x g.
   3. Añadir 9 ml de agua estéril durante 3 segundos, añadir 1 ml de PBS 10X.
   4. Lavar una vez más con PBS + 0,02% de EDTA y se centrifuga 10 min, 120 x g.
   5. Contar durante la centrifugación.
   6. Diluir en tampón EasySep a 5 x 10 ⁷ / ml.
   7. Añadir 50 l / ml polla enriquecimiento de monocitoscola.
   8. Incubar durante 10 min a 4 ° C.
   9. Cuentas Vortex durante 30 segundos.
   10. Añadir 50 l / ml de perlas.
   11. Incubar durante 5 min a 4 ° C.
   12. Llenar con tampón EasySep para completar el volumen de 2,5 ml. La solución ahora aparece de color marrón.
   13. Poner en imán.
   14. Esperar 2,5 min a TA. Durante este tiempo, las células no monocıticas vinculados a la perla magnética se trasladarán a la pared del tubo y se adhieren allí.
   15. Vierta tampón con monocitos no vinculantes en el tubo estéril fresco. Esta solución parece blanquecino.
   16. Lavar una vez con PBS + 0,02% de EDTA y se centrifuga durante 10 min, 120 x g.
6. Células de la placa en una placa de plástico o placa de paredes múltiples a una densidad de 0,5 x 10 ⁶ / cm ^2. Añadir 1 ml de medio de cultivo / x 10 ⁶ células 1.
7. Células de cultivo en condiciones de interés para 6-14 días.
8. Cambie los medios después de 3 días, sustituyendo el 50% de los medios de comunicación por medio fresco (ver Tabla 1 para más detalles).
9. Seis días después, las células de la cosecha para el aislamiento de ARNm, citometría de flujo, transferencia Western, etc.

Resultados

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, que habitualmente obtenemos 25.1 sangre x 10 ⁶ ± 2,2 x 10 ⁶ monocytes/100 ml (media ± error estándar de 26 experimentos independientes, Figura 1A). Pureza de monocitos tal como se determina por tinción de citometría de flujo para CD14 es habitualmente mayor que 95% (97,1 ± 0,4%, media ± error estándar de 3 experimentos independientes, la Figura 1B). La viabilidad celular de los monocitos recién aislados como ...

Discusión

Macrófagos derivados de monocitos representan el tipo de célula clave del sistema inmune innato. Juegan un papel importante en muchas enfermedades inflamatorias, incluyendo la aterosclerosis o el cáncer ^2. Por lo tanto, el estudio de la biología de los macrófagos es esencial para aumentar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de muchas enfermedades y permitir el desarrollo de terapias novedosas.

Muchos estudios se aplican modelos de ratón que sobreexpresan o carecen ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
50 ml centrifuge tube (sterile)	Fisher	055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit	StemCell Technologies	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
FACS tubes	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
human M-CSF 10 μg	Peprotech	300-25
Cell Culture Plates 6-well	Fisher	07-200-80