<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

요약

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운 설명 체외에서 모델. 기울기 원심 분리, 부정적인 비드 격리 및 특정 세포 배양 조건 사용하여 단핵구 유래 대 식세포는 표현형 및 기능 연구에 생성 할 수 있습니다.

초록

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포 유형을 나타냅니다. 대식 세포 생물학을 공부 마우스 모델 생쥐와 인간 단핵구 유래 대 식세포 사이의 표현형과 기능의 차이에서 고통. 그러므로, 우리는 여기에 인간의 기본 대식 세포를 생성하고 공부하는 체외 모델을 설명합니다. 간단히, 팔뚝 정맥에서 도출 말초 혈액의 밀도 기울기 원심 분리 한 후, 단핵구는 부정적인 자기 비드 분리하여 말초 혈액 단핵 세포에서 격리됩니다. 이 단핵구는 다음 대식 세포의 분화 또는 편광의 다른 유형을 유도하기 위해 특정 조건 하에서 육일 동안 배양한다. 모델은 사용하기 쉽고 마우스와 인간 사이의 종 별 차이로 인한 문제를 우회. 또한, 그것은 불후의 세포 라인의 사용을보다 생체 조건에 가깝다. 결론적으로, 여기에 설명 된 모델은 macrophag 연구에 적합하다전자 생물학, 질병 메커니즘과 새로운 치료 표적을 식별합니다. 비록 완전히 사후 얻은 동물이나 인간의 조직 실험을 교체하지, 여기에 설명 된 모델은 질병의 메커니즘과 다양한 인간의 질병에 매우 관련이있을 수 치료 표적의 식별 및 유효성 검사를 할 수 있습니다.

서문

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포 구성 요소를 나타내는 많은 급성 또는 만성 염증 과정 ^1에 기여한다. 대식 세포는 동맥 경화증이나 ^암이 같은 여러 염증성 질환에 중요한 역할을한다. 대식 세포 가소성의 높은 수준을 보여주고 지역 micromilieu ^3에 따라 서로 다른 표현형을 가정 할 수 있습니다. 따라서, 대식 세포의 분화와 이질성을 연구하는 많은 질병의 병태 생리에 대한 지식을 향상을 위해 필수적이며, 새로운 치료 표적과 새로운 치료법 개발의 식별을 허용 할 수 있습니다.

많은 경우에, 쥐 모델은 특정 질병의 병태 생리를 조사하는 데 사용됩니다. 그러나 마우스 모델을 사용하여 대식 세포 생물학을 공부하는 것은 몇 가지 단점이 수반된다 : (1) perip에서 백혈구 집합 숫자의 비율 (즉, 단핵구와 과립구)쥐 또는 인간의 heral 피가 상당히 쥐와 인간의 병태 생리에서 단핵 세포의 서로 다른 역할을 제안 다릅니다. (2) 건강과 질병 ^4시 그 기능에 상당한 차이를 제안 쥐와 인간의 말초 혈액 단핵 세포 사이의 유전자 발현에 상당한 차이가 있습니다. (3) 인간의 상황에 마우스 모델에서 연구 결과의 전송은 다소 어렵게, 인간의 골수 세포에서 존재하지 않는 쥐 단핵구와 대식 세포 (F4/80, LYC, 등.)를 식별하는 데 사용되는 마커의 번호입니다.

따라서, 인간의 질병에있는 대식 세포의 분화와 이질성에 대한 우리의 이해를 높이기 위해, 우리는 인간 대 식세포와 협력 모델을 사용하도록해야합니다. 그러므로, 우리는 여기에서 사용하기 쉬운 다른 대식 세포 PO의 결과 다양한 조건 하에서 체외에서 인간의 단핵구 유래 대 식세포의 연구를 할 수 있습니다 인간의 기본 대식 세포 생성의 모델을 설명larization 유형. 여러 연구에서, 우리는 대식 세포 생물학, ^5-7 인간의 죽상 경화증에 대한 잠재적 인 관련성을 분석하는 단핵구 파생 된 인간의 기본 대식 세포의 체외 모델을 사용했습니다.

비록 완전히 사후 얻은 동물이나 인간의 조직 실험을 교체하지, 여기에 설명 된 모델은 질병의 메커니즘과 다양한 인간의 질병에 매우 관련이있을 수 치료 표적의 식별 및 유효성 검사를 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 프로토콜

1. 다음과 같이 버퍼를 준비
   1. PBMC 분리를위한 버퍼를 준비 "버퍼를 씻으"PBS에서 = 0.02 % EDTA (사용 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)).에게
   2. 단핵 세포 분리를위한 버퍼를 준비 "MACS 세척 버퍼"= 0.5 % BSA (250 MG) + 2 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (200 μL) + PBS (50 ML). 드가 버퍼입니다.
   3. "FACS 버퍼"PBS의 = 10 % FCS와 "고정 버퍼"PBS에서 = 1 % PFA : 세포의 FACS 염색 및 저장을위한 버퍼를 준비합니다.
2. 팔뚝 정맥에서 30 ML 전체 혈액을 그립니다. 항응고제로 EDTA를 사용합니다.
3. 다음과 PBMC (histopaque)를 분리 :
   1. 두 멸균 50 ML 튜브 (노 폴리 스티렌) 준비합니다.
   2. PBS 1:1 2 단계에서 혈액을 희석.
   3. + 25 ML 전체 혈액 / PBS 튜브 당 25 ML의 histopaque를 추가합니다. histopaque 혈액이 혼합하지 않도록주의하십시오.
   4. RT, 아니 브레이크 30 분 400 XG에 원심 분리기.
   5. 플라즈마 및 폐기를 대기음.
   6. 깨끗한 50 ML 욕조에 불투명 인터페이스와 피펫을 대기음전자.
   7. PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 20 ML을 추가합니다.
   8. 4 ℃에서 5 분 250 XG에 원심 분리기
   9. 상층 액을 버린다.
   10. PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ML을 추가합니다.
4. 다음과 같이 셀 수 :
   1. 10 초 동안 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다.
   2. 200 μl의 세포 현탁액 + 300 μL PBS에 0.​​02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) + 판 블루 (200-500 cells/10 사각형, 그렇지 않으면 희석 배수를 변경)의 500 μL를 가져 가라.
5. 다음과 같이 단핵구의 음 분리를 수행합니다 :
   1. 10 분, 120 X g에 대해 12 단계 3.10에서 얻은 세포를 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
   2. 10 PBS의 ML + 0.02 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 분, 120 X g 용 원심 분리기를 추가하여 세포 펠렛 배를 씻으십시오.
   3. 1 ML 10X PBS를 추가, 3 초 동안 10 ML 멸균 물을 추가합니다.
   4. PBS + 0.02 % EDTA로 한번 더 씻어 10 분, 120 X g을 원심 분리기.
   5. 원심 분리하는 동안 계산합니다.
   6. 5 × 10 ⁷ / ㎖에서 EasySep 버퍼에 희석.
   7. 50 ML / μL 단핵구 농축 수탉 추가꼬리.
   8. 4에서 10 분 동안 품어 ° C.
   9. 30 초 동안 소용돌이 구슬.
   10. 50 μL / ㎖ 구슬을 추가합니다.
   11. 4에서 5 분 품어 ° C.
   12. 2.5 ML의 볼륨을 완료하기 EasySep 버퍼에 채운다. 이 솔루션은 지금 갈색 나타납니다.
   13. 자석에 넣습니다.
   14. RT에서 2.5 분을 기다립니다. 이 시간 동안 자기 비드에 결합 이외의 단핵 세포는 관 벽으로 이동하고 거기 찌를 것이다.
   15. 신선한 멸균 튜브에 구속력 단핵 세포로 버퍼를 붓는다. 이 솔루션은 하얗게 보인다.
   16. PBS + 0.02 % EDTA 한 번 씻어 10 분, 120 X g 원심 분리기.
6. 0.5 × 10 ^{6 /} ㎠의 밀도에 플라스틱 접시 또는 다중 벽 플레이트 플레이트 세포. 문화 미디어 / 1 X 10 ⁶ 세포의 1 ML을 추가합니다.
7. 6-14일에 대한 관심의 조건 하에서 배양 세포.
8. 새로운 미디어 (자세한 내용은 표 1 참조) 미디어의 50 %를 교체하여 3 일 후에 미디어를 변경합니다.
9. mRNA의 분리, 유동 세포 계측법, 웨스턴 블롯 등을위한 6 일 수확 세포 후.

결과

위에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 우리는 정기적으로 25.1 X 10 ⁶ ± 2.2 × 10 ⁶ monocytes/100 ML의 피를 (26 독립적 인 실험에서 평균 ± 표준 오차, 그림 1A) 구하십시오. CD14에 대한 유세포 염색에 의해 결정 단핵구 순도는 정기적으로 95 % 이상 (97.1 ± 0.4 %, 3 독립적 인 실험 그림 1B에서 평균 ± 표준 오차)입니다. 판 블루 염색에 의해 결정 갓 고립 된 단핵구 세포 ?...

토론

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 체계의 주요 세포 유형을 나타냅니다. 그들은 죽상 경화증이나 암 ^2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환에 중요한 역할을한다. 따라서, 대식 세포 생물학을 공부하는 많은 질병의 병태 생리에 대한 우리의 지식을 높이기 위해 필수적이며, 새로운 치료법의 개발을 허용 할 수 있습니다.

많은 연구는 마우스 모델의 과발현으로 적용?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
50 ml centrifuge tube (sterile)	Fisher	055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit	StemCell Technologies	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
FACS tubes	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
human M-CSF 10 μg	Peprotech	300-25
Cell Culture Plates 6-well	Fisher	07-200-80