Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Riepilogo

Derivate da monociti macrofagi sono cellule importanti del sistema immune innato. Qui, descriviamo un facile da usare In vitro Modello per generare queste cellule. Utilizzando centrifugazione in gradiente, isolamento perlina negativo e specifiche condizioni di coltura cellulare, macrofagi derivate da monociti possono essere generati per studi fenotipici e funzionali.

Abstract

Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante tipo di cellule del sistema immune innato. Modelli murini che studiano la biologia dei macrofagi soffrono delle differenze fenotipiche e funzionali tra murine e umane derivate da monociti macrofagi. Pertanto, noi descriviamo qui un modello in vitro per generare e studiare macrofagi umani primari. In breve, dopo la centrifugazione in gradiente di densità del sangue periferico prelevato da una vena dell'avambraccio, monociti sono isolati da cellule mononucleate del sangue periferico utilizzando negativo magnetico isolamento tallone. Questi monociti vengono poi coltivate per sei giorni in condizioni specifiche per indurre diversi tipi di differenziamento macrofagi o polarizzazione. Il modello è facile da usare e elude i problemi causati dalle differenze specie-specifiche tra topo e uomo. Inoltre, è più vicino alla condizioni in vivo che l'uso di linee cellulari immortalizzate. In conclusione, il modello qui descritto è adatto per studiare macrophage biologia, individuare meccanismi di malattia e nuovi target terapeutici. Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l'identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.

Introduzione

Macrofagi derivate da monociti rappresentano un importante componente cellulare del sistema immunitario innato e contribuiscono a molti processi infiammatori acuti o cronici ^1. I macrofagi giocano un ruolo importante in molte malattie infiammatorie come l'aterosclerosi o il cancro ^2. Macrofagi mostrano un elevato grado di plasticità e sono in grado di assumere differenti fenotipi seconda del micromilieu locale ^3. Così, studiando la differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità è essenziale per aumentare la nostra conoscenza della fisiopatologia di molte malattie e per consentire l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici e lo sviluppo di nuove terapie.

In molti casi, i modelli murini sono usati per studiare la fisiopatologia di malattie specifiche. Tuttavia, lo studio della biologia dei macrofagi utilizzando modelli murini è accompagnato da numerose carenze: (1) La percentuale dei numeri sottoinsieme di leucociti (ossia monociti e granulociti) in peripHeral sangue di topi o esseri umani differisce significativamente suggerendo diversi ruoli dei monociti in fisiopatologia murine e umane. (2) Non ci sono sostanziali differenze nell'espressione genica tra murine e umane monociti del sangue periferico che suggeriscono differenze sostanziali nella loro funzione durante la salute e la malattia ^4. (3) Un numero di marcatori che vengono utilizzati per identificare i monociti e macrofagi murini (F4/80, LYC, ecc.) Non esiste in cellule mieloidi umane, rendendo il trasferimento dei risultati in modelli murini per la situazione umana piuttosto difficile.

Pertanto, al fine di aumentare la nostra comprensione della differenziazione dei macrofagi e l'eterogeneità nella malattia umana, abbiamo bisogno di fare uso di modelli di lavoro con i macrofagi umani. Pertanto, noi qui descriviamo un modello di generazione macrofagi primari umani che è facile da usare e permette studio dei macrofagi derivate da monociti umani in vitro in condizioni diverse conseguente diversa macrofagi PoTipi di vascolarizzazione. In diversi studi, abbiamo usato il modello in vitro di monociti derivati ​​da macrofagi umani primari per analizzare la biologia dei macrofagi e la sua potenziale rilevanza per l'aterosclerosi umana ^5-7.

Anche se non sostituendo completamente gli esperimenti con gli animali o tessuti umani ottenuti post mortem, il modello qui descritto consente l'identificazione e la validazione dei meccanismi della malattia e bersagli terapeutici che possono essere molto importanti per diverse patologie umane.

Protocollo

1. Protocollo

1. Preparare Buffer come segue:
   1. Preparare tampone per l'isolamento PBMC: "Tampone di lavaggio" = 0,02% in PBS EDTA (uso 0.5 M EDTA).
   2. Preparare buffer per l'isolamento dei monociti: "MACS risciacquo cuscinetto" = 0,5% di BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 microlitri) PBS + (50 ml). Degas il buffer.
   3. Preparare tampone per FACS colorazione e conservazione di cellule: "FACS tampone" = 10% FCS in PBS e "Tampone di fissaggio" = 1% in PBS PFA.
2. Disegnare 30 ml di sangue intero da una vena dell'avambraccio. Utilizzare EDTA come anticoagulante.
3. Isolare PBMC (HISTOPAQUE) come segue:
   1. Preparare due provette sterili ml 50 (senza poli-stirene).
   2. Diluire il sangue dal punto 2 con PBS 1:1.
   3. Aggiungere 25 ml HISTOPAQUE + 25 ml di sangue intero / PBS per provetta. Assicurarsi che HISTOPAQUE e il sangue non si mescolano.
   4. Centrifugare a 400 xg per 30 min a TA, nessun freno.
   5. Aspirare al plasma e degli scarti.
   6. Aspirare interfaccia opaca e trasferirli in clean 50 ml vascae.
   7. Aggiungere 20 ml di 0,02% in PBS EDTA.
   8. Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   9. Scartare il surnatante.
   10. Aggiungere 10 ml di 0,02% in PBS EDTA.
4. Contare le cellule come segue:
   1. Mescolare bene nel vortex per 10 sec.
   2. Prendete 200 microlitri di sospensione cellulare + 300 ml 0,02% in PBS EDTA + 500 ml di Trypan blu (200-500 cells/10 piazze, altrimenti cambiare fattore di diluizione).
5. Procedere all'isolamento negativo di monociti come segue:
   1. Centrifugare cellule ottenute nel passo 3.10 per 10 min, 120 x g. Scartare il surnatante.
   2. Lavare pellet cellulare 2x aggiungendo 10 ml di PBS + 0,02% EDTA e centrifugare per 10 min, 120 x g.
   3. Aggiungere 9 ml di acqua sterile per 3 sec, aggiungere 1 ml di PBS 10X.
   4. Lavare nuovamente con PBS + 0,02% EDTA e centrifugare 10 min, 120 x g.
   5. Conte durante la centrifugazione.
   6. Diluire in tampone EasySep a 5 x 10 ⁷ / ml.
   7. Aggiungere 50 cazzo arricchimento monociti microlitri / mlcoda.
   8. Incubare per 10 min a 4 ° C.
   9. Perline Vortex per 30 sec.
   10. Aggiungere 50 perle microlitri / ml.
   11. Incubare per 5 minuti a 4 ° C.
   12. Riempire con tampone EasySep per completare il volume di 2,5 ml. La soluzione appare ora brunastro.
   13. Metti nel magnete.
   14. Attendere 2,5 minuti a temperatura ambiente. Durante questo periodo cellule non monocitiche legati alla perla magnetica si muoveranno sulla parete del tubo e bastone lì.
   15. Versare il tampone con monociti non vincolanti in provetta sterile. Questa soluzione sembra biancastro.
   16. Lavare una volta con PBS + 0,02% EDTA e centrifugare per 10 minuti, 120 x g.
6. Cellule piastra in un piatto di plastica o lamiera multiparete ad una densità di 0,5 x 10 ⁶ / cm ^2. Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura / 1 x 10 ⁶ cellule.
7. Cellule di coltura in condizioni di interesse per 6-14 giorni.
8. Cambiare i media dopo 3 giorni, sostituendo il 50% dei mezzi di comunicazione con mezzi freschi (vedi Tabella 1 per i dettagli).
9. Sei giorni dopo, le cellule raccolto per l'isolamento di mRNA, citometria a flusso, Western blotting, ecc.

Risultati

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo quotidianamente otteniamo 25,1 x 10 ⁶ ± 2.2 x 10 ⁶ monocytes/100 ml di sangue (± errore standard medio di 26 esperimenti indipendenti, Figura 1A). Purezza monociti come determinato dal flusso citometria colorazione per CD14 è ordinariamente maggiore del 95% (97,1 ± 0,4%, ± errore standard media di 3 esperimenti indipendenti, Figura 1B). La vitalità cellulare dei monociti appena isolate come determinato da try...

Discussione

Macrofagi derivate da monociti rappresentano il tipo cellula fondamentale del sistema immune innato. Essi svolgono un ruolo importante in molte malattie infiammatorie comprese aterosclerosi o cancro ^2. Pertanto, lo studio della biologia dei macrofagi è essenziale per aumentare la nostra conoscenza sulla fisiopatologia di molte malattie e per consentire lo sviluppo di nuove terapie.

Molti studi si applicano modelli di topo iperespressione o privi alcuni geni di interesse. Nel caso...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
50 ml centrifuge tube (sterile)	Fisher	055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit	StemCell Technologies	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
FACS tubes	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
human M-CSF 10 μg	Peprotech	300-25
Cell Culture Plates 6-well	Fisher	07-200-80