Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Zusammenfassung

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind wichtige Zellen des angeborenen Immunsystems. Hier beschreiben wir eine einfach zu bedienende In vitro Modell, um diese Zellen zu erzeugen. Mit Zentrifugation, negativen Wulst Isolierung und bestimmten Zellkulturbedingungen kann Monozyten abgeleiteten Makrophagen für phänotypischen und funktionellen Studien erzeugt werden.

Zusammenfassung

Monozyten abgeleiteten Makrophagen eine wichtige Zelltyp des angeborenen Immunsystems. Mausmodelle Studium Makrophagen Biologie leiden unter den phänotypische und funktionelle Unterschiede zwischen Maus und Mensch Monozyten-Makrophagen. Daher beschreiben wir hier ein in vitro-Modell zu erzeugen und zu studieren primären humanen Makrophagen. Kurz nach Dichtegradientenzentrifugation von peripheren Blut von einem Unterarm Vene gezogen werden Monozyten aus peripheren mononukleären Zellen mit negativen magnetischen Kügelchen Isolierung isoliert. Diese Monozyten werden dann sechs Tage lang unter speziellen Bedingungen kultiviert werden, um verschiedene Arten von Makrophagen-Differenzierung oder Polarisation zu induzieren. Das Modell ist einfach zu bedienen und umgeht die Probleme von artspezifischen Unterschiede zwischen Maus und Mensch verursacht. Weiterhin ist es näher an der in vivo-Bedingungen als die Verwendung von immortalisierten Zelllinien. Zusammenfassend ist die hier beschriebene Modell geeignet, um zu studieren macrophage Biologie, identifizieren Krankheitsmechanismen und neue therapeutische Targets. Obwohl nicht vollständig ersetzen Experimente mit Tieren oder menschlichen Geweben erhalten post mortem, ermöglicht die hier beschriebene Modell Identifizierung und Validierung von Krankheitsmechanismen und therapeutische Ziele, die von großer Bedeutung für verschiedene menschliche Krankheiten können.

Einleitung

Monozyten abgeleiteten Makrophagen eine wichtige zelluläre Komponente der angeborenen Immunsystems und zur viele akute oder chronische entzündliche Prozesse ^1. Makrophagen spielen eine wichtige Rolle in vielen entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose oder Krebs ^2. Makrophagen zeigen einen hohen Grad an Plastizität und sind in der Lage, verschiedene Phänotypen in Abhängigkeit von der lokalen Mikromilieus ³ übernehmen. So studieren Makrophagen Differenzierung und Heterogenität ist für die Erhöhung unserer Kenntnis der Pathophysiologie vieler Krankheiten unerlässlich und Identifizierung neuer therapeutischer Targets und Entwicklung neuartiger Therapien zu ermöglichen.

In vielen Fällen sind murine Modelle verwendet werden, um die Pathophysiologie von bestimmten Krankheiten zu untersuchen. Allerdings ist das Studium der Biologie mit Makrophagen Mausmodelle durch mehrere Unzulänglichkeiten begleitet: (1) Der Anteil der Leukozyten Teilmenge Zahlen (dh Monozyten und Granulozyten) in peripHeral Blut von Mäusen oder Menschen unterscheidet sich deutlich darauf hindeutet, verschiedene Rollen von Monozyten in murinen und humanen Pathophysiologie. (2) Es gibt erhebliche Unterschiede in der Genexpression zwischen Maus und Mensch Monozyten im peripheren Blut hindeutet erhebliche Unterschiede in ihrer Funktion während Gesundheit und Krankheit ^4. (3) Eine Reihe von Markern, die verwendet werden, um murine Monozyten und Makrophagen (F4/80, LyC, etc.) Identifizieren nicht in menschlichen myeloischen Zellen existieren, so dass die Übertragung von Erkenntnissen in Maus-Modellen der menschlichen Situation ziemlich schwierig werden.

So, um unser Verständnis der Makrophagen-Differenzierung und Heterogenität in der menschlichen Krankheit zu erhöhen, müssen wir die Verwendung von Modellen der Arbeit mit humanen Makrophagen zu machen. Daher beschreiben wir hier ein Modell der humanen primären Makrophagen Generation, die einfach zu bedienen ist und ermöglicht Untersuchung der menschlichen Monozyten-Makrophagen in vitro unter verschiedenen Bedingungen, die sich in verschiedenen Makrophagen poPolarisation Typen. In mehreren Studien haben wir die in-vitro-Modell von Monozyten abgeleiteten primären humanen Makrophagen verwendet, um Makrophagen Biologie und ihre mögliche Bedeutung für die menschliche Arteriosklerose ^5-7 zu analysieren.

Obwohl nicht vollständig ersetzen Experimente mit Tieren oder menschlichen Geweben erhalten post mortem, ermöglicht die hier beschriebene Modell Identifizierung und Validierung von Krankheitsmechanismen und therapeutische Ziele, die von großer Bedeutung für verschiedene menschliche Krankheiten können.

Protokoll

1. Protokoll

1. Planen Sie Puffer wie folgt:
   1. Planen Sie Puffer für PBMC Trennung: "Waschpuffer" = 0,02% EDTA in PBS (0,5 M EDTA Nutzung).
   2. Planen Sie Puffer für Monozyten Trennung: "MACS Spülpuffer" = 0,5% BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 ml). Degas der Puffer.
   3. Planen Sie Puffer für FACS-Färbung und Lagerung der Zellen: "FACS-Puffer" = 10% FCS in PBS und "Fixierung Puffer" = 1% PFA in PBS.
2. Unentschieden 30 ml Vollblut von einem Unterarm Vene. Verwenden EDTA als Antikoagulans.
3. Isolieren PBMC (Histopaque) wie folgt:
   1. Bereiten Sie zwei sterile 50 ml Röhrchen (kein Poly-Styrol).
   2. Verdünnen das Blut aus Schritt 2 mit PBS 1:1 beträgt.
   3. 25 ml + 25 ml Histopaque Vollblut / PBS pro Röhrchen. Stellen Sie sicher, dass Histopaque und Blut nicht mischen.
   4. Zentrifuge bei 400 xg für 30 min bei RT, keine Bremse.
   5. Saugen Plasma und entsorgen.
   6. Saugen undurchsichtig Schnittstelle und Pipette in sauberen 50 ml Wannee.
   7. 20 ml 0,02% EDTA in PBS.
   8. Zentrifuge bei 250 xg für 5 min bei 4 ° C.
   9. Überstand verwerfen.
   10. 10 ml 0,02% EDTA in PBS.
4. Zählen von Zellen wie folgt:
   1. Gut mischen durch Vortexen für 10 sec.
   2. Nehmen Sie 200 ul Zellsuspension + 300 ul 0,02% EDTA in PBS + 500 ul Trypanblau (200-500 Zellen/10 Quadrate, sonst ändern Verdünnungsfaktor).
5. Führen negativen Isolierung von Monozyten wie folgt:
   1. Zentrifuge Zellen in Schritt 3,10 für 10 min, 120 x g erhalten. Überstand verwerfen.
   2. Waschen Zellpellet 2x durch Zugabe von 10 ml PBS + 0,02% EDTA und Zentrifuge für 10 min, 120 x g.
   3. In 9 ml sterilem Wasser für 3 Sekunden, 1 ml 10X PBS.
   4. Waschen Sie noch einmal mit PBS + 0,02% EDTA und Zentrifuge 10 min, 120 x g.
   5. Zählen Sie während der Zentrifugation.
   6. Verdünnen Sie in EasySep Puffer bei 5 x 10 ⁷ / ml.
   7. In 50 ul / ml Monozyten Bereicherung SchwanzSchwanz.
   8. Inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
   9. Vortex Perlen für 30 sek.
   10. In 50 ul / ml Perlen.
   11. Inkubieren für 5 min bei 4 ° C.
   12. Füllen Sie EasySep Puffer Volumen von 2,5 ml abzuschließen. Die Lösung scheint nun bräunlich.
   13. Setzen Sie in Magneten.
   14. Warten 2.5 min bei RT. Während dieser Zeit nicht Monozyten, gebunden an die magnetischen Kügelchen werden mit der Rohrwand bewegen und bleiben dort haften.
   15. Gießen Puffer mit unverbindlichen Monozyten in frischen sterilen Röhrchen. Diese Lösung sieht weißlich.
   16. Waschen einmal mit PBS + 0,02% EDTA und zentrifugieren für 10 min, 120 x g.
6. Platte Zellen in einer Kunststoffschale oder mehrwandigen Platte mit einer Dichte von 0,5 x 10 ⁶ / cm ^2. 1 ml der Kultur media / 1 x 10 ⁶ Zellen.
7. Kultur Zellen unter Bedingungen von Interesse für 6-14 Tage.
8. Ändern Medien nach 3 Tagen durch Austausch 50% der Medien mit frischem Medium (siehe Tabelle 1 für weitere Details).
9. Nach sechs Tagen Ernte Zellen zur mRNA-Isolierung, Durchflusszytometrie, Western Blot, etc.

Ergebnisse

Mit dem oben beschriebenen Protokoll, wir routinemäßig erhalten 25,1 x 10 ⁶ ± 2,2 x 10 ⁶ ml Blut monocytes/100 (Mittelwert ± Standardabweichung aus 26 unabhängigen Experimenten, 1A). Monozyten Reinheit durch durchflusszytometrische Färbung für CD14 bestimmt wird routinemäßig von mehr als 95% (97,1 ± 0,4%, mittlere ± Standardabweichung von 3 unabhängigen Experimenten, 1B). Die Lebensfähigkeit der Zellen von frisch isolierten Monozyten durch Trypanblau-F...

Diskussion

Monozyten abgeleiteten Makrophagen sind der Schlüssel Zelltyp des angeborenen Immunsystems. Sie spielen eine wichtige Rolle in vielen entzündlichen Erkrankungen einschließlich Arteriosklerose oder Krebs ^2. So studieren Makrophagen Biologie ist für die Erhöhung unserer Kenntnisse über die Pathophysiologie vieler Krankheiten wesentliche und für die Entwicklung neuer Therapien zu ermöglichen.

Viele Studien gelten von Mausmodellen Überexpression oder fehlen bestimmte Gene von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
50 ml centrifuge tube (sterile)	Fisher	055398
D-PBS (1X), liquid (no calcium or magnesium)	Invitrogen	14190-250
EDTA	Sigma	T9285
BSA	Sigma	A-8806
FCS	Invitrogen
EasySep Human Monocyte Enrichment Kit	StemCell Technologies	19059
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
FACS tubes	Fisher	352008
Macrophage-SFM (1X)	Invitrogen	12065-074
Penicillin-streptomycin	Sigma	P-4458
Nutridoma-SP	Roche	11011375001
human M-CSF 10 μg	Peprotech	300-25
Cell Culture Plates 6-well	Fisher	07-200-80