Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

Resumen

El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de cultivo o LCR.

Resumen

El CSF es un fluido complejo con un proteoma que varía dinámicamente durante todo el desarrollo y en la edad adulta. Durante el desarrollo embrionario, la CSF naciente diferencia del líquido amniótico tras el cierre del tubo neural anterior. El volumen de LCR aumenta entonces en los días subsecuentes como las células progenitoras neuroepiteliales que recubren los ventrículos y el plexo coroideo generan LCR. Los embriones de contactos de LCR la apical ventricular superficie de las células madre neurales del cerebro en desarrollo y la médula espinal. CSF proporciona presión de fluido crucial para la expansión del cerebro en desarrollo y distribuye crecimiento importante promoción de los factores de las células progenitoras neurales de una manera temporal específica. Para investigar la función de los CSF, es importante aislar muestras puras de embrionario CSF ​​sin contaminación de la sangre o del tejido en desarrollo telencephalic. Aquí se describe una técnica para aislar muestras relativamente puras de CSF del ventrículo embrionario que se pueden utilizar parauna amplia gama de ensayos experimentales, incluyendo la espectrometría de masas, electroforesis de proteínas, y cultivo de células y explante primario. Se demuestra cómo diseccionar y cultura explantes corticales en membranas porosas de policarbonato con el fin de crecer tejido en desarrollo cortical con volúmenes reducidos de los medios de comunicación o CSF. Con este método, los experimentos se pueden realizar utilizando CSF ​​de diferentes edades o condiciones para investigar la actividad biológica de la proteoma CSF en las células diana.

Introducción

El líquido cefalorraquídeo es un líquido complejo que baña el neuroepitelio desarrollo ^1-6 y ofrece ⁷ Presión esencial y la promoción del crecimiento claves para el desarrollo del cerebro ^8-12. Para estudiar el CSF en el curso del desarrollo del cerebro, hemos desarrollado técnicas para aislar CSF del ventrículo desde el desarrollo de embriones de rata o ratón durante varias etapas de desarrollo ^6,9. Los métodos anteriores de aislamiento incluyó el uso de un cristal de micro-aguja y aislar el CSF utilizando un micro-inyector de ^1,2. Nuestro método utiliza un vaso capilar micro-pipeta cuya punta se ha tirado para crear un punto de penetración en el tejido ultrafino mejorada. El cristal de micro-pipeta capilar está conectado a un aspirador de modo que para obtener el LCR ventricular se puede controlar con cambios suaves en la presión. Para investigar la influencia de células madre de señales de LCR, se diseccionan cerebrales corticales explantes, colocarlos en las membranas de policarbonato y flotar sobre ellos cu apropiadaslture medio suplementado con muestras de LCR ^9. Con esta técnica, los volúmenes reducidos de medios son suficientes para el cultivo de tejidos, lo que permite un uso eficiente de los CSF ^9.

Protocolo

1. Aislamiento de embriones / Preparación

Esta técnica se puede utilizar para el ratón o la rata. En este protocolo se demuestra la técnica de recolección de LCR y disección cerebral cortical explantes con cerebro de ratón embrionario. Vamos a comentar sobre las diferencias importantes en comparación con las ratas ratones que existen dentro de las técnicas generales. Para el sistema de estadificación edad embrionaria, E1 es clasificado como el día de la clavija de ratas, y E0.5 se clasifica como el día de la clavija de ratones.

1. Prepare un plato de micro-disección con Sylgard elastómero de silicona. Sylgard 184 Elastómero de silicona se suministra como un componente de la segunda parte líquido, Parte A y Parte B. La Parte A y la Parte B se mezclan en una proporción de 10:1 en peso o volumen. Después de que los componentes líquidos se mezclan, verter el elastómero sylgard en una placa de Petri para cubrir toda la superficie del plato. Algunas burbujas de aire pueden estar presentes que se disipe durante el proceso de curado. Coloque la tapa de la placa de Petri y deje que el elastomer de curar. El elastómero se puede curar a temperatura ambiente durante 24 h, o a temperaturas más altas (por ejemplo 37 ° C) para acelerar el curado. Una vez que los componentes líquidos se solidifican, el plato de disección está listo para usar. El plato puede ser utilizado repetidamente para múltiples experimentos, a condición de que se haya limpiado bien después del procedimiento.
2. Preparación de la pipeta micro-capilar (aguja). Micro-pipetas capilares se preparan mediante la aplicación de calor y tire usando un extractor de micropipeta Narishige PC-10 vertical con los siguientes ajustes: Un tirón paso; Heater # 2 ajustado a 58; 100 g de peso de tracción. La fina punta de la micropipeta se apagó cuidadosamente usando pinzas finas # 55. El resultante diámetro medio interior de la aguja es de 85 micras.
3. Preparar el montaje aspirador para aspirar líquido cefalorraquídeo. Insertar micro-émbolo provisto de micro-pipetas capilares en la aguja capilar. Alternativamente, adjuntar un filtro desechable de plástico para el extremo del conjunto de tubo de aspiración que está conectado to el micro-pipeta capilar. Introducir la aguja a través de la junta en su posición en el extremo opuesto del conjunto de aspirador.
4. La transferencia de embriones aislados de la basura a un plato de micro-disección preparado con Sylgard.
5. Retire las membranas extra-embrionarias y tejidos con el fin de que el embrión está claramente expuesto. Cada capa de tejido-primero la pared uterina y luego la decidua-puede ser diseccionado utilizando unas tijeras finas para iridectomía (es decir, herramientas Fine Science # 15000-02). En cada sitio de implantación, primero la pared uterina, a continuación, la decidua puede practicarse una incisión en paralelo al eje largo del útero, y la incisión se puede abrir adicionalmente utilizando unas pinzas finas. La decidua puede ser retirado después de una incisión similar, la exposición de las membranas fetales. Se debe tener cuidado para que las membranas fetales no se inciden o perforado.
6. Lavar con solución salina estéril equilibrada Hanks (HBSS) y eliminar el exceso de líquido que rodea el embrión utilizando una pipeta, así como un filtro o Kimwipepapel cortado en triángulos.

2. Ventricular CSF Collection

1. Visualizar embrión bajo el microscopio de disección: para el ratón, el embrión debe ser, por su lado, de tal manera que se tiene una vista sagital del embrión en desarrollo. Con embriones de rata E16 o más, colocar el embrión en su columna vertebral dorsal, a lo largo de su dimensión más larga plana, de un cráneo a la dirección de caudal, como si el embrión está acostado sobre su espalda. De esta manera, el CSF puede ser recogida a partir de ventrículo lateral derecha y la izquierda.
2. Constantemente insertar la pipeta micro-capilar en el ventrículo lateral, ventrículo mesencefálico, o cisterna magna, tratando de no contacto con las células neuroepiteliales una vez que la pipeta se ha insertado. Para los embriones de ratón E14.5 o más, el CSF puede ser aspirado desde el ventrículo derecho y luego se retira la aguja y se inserta en el ventrículo izquierdo. Debido a la permeabilidad de los ventrículos y el tubo neural en embriones más jóvenes que E14.5, latodo el volumen de CSF a menudo puede ser aspirado desde los ventrículos laterales con una inserción de una sola aguja. Sin embargo, este no es siempre el caso, como los tiempos de desarrollo y la permeabilidad de los ventrículos de conexión pueden variar ligeramente, y por lo tanto, la pipeta capilar micro-también se puede insertar en la cisterna magna para recoger el volumen de LCR máxima.
3. Una vez que la pipeta micro-capilar está insertado en el ventrículo lateral, ventrículo mesencefálico, o cisterna magna, con cuidado y suavemente empezar a aspirar el CSF en la pipeta, utilizando el micro-émbolo para crear una presión negativa y aspirar el CSF, o proporcionando una una suave presión negativa creada por la boca de tal manera que CSF comienza a fluir suavemente en el micro-pipeta capilar de una manera lenta y controlada. Recomendamos que el espectador comprobará con sus propios funcionarios locales con respecto a las políticas institucionales sobre estos enfoques.
4. Mantenga la presión negativa y recoger el líquido cefalorraquídeo en el micro-pipeta capilar.En ambos embriones de ratón y de rata de E16.5/E17 o menos, es posible observar el colapso ventrículo ligeramente por la aparición de una chuleta formando en el lado de la cabeza que la pipeta micro-capilar es pulg En embriones más viejos, debido al tamaño más grande del cerebro, puede no ser posible observar la cabeza colapsando.
5. Dejar de aplicar presión y retire con cuidado la pipeta micro-capilar desde el ventrículo lateral.
6. Suavemente expulsar la muestra de LCR en un tubo Eppendorf que ha sido enfriada en hielo.
7. Continuar recogiendo el LCR de una camada entera de los animales y la piscina las muestras en el mismo tubo.
8. Centrifugar a 10.000 xg a 4 ° C durante 10 min para eliminar las células contaminantes.
9. Analizar las muestras para detectar cualquier signo de contaminación de las células neuroepiteliales o glóbulos rojos. Los signos de contaminación se indican normalmente por el fluido que aparece turbia o rojo / rosa, o la presencia de un sedimento con una mancha teñida de sangre. Después de la centrifugación, el CSF puede ser analizada microscópicamente para detectar cualquier evidencia de células o restos celulares. Si hay signos de contaminación del fluido debe ser desechada. Como un control adicional, el contenido de sedimento también puede ser teñido para células. Un limpio muestra de LCR pueden utilizarse para el cultivo celular, cultivo cortical, espectrometría, western blot, ELISA, y otros ensayos. El LCR claro debe ser transferido a un nuevo tubo Eppendorf estéril. La muestra se puede utilizar ahora para el análisis, se combinaron con otras muestras, o se congelaron rápidamente con nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. La congelación y descongelación de las muestras pequeñas de líquido puede resultar en una disminución de volumen pequeño y los cambios en la concentración de proteína. Esto se puede evitar mediante la liofilización de las muestras.

3. Disección Explante Cortical

1. La transferencia del embrión E14.5 aislado de la camada en una fuente de micro-disección preparado con Sylgard.
2. Eliminar embrión de extraembrionarias membranas y tejidos como se describe en el paso 1,5.
3. Lavar con solución estéril de sal equilibrada de Hanks (HBSS) y eliminar el exceso de líquido que rodea el embrión utilizando una pipeta.
4. Diseccionar a través de la región cervical que separa la cabeza del resto del embrión (Figura 1A).
5. El uso de un fino escalpelo (cuchillo oftálmico), cortar la línea media del cuero cabelludo. Agarre cada lado de la incisión con unas pinzas finas y quitar la piel. A continuación, utilice tijeras iridectomía hacer una incisión que corre a lo largo de la línea media del cráneo en desarrollo. Posteriormente, hacer dos incisiones adicionales, aproximadamente 1/3 de la distancia de los extremos anterior y posterior del cráneo en desarrollo. Use unas pinzas finas para captar los "flaps" del cráneo que se derivan de esta parte de la disección, y eliminar el tejido cráneo en desarrollo, la exposición de la corteza (Figura 1B).
6. Uso del bisturí bisect el cerebro a lo largo de la línea media en el plano medio sagital, separando los hemisferios corticales derecho e izquierdo (Figuras1B, C). La pia y la aracnoides se deja conectada a la corteza, y la duramadre se elimina junto con el cráneo en desarrollo.
7. Prepare cada hemisferio cortical por separado. Coloque el lado medial del hemisferio para que usted pueda ver la eminencia ganglionar y el desarrollo de la corteza (Figura 1C, D).
8. Uso del bisturí, hacer una incisión coronal a través del neuroepitelio cortical caudal a la bombilla de desarrollo olfativo. Esta incisión debe comenzar en el límite anterior de las eminencias gangliónicas lateral y medial, y se extienden a través de la región cingulada anterior del rudimento desarrollo cortical (Figura 1E).
9. Hacer otra incisión coronal justo caudal al límite posterior de la eminencia ganglionar lateral (Figura 1F). Esta incisión también debe extenderse desde el límite lateral de la eminencia ganglionar a la pared medial de la rudimento desarrollo cortical.
10. Retirar la cortical "flap" creaobtenidos por las dos incisiones hechas en los pasos 3,7 y 3,8, usando una presión de bisturí o de una corriente suave de HBSS entregados con una pipeta de 200 l para evitar daños mecánicos a la corteza. A continuación, hacer una incisión transversal a lo largo de la frontera que separa la eminencia ganglionar lateral de la corteza en desarrollo (Figuras 1G, H). Entonces, diseccionar el hipocampo en desarrollo y el dobladillo cortical medial del telencéfalo, en el vértice de la neocorteza donde la superficie cortical lateral y la pared interhemisférica.
11. Hacer una incisión transversal a lo largo de la frontera que separa la eminencia ganglionar lateral desde el desarrollo de la corteza (Figura 1H).
12. Quitar cualquier tejido extra diseccionado que está en la placa Sylgard del explante diseccionado cortical. Uno puede utilizar pipeteo suave con tampón HBSS fresco para pipetear la basura cualquier tejido extra disecado. La corteza es disecado ahora con la cara hacia abajo meníngea (Figura 1I).

4. Transferencia de explante Cortical

1. Preparar un bucle de alambre de platino conectada a una pipeta de vidrio. Calentar la pipeta de vidrio con un alambre de platino plegada insertada en el extremo de la pipeta de vidrio. Al girar el extremo del lazo de alambre de platino, el tamaño del bucle puede ser aumentado o disminuido, y el bucle puede ser formado para adaptarse al tamaño del explante deseado. (Este puede ser preparado de antemano y se reutiliza.)
2. Calentar la punta del alambre de platino para esterilizar el bucle.
3. Aislar el explante disecado cortical y retire el soporte de HBSS adicionales por pipeteo suave, dejando una pequeña cantidad para su uso con el lazo de alambre.
4. Colocar un 1 cm de membrana de policarbonato en un plato de formación de imágenes 4 cm de diámetro.
5. Utilizando el lado del bucle de alambre de platino, estirar suavemente la corteza de manera que el lado meníngea está hacia arriba.
6. Levantar el explante cortical de la placa de disección, colocando el explante en el medio del bucle y el uso de las fuerzas hidrostáticas intrínsecas alevantar el explante en una superficie plana.
7. Coloque suavemente el explante en la membrana de policarbonato, y levantar el bucle de alambre de platino de distancia de tal manera que el explante permanece en la membrana en un plano con la superficie ventricular contacta con la membrana.
8. Levante con cuidado la membrana y pipetear 50 L de líquido cefalorraquídeo u otros medios bajo la membrana.
9. Cubra la fuente de imagen, colocarlo en un recipiente secundario humidificado, y se incuba a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante 24 horas para apoyar la proliferación celular y crecimiento de explantes. Figura 2 representa un esquema de la preparación final cortical plato explante.

Resultados

La recolección de LCR debe producir un líquido claro y transparente. No debería haber ninguna evidencia de contaminación de la sangre, como se demuestra por un fluido teñido de color rojo o amarillo en el aspirado y en el tubo Eppendorf. También debe haber evidencia de tejidos en el aspirado y el tubo Eppendorf. Cuando el CSF se centrifuga, se puede también evaluar el CSF microscópicamente para garantizar que no hay contaminación. Si hay signos de contaminación, el LCR debe ser desechada. De una camada ratón ...

Discusión

El método descrito para la recolección de líquido cefalorraquídeo ventricular ha dado muestras relativamente puras de CSF embrionario con la composición de proteína estable y la actividad consistente en una serie de ensayos celulares ^9. Con una técnica buena colección y tamaño de la camada de diez ratones E14.5, se puede esperar para cobrar 10-15 l de LCR y de una camada de ratas E16, se puede esperar para recoger alrededor de 50-90 l de LCR. Esta técnica minimiza la contaminación de recogida de la...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
Wiretrop II agujas capilares	Drummond Scientific	# 5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	# 184 SIL ELAST kit
Aspirador conjunto del tubo	Sigma	# A5177-5EA
Filtro desechable	Venturi o farmacia local	no disponible	Filtro de cigarrillo estándar
Roundstock cuchillo oftálmico (15 cuchillo puñalada grado)	World Precision Instruments, Inc.	# 500250
35mm plato de cristal cultura fondo	MatTek Corp.	# P35G-1.5-14-C
Platino-iridio de alambre	Tritech Investigación	# PT-9010-010-3 pies
Nuclepore Track Etch-membrana	Whatman	# 09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	# SH30031.FS
Tijeras iridectomía	Herramientas Artes Ciencias	# 15000-02