Изоляция цереброспинальной жидкости из грызунов эмбрионов для использования с расчлененный коры головного мозга Экспланты

Резюме

Жидкостью желудочка спинномозговая (CSF) купается нейроэпителиальных и коры головного мозга клеток-предшественников на ранних стадиях развития мозга у зародыша. Здесь мы опишем метод, разработанный, чтобы изолировать желудочка CSF от грызунов эмбрионов разного возраста с целью изучения его биологической функции. Кроме того, мы демонстрируем нашу коры головного мозга рассечение эксплантов и культуры техника, которая позволяет эксплантов роста с минимальными объемами культуральной среды или CSF.

Аннотация

CSF представляет собой сложную жидкость с динамически меняющейся протеома в ходе развития и в зрелом возрасте. Во время эмбрионального развития, зарождающиеся CSF отличается от амниотической жидкости после закрытия передней части нервной трубки. CSF объем увеличивается, то в последующие дни, как нейроэпителиальных клеток-предшественников, выстилающих желудочки и сосудистые сплетения порождают CSF. Эмбриональных контакты CSF апикальной, желудочковой поверхности нервные стволовые клетки развивающегося мозга и спинного мозга. CSF предоставляет важную давление жидкости для расширения развивающегося мозга и распространяет важные факторы роста в нейронных клеток-предшественников в конкретной временной основе. Для исследования функции CSF, важно, чтобы изолировать чистых образцов эмбриональных CSF без загрязнения из крови или тканей развивается конечного мозга. Здесь мы описываем технику с целью изолировать сравнительно чистых образцов желудочка эмбрионального CSF, который может быть использован дляШирокий спектр экспериментальных тестов, включая масс-спектрометрии, электрофореза белков и клеток и первичной культуре эксплантов. Мы демонстрируем, как анализировать и культуры корковых эксплантов на пористых мембран поликарбоната для того, чтобы расти развивающиеся корковой ткани с сокращением объемов средств массовой информации или CSF. С помощью этого метода, эксперименты можно проводить с использованием CSF от разных возрастов и условиях для исследования биологической активности CSF протеома на клетки-мишени.

Введение

CSF представляет собой сложную жидкость, которая омывает развивающихся нейроэпителия ^1-6 и обеспечивает необходимую ⁷ давления и стимуляции роста сигналы для развивающегося мозга ^8-12. Для изучения CSF в течение развития мозга, мы разработали методы, чтобы изолировать желудочка CSF из развивающихся крысы или мыши эмбрионов на разных стадиях развития ^6,9. Предыдущие методы выделения включены использованием стекла микро-иглы и выделения CSF помощью микро-форсунка ^1,2. Наш метод использует стеклянные микро-капиллярной пипетки вершина которого была вытащил для создания ультратонких точкой для улучшения проникновения в ткани. Стеклянные микро-капиллярной пипетки связано с аспиратором, так что коллекция желудочка CSF можно управлять с нежным изменения давления. Для исследования стволовых клеток влияния сигналов CSF, мы проанализируем коры головного мозга эксплантов, разместить их на мембранах из поликарбоната, и они плавали на соответствующих у.е.lture среде с добавлением образцы спинномозговой жидкости ^9. С помощью этой техники, снижение объемов средств массовой информации достаточно для культуры тканей, что позволяет эффективно использовать CSF ^9.

протокол

1. Изоляция эмбриона / Подготовка

Эта техника может быть использована для мыши или крысы. В этом протоколе мы продемонстрируем технику CSF сбора и коры головного мозга рассечение эксплантов головного мозга мышиных эмбриональных. Мы будем комментировать любые важные различия для крыс по сравнению с мышами, которые существуют в рамках общих методов. Для постановки системы эмбрионального возраста, E1 классифицируется как день штекер для крыс, и E0.5 классифицируется как день штекер для мышей.

1. Подготовка микро-рассечение блюдо с Эластомер Sylgard силикона. Sylgard 184 кремнийорганический каучук поставляется в виде двух частей жидкого компонента, части А и В. Часть А и часть В смешивают в соотношении 10:1 по весу или объему. После того, как жидкие компоненты смешивают, заливают Sylgard эластомера в чашку Петри, чтобы покрыть всю поверхность блюда. Некоторые пузырьки воздуха могут присутствовать, что будет рассеиваться во время процесса отверждения. Установите крышку чашки Петри и дайте elastomэ вылечить. Эластомер может быть вылечена при комнатной температуре в течение 24 ч, или при более высокой температуре (например, 37 ° C) для более быстрого отверждения. Как только жидкие компоненты затвердевает, рассечение блюдо готово к использованию. Блюдо можно использовать повторно для нескольких экспериментов, при условии, что она очищается и после процедуры.
2. Подготовка микро-капиллярной пипеткой (иглы). Micro-капиллярные пипетки готовят путем нагрева и вытащить использованием Narishige PC-10 вертикального микропипетки съемник со следующими параметрами: Один шаг тяги; подогревателя № 2 установлен в 58; 100 г тянуть вес. Штрафа кончике микропипетки тщательно отхватили с использованием тонких № 55 пинцета. В результате средний внутренний диаметр иглы 85 мкм.
3. Подготовка аспиратор сборки для аспирации CSF. Вставьте микро-поршень в микро-капиллярные пипетки в капиллярных игл. Кроме того, приложите пластиковые одноразовые фильтр к концу сборки аспиратор трубки, подключенной тO микро-капиллярной пипетки. Введите иглу через прокладку в позицию на противоположном конце аспиратор сборки.
4. Перенос эмбрионов изолированы от помета на микро-рассечение блюдо, приготовленное с Sylgard.
5. Удалить экстра-эмбриональных мембран и тканей так, что эмбрион четко подвергается. Каждый слой ткани первой стенки матки, а затем децидуальной-можно разрезать ножницами с использованием тонких иридэктомия (т.е. изобразительных инструментов науки # 15000-02). На каждом участке имплантации, в первую стенку матки, то децидуальной могут быть врезаны параллельно длинной оси матки и разрез может быть открыт дальнейшее использование тонких щипцов. Децидуальной может быть удален после аналогичного разрез, обнажая плодных оболочек. Следует проявлять осторожность, чтобы плодные оболочки не врезаны или треснут.
6. Промыть стерильной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) и удалите лишнюю жидкость из окружающих эмбрион с помощью пипетки, а также Kimwipe или фильтрбумаги нарезать треугольниками.

2. Коллекция Желудочковая CSF

1. Визуализация эмбриона при вскрытии микроскопом: для мыши, эмбрион следует лежа на боку, так, что один имеет сагиттальный вид развивающегося эмбриона. С крысиных эмбрионов E16 или старше, положение эмбриона на его спинной позвоночника, вдоль его длинной плоской измерение, от головы к хвосту направлении, как если бы эмбрион лежа на спине. Таким образом CSF может быть собрана как из правого и левого бокового желудочка.
2. Стабильно вставить микро-капиллярной пипеткой в ​​боковой желудочек, среднего мозга желудочек, или цистерна, стараясь не связываться с клетками нейроэпителиальных раз пипетки был включен. Для E14.5 эмбрионов мыши или старше, CSF может быть атмосферный от правого желудочка, а затем игла удаляется и вставляется в левом желудочке. Из-за проходимости желудочков и нервной трубки у эмбрионов моложе E14.5,Весь объем CSF часто можно отсасывают из боковых желудочков с одной вставкой иглы. Однако, это не всегда так, как развитие раза и проходимость подключения желудочков могут немного отличаться, и, следовательно, микро-капиллярной пипетки также может быть вставлен в цистерна для сбора максимального объема CSF.
3. После того, микро-капиллярной пипетки вводят в боковой желудочек, среднего мозга желудочек, или цистерна, тщательно и аккуратно начать аспирационных CSF в пипетку, либо с помощью микро-поршень для создания отрицательного давления и аспирации CSF, или путем предоставления нежный отрицательного давления, создаваемого в рот так, что CSF начинает осторожно поступать в микро-капиллярной пипеткой в ​​медленном и контролируемым образом. Мы рекомендуем, чтобы зритель проверяет свои собственные местные власти в институциональной политики в этих подходах.
4. Продолжать применять отрицательное давление и собирать CSF в микро-капиллярной пипетки.В обоих мыши и крысы эмбрионов E16.5/E17 или моложе, можно наблюдать крах желудочка слегка появление дерн формирования на стороне головы, что микро-капиллярной пипетки дюйма В старых эмбрионов, в связи с большим размером головного мозга, оно не может быть возможным наблюдать голову рушится.
5. Остановить применяя давление и аккуратно удалить микро-капиллярной пипеткой из бокового желудочка.
6. Аккуратно изгнать образца СМЖ в пробирку Эппендорф, который был охлажденным на льду.
7. Продолжайте собирать CSF из всего помета животных и бассейном образцов в той же трубе.
8. Центрифуга на 10000 мкг при 4 ° С в течение 10 мин, чтобы удалить загрязнения клетками.
9. Анализ образцов на предмет загрязнения нейроэпителиальные клетки или эритроциты. Признаки загрязнения, как правило, указывается жидкости появляются мутные или красный / розовый, или наличие гранул с оттенком пятно крови. После центрифугирования CSF может быть проанализирована под микроскопом никаких доказательств клеток или клеточного мусора. Если имеются признаки загрязнения жидкости следует выбросить. В качестве дополнительного контроля, содержание гранулы также могут быть окрашены для клеток. Чистые образцы спинномозговой жидкости может быть использована для культуры клеток, корковое культуры, спектрометрии, вестерн-блот, ИФА и другие анализы. Ясно CSF должны быть переведены на новую стерильную пробирку Эппендорф. Образец теперь может быть использована для анализа, объединенные с другими образцами, или замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Замораживания и оттаивания небольших образцов жидкости может привести к небольшому уменьшению объема и изменения в концентрации белка. Этого можно избежать путем сублимационной сушки образцов.

3. Кортикальные Dissection эксплантов

1. Передача E14.5 эмбрионов изолированы от помета на микро-рассечение блюдо, приготовленное с Sylgard.
2. Удалить эмбриона от экстра-эмбриональных мембран и тканей, как описано в шаге 1.5.
3. Wash стерильной Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS) и удалите лишнюю жидкость из окружающих эмбрион с помощью пипетки.
4. Проанализируйте через шейного отдела отделения головы от остальной части эмбриона (рис. 1А).
5. Использование тонких скальпелем (глазной нож), сократить средней линии головы. Возьмите каждую сторону этот разрез с мелкими щипцами и удалить кожу. Затем с помощью ножниц иридэктомия, чтобы сделать разрез, который проходит вдоль срединной линии развивающегося черепа. Впоследствии, сделать два дополнительных разрезов, примерно 1/3 расстояния от переднего и заднего концов развивающихся черепа. Используйте тонкий пинцет, чтобы понять "закрылки" черепа, которые являются результатом этой части рассечения и удаления развивающихся черепа ткань, подвергая кору (рис. 1б).
6. Использование скальпеля пополам мозга по средней линии в середине сагиттальной плоскости, разделяющей правое и левое полушария корковых (рис.1B, C). Мягкой и паутинной остались прикреплены к коре, и твердой мозговой оболочкой удаляется вместе с развивающимися черепа.
7. Подготовка каждого коркового полушария отдельно. Поместите полушарии медиальной стороны так, что вы можете увидеть ганглиозных возвышения и развивающихся коры (рис. 1C, D).
8. Использование скальпеля, чтобы коронарного разреза через корковые нейроэпителия каудально по отношению к развивающимся обонятельной луковицы. Этот разрез должно начинаться на передней границе латеральной и медиальной ганглиозных возвышения, и проходят через переднюю поясную область развивающегося зачатка корковых (рис. 1E).
9. Сделайте еще ​​один коронарного разреза только каудально по отношению к заднему границе бокового ганглиозных возвышения (рис. 1F). Этот разрез должны также распространяться от боковой границы ганглиозных возвышения до медиальной стенки развивающихся корковых зачатков.
10. Уберите корковой "лоскут" CREAТед двумя разрезы, сделанные в шагах 3.7 и 3.8, с помощью скальпеля или мягкое давление от потока HBSS поставляется с 200 мкл пипетки, чтобы избежать механических повреждений коры головного мозга. Затем сделайте поперечный разрез вдоль границы, разделяющей боковой ганглиозных возвышение из развивающихся коры (рис. 1G, H). Затем рассекают от развивающихся гиппокампе и корковых краю медиальной конечного мозга, на вершине коры головного мозга, где боковые поверхности коры отвечает межполушарной стены.
11. Сделайте поперечный надрез вдоль границы, разделяющей боковой ганглиозных возвышение из развивающихся коры (рис. 1H).
12. Извлеките все дополнительные расчлененный ткани, которая находится на Sylgard пластину с расчлененным корковых эксплантов. Можно использовать осторожным пипетированием со свежим буфером HBSS в пипетировать от каких-либо дополнительных расчлененный ткани. Расчлененный коры в настоящее время с менингеальные стороной вниз (рис. 1Е).

4. Передача корковых эксплантов

1. Подготовка цикла платиновой проволоки подключены к стеклянной пипетки. Нагрейте стеклянной пипетки со сложенным платиновой проволоки вставляется в конец стеклянной пипетки. По скручивания конце цикла платиновой проволоки, размер петли могут быть увеличены или уменьшены, и цикл может быть сформирована в соответствии с размером эксплантата лучшего. (Это может быть подготовлена ​​заранее и использовать повторно.)
2. Нагрейте конце платиновой проволоки для стерилизации цикла.
3. Изолировать расчлененный эксплантов корковых и удалить лишние средства массовой информации HBSS осторожным пипетированием, оставляя небольшое количество для использования с проволочной петлей.
4. Поместите 1 см поликарбоната мембраны в 4 см блюдо изображений диаметра.
5. Использование стороне петли платиновой проволоки, осторожно переверните коры, так что менингеальные стороной вверх.
6. Поднимите корковых эксплантов от рассечение блюдо, поместив эксплантов в середине цикла и использование внутренних сил гидростатического кподнять эксплантов на плоской поверхности.
7. Аккуратно поместите эксплантов на мембрану из поликарбоната, и снять цикл платиновой проволоки далеко, что эксплантов остается на мембраны на плоской поверхности с желудочковой поверхности контакта с мембраной.
8. Аккуратно поднимите мембраны и 50 мкл спинномозговой жидкости или других средств массовой информации под мембраной.
9. Накройте блюдо изображения, поместите его в увлажненном вторичный контейнер, и инкубировать при 37 ° С в 5% СО ₂ в течение 24 часов, чтобы поддерживать продолжение клеточной пролиферации и эксплантов роста. Рисунке 2 представлена ​​схема окончательной подготовки корковых блюдо эксплантов.

Результаты

Коллекция CSF должно дать четкую, прозрачную жидкость. Там должно быть никаких признаков заражения через кровь, как показано красным или желтым оттенком жидкость в аспирата и в трубке Эппендорф. Там также должны быть доказательства ткани в аспирата и Eppendorf трубки. Когда CSF центрифугируют...

Обсуждение

Описанный метод сбора желудочка CSF дала относительно чистых образцов эмбриональных CSF со стабильным составом белков и последовательную деятельность в ряде клеточных анализов ^9. С хорошей техникой сбора и размер помета из десяти E14.5 мышей, можно ожидать, собрать 10-15 мкл спинномозг?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Wiretrop II капиллярных игл	Драммонд Научные	# 5-000-2020
Sylgard	Ellsworth клеи	# 184 SIL ELAST комплект
Аспиратор трубка в сборе	Сигма	# A5177-5EA
Одноразовый фильтр	Venturi или местной аптеке	недоступный	Стандартный сигареты с фильтром
Roundstock Офтальмология нож (15 градусов ударом ножа)	Всемирный Precision Instruments, Inc	# 500250
35 мм со стеклянным дном блюдо культуры	Маттек корпорации	# P35G-1.5-14-C
Платины и иридия провод	Tritech исследований	# PT-9010-010-3FT
Nuclepore трек-Etch мембранные	Ватман	# 09-300-57
Хэнкс сбалансированный солевой раствор	Fisher Scientific	# SH30031.FS
Иридэктомия ножницы	Средства изобразительных наук	# 15000-02