Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu

Özet

Ventrikül beyin omurilik sıvısı (BOS) embriyo erken beyin gelişimi sırasında nöroepitelyal ve serebral kortikal progenitör hücreler banyoları. Burada biyolojik işlevini araştırmak amacıyla farklı yaşlardaki kemirgen embriyolardan ventriküler BOS yalıtmak için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim serebral kortikal eksplant diseksiyonu ve kültür ortamı veya BOS minimum hacimlerde eksplant büyüme sağlar kültürü tekniği göstermek.

Özet

BOS gelişimi boyunca ve yetişkinlikte dinamik değişen proteom karmaşık bir sıvıdır. Embriyonik gelişim sırasında, doğmakta olan BOS anterior nöral tüpün kapanması üzerine amniyotik sıvıdan ayırır. BOS hacmini sonra ventriküller ve koroid pleksus oluşturmak BOS astar nöroepitelyal progenitör hücreler olarak izleyen gün boyunca artar. Gelişmekte olan beyin ve omurilik nöral kök hücrelerin embriyonik BOS kişileri apikal, ventriküler yüzeyi. BOS gelişmekte olan beynin genişlemesi için hayati sıvı basıncı sağlar ve zamansal özgü şekilde nöral progenitör hücrelere faktörleri teşvik önemli bir büyüme dağıtır. BOS fonksiyonunu incelemek için, kan veya gelişmekte telencephalic dokudan kirlenme olmadan embriyonik BOS saf örnekleri izole etmek için önemlidir. Burada kullanılabilecek ventriküler embriyonik CSF nispeten saf örnekleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadırkütle spektrometrisi, protein elektroforezi, ve birincil hücre ve eksplant kültürünü içeren deneysel testler geniş bir yelpazede. Biz medya veya BOS azaltılmış hacimli gelişen kortikal dokusunun büyümesi için gözenekli polikarbonat membran kortikal eksplantlar teşrih ve kültür nasıl gösterilmektedir. Bu yöntem ile, deneyler, hedef hücreler üzerindeki CSF proteom biyolojik aktivitesini incelemek için çeşitli yaşlardan itibaren CSF ya da koşullar kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Giriş

BOS gelişmekte nöroepitelyumda ^1-6 banyoları ve gelişmekte olan beyinde ^8-12 için ipuçları teşvik gerekli basıncı ⁷ ve büyüme sağlayan karmaşık bir sıvıdır. Beyin gelişimi boyunca BOS incelenmesi, biz geliştirme ^6,9 çeşitli aşamalarında sıçan veya fare embriyoları gelişmekte ventriküler BOS yalıtmak için teknikler geliştirildi. Izolasyon Önceki yöntemler cam mikro-iğne kullanarak ve bir mikro-enjektör ^1,2 kullanarak BOS izole dahil. Bizim yöntem, ucu gelişmiş doku penetrasyonu için ultra ince noktası oluşturmak için çekilmiş olan bir cam mikro-kapiller pipet kullanır. Ventriküler CSF toplama basınç hafif değişiklikleri ile kontrol edilebilir, böylece cam mikro-kapiler pipet bir aspiratör ile bağlanır. BOS sinyal kök hücre etkilerini araştırmak için, biz, serebral kortikal eksplantlar teşrih polikarbonat membran üzerine koyun ve uygun cu bunları yüzenLTURE orta CSF numuneleri ⁹ ile desteklenmiş. Bu teknik sayesinde, medya hacimlerinde BOS ⁹ etkin kullanımı için izin, kültür dokusu için yeterlidir.

Protokol

1. Embriyo İzolasyon / Hazırlık

Bu teknik, fare ya da sıçan için de kullanılabilir. Bu protokolü biz BOS toplama tekniği ve fare embriyonik beyin kortikal eksplant diseksiyonu göstermektedir. Biz sıçanlarda karşı genel teknikler içinde var fareler için herhangi bir önemli farklar hakkında görüş bildirir. Embriyonik yaş evreleme sistemi için, E1 fareler için fiş günü olarak sınıflandırılır ve E0.5 fareler için fiş günü olarak sınıflandırılır.

1. Sylgard Silikon Elastomer bir mikro-diseksiyon çanak hazırlayın. Sylgard 184 Silikon Elastomer A ve Bölüm B Kısım A ve Kısım B ağırlıkça veya hacimce 10:1 oranında karıştırılmaktadır iki bileşenli sıvı bileşen, Bölüm olarak verilir. Sıvı komponent karıştırıldıktan sonra, yemeğin tüm yüzeyini kapsayacak şekilde bir Petri kabı içine Sylgard elastomer dökün. Bazı hava kabarcıkları kür işlemi sırasında dağılacaktır mevcut olabilir. Üzerine Petri kabı kapağı yerleştirin ve elastom iziner tedavi. Elastomer 24 saat için oda sıcaklığında tedavi ya da daha hızlı sertleşmesi için daha yüksek bir sıcaklıkta (ör. 37 ° C). Edilebilir Bileşenlerin sıvı katılaşmaya sonra, diseksiyon çanak kullanıma hazırdır. Çanak prosedürü izleyerek de temizlenmiş olması koşuluyla, birden çok deneme için tekrar tekrar kullanılabilir.
2. Mikro-kapiller pipet (iğne) hazırlanması. Mikro-kapiller pipetler ısı uygulanarak hazırlanmış ve aşağıdaki ayarları ile bir Narishige PC-10 dikey mikropipet çektirmenin kullanarak çekme vardır: Bir adım çekme; Isıtıcı # 2 58 olarak ayarlanır; 100 g çekme ağırlığı. Mikropipet ince ucu titizlikle 55. forseps kullanılarak kapalı tersledi edilmektedir. İğnenin edilen ortalama iç çapı 85 mikron.
3. BOS aspirasyon için aspiratör montaj hazırlayın. Mikro-piston kılcal iğne içine mikro-kapiller pipetler ile sağlanan yerleştirin. Alternatif olarak, t bağlı aspiratör boru montaj sonuna kadar bir plastik tek kullanımlık filtre takınmikro-kapiller pipet o. Aspiratör montaj zıt ucunda pozisyon içine conta içerisinden iğne itin.
4. Çöp gelen Sylgard hazırlanan mikro diseksiyon çanak izole embriyo transfer.
5. Embriyo açıkça maruz böylece ekstra embriyonik membranlar ve dokuların çıkarın. Her doku tabakası-ilk rahim duvarına ve sonra desidua-can ince iridektomi makas (yani Güzel Bilim Araçları # 15000-02) ile disseke edilebilir. Her bir implantasyon yerinde, birinci rahim duvarına, daha sonra desidua rahim uzun eksenine paralel olarak çizilmiş edilebilir ve kesik sonra ince forseps kullanılarak daha fazla açılabilir. Desidua fetal membranlar açığa benzer bir insizyon sonrası kaldırılabilir. Bakım fetal membranlar kazınmış veya delinmiş değil böylece olunmalıdır.
6. Steril Hanks dengeli tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın ve bir pipet gibi bir Kimwipe veya filtre kullanarak çevreleyen embriyo aşırı sıvı kaldırmakkağıt üçgenler halinde doğrayın.

2. Ventriküler BOS Koleksiyonu

1. Diseksiyon mikroskobu altında embriyo görselleştirin: fare, embriyo tek gelişen embriyonun sagittal bir görünümü vardır öyle ki, yan döşeme olmalıdır. Embriyonun sırtında yatıyor gibi sıçan embriyolarında E16 veya yaşlı ile, kaudal yönde bir kranial gelen, onun uzun düzlemsel boyut boyunca, onun dorsal spinal kolonda embriyo yerleştirin. Bu şekilde BOS sağ ve sol lateral ventrikül alınabilir.
2. Mütemadiyen pipet takıldıktan sonra nöroepitelyal hücrelerin temas etmeyecek çalışırken, lateral ventrikül, mezensefalik ventrikül veya sisterna magna içine mikro-kapiller pipet takın. Fare embriyo E14.5 veya daha büyük için, CSF sağ ventrikül aspire ve sonra iğne çıkarılır ve sol ventrikül içine eklenebilir. Embriyolarında ventriküller ve nöral tüp açıklığı nedeniyle genç E14.5 daha,Tüm BOS hacmini genellikle tek bir iğne ile lateral ventriküllerin aspire edilebilir. Bağlantı ventriküllerin gelişim süresi ve açıklık değişebilir ve bu nedenle, mikro-kapiler pipet da azami CSF hacim toplamak için sisterna magna içine eklenebilir Ancak, bu her zaman bir durum değildir.
3. Mikro-kapiller pipet dikkatle, lateral ventrikül, mezensefalik ventrikül veya sisterna magna içine yerleştirilir ve nazikçe negatif basınç oluşturmak ve BOS aspire ya mikro-piston kullanılarak, pipet içine BOS aspire başlar sonra, ya da bir sağlayarak BOS hafifçe yavaş ve kontrollü bir şekilde mikro-kapiller pipet akmaya başlar böyle ağız tarafından oluşturulan hafif negatif basınç. Biz izleyicinin bu yaklaşımlara kurumsal politikalar konusunda kendi yerel yetkililerle denetler öneririz.
4. Negatif basınç uygulamak ve mikro-kapiller pipet içine BOS toplamak için devam edin.E16.5/E17 veya genç fare ve sıçan embriyolarında hem de, bu mikro-kapiller pipet Büyük embriyo içeri olduğu baş tarafında oluşturan bir çimen ve görünümünü biraz ventriküle çöküşü gözlemlemek mümkündür Beynin daha büyük bir boyuta bağlı olarak, başın çöken gözlemlemek mümkün olmayabilir.
5. Basınç uygulayarak durdurun ve hafifçe lateral ventrikülden mikro-kapiller pipet çıkarın.
6. Yavaşça buz üzerinde soğutulmuş olan bir Eppendorf tüp içine BOS örneği sınırdışı.
7. Bütün bir hayvan çöp toplama dan CSF devam eder ve aynı tüp içine örnekleri havuzda.
8. Kontamine hücreleri çıkarmak için 10 dakika süreyle 4 ° C'de 10,000 x g'de santrifüjleyin.
9. Nöroepitelyal hücrelerin veya kırmızı kan hücreleri kirletici herhangi bir işaret için numuneler analiz. Kirlenme belirtileri genellikle bulanık ya da pembe / kırmızı görünen sıvı veya kan hafif boyanmış nokta ile bir pelet varlığı ile gösterilir. Santrifüjlemeden sonra, CSF hücreleri veya hücresel enkaz herhangi bir kanıt için mikroskopik analiz edilebilir. Kirlenme bulguları varsa akışkan atılmalıdır. İlave bir kontrol olarak, pelet içerik ayrıca hücreleri için kirlenmiş olabilir. Temiz bir CSF numune hücre kültürü, kortikal kültürü, spektrometresi, Western blot, ELISA, ve diğer deneyleri için de kullanılabilir. Açık CSF, yeni bir steril Eppendorf tüpüne aktarılmış olması gerekmektedir. Örnek hemen sıvı nitrojen ile dondurulmuş diğer örnekleri, veya ek ile toplanmış ve -80 ° C'de saklanır, analiz için kullanılabilir Sıvı küçük numunelerin dondurma ve çözme küçük bir hacim azalması ve protein konsantrasyonu değişikliklere neden olabilir. Bu örneklerin dondurarak kurutma ile önlenebilir.

3. Kortikal Eksplantasyon Diseksiyon

1. Sylgard hazırlanan mikro diseksiyon çanak üzerine çöp izole E14.5 embriyo transfer.
2. Adım 1.5 açıklandığı gibi ekstra embriyonik membranlar ve dokulardan embriyo çıkarın.
Yıkama.
3. Embriyo geri kalanı (Şekil 1A) itibaren baş ayıran servikal bölgeye teşrih.
4. Ince bir neşter (oftalmik bıçak) kullanarak, kafa derisi midline kısmak. Ince forseps ile bu kesi her iki tarafında tutun ve cilt kaldırmak. Sonraki, gelişmekte olan kafatası orta hat uzunluğu çalışan bir kesi yapmak için iridektomi makas kullanın. Daha sonra, gelişmekte olan kafatasının ön ve arka uçlarındaki iki ek kesiler, mesafe yaklaşık 1/3 yapmak. Kafatası "flap" kavramak için ince forseps kullanın diseksiyon bu bölümü sonucu ve korteks (Şekil 1B) açığa gelişmekte kafatası doku kaldırmak.
5. Sağ ve sol kortikal hemisferlerin (Şekil ayıran, orta sagital düzlemde orta hat boyunca neşter kenarortay beyin kullanma1B, C). Pia ve araknoid korteks bağlı kalır ve dura gelişen kafatası ile birlikte uzaklaştırılır.
6. Ayrı ayrı kortikal yarımkürede hazırlayın. Kadar böylece ganglionik eminens ve gelişmekte olan korteks (Şekil 1C, D) görebilirsiniz yarımkürede medial tarafı yerleştirin.
7. Neşter kullanarak, gelişmekte olan koku ampul için kaudal kortikal nöroepitelyumda aracılığıyla bir koronal kesi yapmak. Bu kesi lateral ve medial ganglionik Efendiler ön sınırında başlar ve gelişmekte olan kortikal yitiren organ (Şekil 1E) ve anterior singulat bölge boyunca uzanmalıdır.
8. Lateral ganglionik eminens (Şekil 1F) ve posterior sınırına sadece kaudal bir koronal kesi olun. Bu kesi aynı zamanda gelişmekte olan kortikal yitiren organ medial duvarına ganglionik eminens lateral sınır kadar uzanmalıdır.
9. Kortikal "flap" Crea geri çekinkortekse mekanik hasar görmesini önlemek için 200 ul pipet ile teslim HBSS bir akışından bir neşter veya hafif basınç kullanarak, adımları 3.7 ve 3.8 'de yapılan iki kesiler ile ted. Daha sonra gelişen korteks (Şekil 1G, H) dan yanal ganglionik eminensinden ayıran sınır boyunca bir enine kesik yapmak. Daha sonra, yan yüzeyin kortikal duvar kürelerinin uygun neokorteks tepesinde, gelişmekte olan hipokampus ve medial telencephalon kortikal uzak kenar teşrih.
10. Gelişmekte olan korteks (Şekil 1H) gelen yanal ganglionik eminens ayıran sınır boyunca bir transvers kesi olun.
11. Disseke kortikal eksplant gelen Sylgard plaka üzerinde herhangi bir ekstra disseke doku çıkarın. Bir herhangi bir ekstra disseke doku uzakta Pipeti taze HBSS tamponu ile yumuşak pipetleme kullanabilirsiniz. Disseke korteks aşağı bakacak meningeal tarafında (Şekil 1I) ile şimdi.

4. Kortikal Eksplantın aktarılması

1. Bir cam pipet bağlı bir platin tel döngü hazırlayın. Cam pipet sonuna yerleştirilmiş, katlanmış bir platin tel ile cam pipet ısıtın. Platin tel döngü sonuna bükerek, döngünün boyutu artmış ya da azalmış ve döngü istenilen eksplant sığacak şekilde şekillendirilebilir edilebilir. (Bu önceden hazırlanmış ve yeniden kullanılabilir.)
2. Döngü sterilize platin tel ucunu ısıtın.
3. Disseke kortikal eksplant yalıtmak ve tel döngü ile kullanmak için küçük bir miktar bırakarak, yumuşak pipetleme tarafından ekstra HBSS ortamı çıkarın.
4. 4 cm çapa görüntüleme tabak içinde bir 1 cm polikarbonat membran yerleştirin.
5. Meningeal tarafı yukarı bakacak şekilde platin tel döngü tarafı kullanarak, yavaşça korteks çevirin.
6. Döngünün ortasında eksplant yerleştirerek ve içsel hidrostatik kuvvetler kullanarak, diseksiyon çanak kapalı kortikal eksplant kaldırındüz bir düzlem üzerinde eksplant kaldırın.
7. Yavaşça polikarbonat membran üzerindeki eksplant yerleştirin ve uzak eksplant ventriküler yüzeyi membran ile temas halindeyken düz bir düzlem üzerinde membran kalır böyle platin tel döngü kaldırın.
8. Yavaşça membran kaldırın ve membran altında CSF veya diğer medya 50 ul Pipeti.
9. Görüntüleme çanak Kapak, sürekli hücre çoğalması ve eksplant büyümeyi desteklemek için 24 saat süreyle% 5 CO ₂ nemlendirilmiş bir ikincil bir kaba koyun ve 37 ° C'de inkübe edin. Şekil 2 final kortikal eksplant yemeğin hazırlanması şematik resmediyor.

Sonuçlar

BOS koleksiyonu açık, şeffaf sıvı boyun eğmek zorundadır. Aspirasyon ve Eppendorf tüp bir kırmızı veya sarı renklendirilmiş akışkan tarafından gösterildiği gibi, kandan kirlenme hiçbir kanıt olmamalıdır. Ayrıca aspirat ve Eppendorf tüp dokusunun hiçbir kanıt olmamalıdır. BOS santrifüj edildiğinde, bir de herhangi bir kirlenme olduğunu sağlamak için mikroskobik BOS değerlendirir. Kontaminasyon belirtileri varsa, BOS atılmalıdır. Biri E14.5 fare çöp bakıldığında biri 10-15 ul BOS...

Tartışmalar

Ventriküler CSF toplama için açıklanan yönteme hücresel analizler ⁹ Bir dizi protein kararlı kompozisyon ve etkinlik ile tutarlı embriyonik CSF nispeten saf örnekleri vermiştir. İyi bir toplama tekniği ve on E14.5 fare DKBKS ile, bir BOS 10-15 ul toplamak için bekleyebilirsiniz ve E16 sıçan bir çöp gelen bir BOS 50-90 ul hakkında toplamak için bekleyebilirsiniz. Bu toplama tekniği dikkatli gözlem, santrifüj, ve hücresel enkaz veya kan renklendirmek herhangi bir kanıt ile numunelerin at...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Wiretrop II kılcal iğneler	Drummond Bilimsel	# 5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Yapıştırıcılar	# 184 SIL ELAST kiti
Aspiratör tüp montajı	Sigma	# A5177-5EA
Tek filtresi	Venturi veya yerel eczane	mevcut değil	Standart sigara filtresi
Roundstock oftalmik bıçağı (15 derece bıçak bıçak)	Dünya Precision Instruments, Inc	# 500250
35mm cam dipli kültür çanak	Mattek Corp	# P35G-1.5-14-C
Platin-iridyum tel	TriTech Araştırma	# PT-9010-010-3ft
Nuclepore Parça-Etch Membran	Whatman	# 09-300-57
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi	Fisher Scientific	# SH30031.FS
İridektomi Makas	Güzel Bilim Araçları	# 15000-02