Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

Resumen

Hemos diseñado un nuevo biorreactor de carga mecánica que se puede aplicar tensión mecánica uniaxial o biaxial a un biocompuesto cartílago antes del trasplante en un defecto de cartílago articular.

Resumen

Hemos diseñado un dispositivo de carga que es capaz de aplicar una tensión mecánica uniaxial o biaxial a un tejido biocomposites de ingeniería fabricados para el trasplante. Mientras que el dispositivo funciona principalmente como un biorreactor que imita las cepas nativas mecánicos, sino que también está equipado con una célula de carga para proporcionar retroalimentación de fuerza o pruebas mecánicas de los constructos. Los sujetos de dispositivos diseñados construcciones cartílago a cargas mecánicas biaxial con gran precisión de la dosis de carga (amplitud y frecuencia) y es lo suficientemente compacto como para caber en un cultivo de tejidos incubadora estándar. Se carga muestras directamente en una placa de cultivo de tejidos, y múltiples tamaños de placa son compatibles con el sistema. El dispositivo ha sido diseñado utilizando componentes fabricados para aplicaciones de láser de precisión guiadas. Carga biaxial se lleva a cabo por dos fases ortogonales. Las etapas tienen un rango de desplazamiento de 50 mm y se conducen de forma independiente por actuadores de motor paso a paso, controlados porun controlador de bucle cerrado del motor paso a paso que dispone de capacidades de micro paso a paso, lo que permite tamaños de paso de menos de 50 nm. Un polisulfona carga plato se acopla a la plataforma en movimiento biaxial. Los movimientos de las etapas están controladas por Thor-labs software Tecnología Avanzada de Posicionamiento (APT). El controlador de motor paso a paso se utiliza con el software para ajustar los parámetros de carga de frecuencia y amplitud tanto de cizallamiento y compresión de forma independiente y simultánea. Retroalimentación posicional es proporcionado por codificadores ópticos lineales que tienen una repetibilidad bidireccional de 0,1 micras y una resolución de 20 nm, que se traduce en una precisión posicional de menos de 3 micras más de la plena 50 mm de recorrido. Estos encoders proporcionan la retroalimentación de la posición necesaria para la electrónica de guía para garantizar verdaderas capacidades nanopositioning. A fin de proporcionar la retroalimentación de fuerza para detectar y evaluar las respuestas de contacto de carga, una célula de carga en miniatura de precisión se coloca entre el rodillo de carga y el Movinplataforma de g. La célula de carga tiene altas precisiones de 0.15% a 0.25% de la escala completa.

Introducción

Hemos diseñado un biorreactor de carga que es capaz de aplicar una tensión mecánica uniaxial o biaxial a un tejido biocomposites de ingeniería fabricados para el trasplante. Este dispositivo está diseñado principalmente como un biorreactor para los reemplazos de ingeniería de cartílago articular, sino que también podría ser utilizado para otros tejidos de soporte de carga en el cuerpo humano. Nuestra motivación en este diseño de bioreactor se deriva de Drachman y Sokoloff ^1, que hizo la observación fundamental de la formación anormal del cartílago articular en embriones de pollo paralizadas debido a la falta de movimiento. Del mismo modo, el ejercicio físico es esencial para el desarrollo normal de los músculos y de los huesos. De acuerdo con este concepto, muchos grupos de investigación han estudiado cómo los diferentes modos de estímulos físicos durante el cultivo in vitro modula las propiedades bioquímicas y mecánicas de biocomposites células biomateriales y explantes tisulares ^2-7. El concepto de ingeniería de tejidos funcionalesimplica el uso in vitro de los estímulos mecánicos para mejorar las propiedades funcionales de los tejidos, es decir, las propiedades mecánicas que permiten que el tejido para soportar la espera en el estrés y la tensión in vivo ^8,9. Numerosos estudios reportan el uso de carga mecánica en términos de esfuerzo cortante y compresión para estimular cartilaginosas construcciones de ingeniería para uniones articulares. Mauck et. Al ¹⁰ sugieren que la carga mecánica por sí sola puede inducir condrogénesis de células madre mesenquimales, incluso en ausencia de factores de crecimiento que se consideran vitales. Aplicación de carga mecánica intermitente tales como la compresión o cizalladura durante el cultivo de tejidos se ha demostrado que modulan la formación de hueso y cartílago, sin embargo, la dosimetría óptima de la carga difiere con las propiedades del tejido celular y ^11.

La función más importante del cartílago articular es la capacidad de soportar fuerzas de compresión y de cizallamiento dentro dela articulación, por lo tanto, tiene que tener una alta compresión y módulos de cizallamiento. La falta de resistencia mecánica y funcional ultraestructura fisiológica en el cartílago de ingeniería ha dado lugar a la ruptura sobre el neo-cartílago in vivo y el fracaso de las estrategias de sustitución de cartílago en las articulaciones. Aunque la compresión y cizallamiento se han demostrado comúnmente para modular y mejorar la resistencia mecánica de biocomposites cartílago articular, un enfoque de combinación es rara ^6,12-15. Wartella y Wayne ¹⁶ diseñaron un biorreactor que aplica tensión y la compresión para producir reemplazos de cartílago del menisco. Waldman et al. ¹⁵ diseñado un dispositivo para aplicar una compresión y cizallamiento a los condrocitos cultivados en un sustrato de polifosfato de calcio poroso. . Bian et al ¹⁷ demostró propiedades mecánicas del cartílago nativo que coincidan con el cultivo in vitro de los condrocitos caninos adultos en geles y aplicación de mecanismos biaxialmecánicos de carga (compresión deformacional carga y deslizamiento de carga de contacto).

El biorreactor carga mecánica biaxial fue diseñado originalmente por Danielle Chu en nuestro laboratorio con el objetivo general para inducir adaptaciones morfológicas en el tejido del cartílago ingeniería construye resulta en mayores módulos de compresión y cizallamiento que en la actualidad dispone de ^18. Creemos que esta investigación se incrementará significativamente nuestra comprensión más amplia de cómo mechanotransduction puede ser modulada para diseñar tejidos clínicamente relevantes.

Protocolo

1. Biaxial Cargando biorreactor de Diseño

1. El biorreactor emplea dos etapas fabricados por Thor-laboratorios (Newton, MA) para las aplicaciones de láser guiado de precisión para la aplicación de una tensión mecánica uniaxial o biaxial para la ingeniería de tejidos, con gran precisión de la dosis de carga (amplitud y frecuencia) y la aplicación a una amplia variedad de las condiciones de cultivo de tejido de un solo a placas de 24 pocillos (Figura 1).
2. Carga biaxial se lleva a cabo por dos etapas Travelmax (LNR50SE). Estas etapas están montados ortogonalmente en una configuración XZ. La etapa de cizallamiento horizontal proporciona movimientos dinámicos mediante la oscilación a lo largo del eje-X. La etapa vertical, proporciona una carga de compresión dinámica mediante la oscilación a lo largo del eje Z. Estas etapas tienen un rango de recorrido 50 mm y son accionados independientemente por actuadores de motor paso a paso (DRV014), controlados por un controlador de motor paso a paso de bucle cerrado (BSC102) que presenta capacidades de micro paso a paso, lo que permite tamaños de paso de menos de50 nm.
3. El dispositivo se monta en un rígidos 25 cm x 30 cm x 12,5 mm de la placa de base de aluminio que se utiliza como una plataforma para el montaje de componentes de la máquina y para el montaje de placas de cultivo de tejidos. Paradas cinemáticas ajustables se utilizan para fijar las placas de cultivo de tejidos en su lugar en la placa base de aluminio. Estas paradas cinemáticas tienen tornillos de ajuste fino para permitir una alineación precisa que no es de otro modo alcanzable con la mano. El diseño modular de la placa de base permite una colocación flexible de estas paradas cinemáticas para acomodar placas de diferentes tamaños y formas (placas de Petri vs placas de múltiples pocillos).
4. Una costumbre-mecanizada polisulfona carga plato se acopla a la plataforma en movimiento biaxial a través de un soporte de ángulo recto con maquinado de precisión. Material de polisulfona fue elegido debido a su biocompatibilidad, facilidad de mecanizado, y la facilidad de esterilización.
5. Los movimientos de las etapas están controladas por software de la tecnología de posicionamiento avanzado Thor-labs '(APT). El controlador de motor paso a paso es nosotrosed en combinación con el software que permite el ajuste de los parámetros de carga de la frecuencia y la amplitud de tanto cizallamiento y compresión de forma independiente y simultánea.
6. Retroalimentación posicional es proporcionado por codificadores ópticos lineales que están unidos a cada plataforma móvil y están integrados con el software. El sistema codificador tiene una repetibilidad bidireccional de 0,1 micras y una resolución de 20 nm, que se traduce en una precisión posicional de menos de 3 micras más de la totalidad de 50 mm de recorrido. Estos encoders proporcionan la retroalimentación de la posición necesaria para la electrónica de guía para asegurar verdaderas capacidades nanopositioning y una lectura directa de la posición absoluta.
7. Con el fin de proporcionar la regeneración de la fuerza necesaria para detectar el contacto entre el rodillo y las muestras y evaluar las respuestas de carga, una célula de carga en miniatura de precisión (Honeywell Modelo 31) está situada entre la placa de carga y la plataforma móvil (Figura 2). La célula de carga tiene altas precisiones de0,15% al ​​0,25% de la escala completa. La unidad de visualización (SC500) para la célula de carga también puede proporcionar mediciones de carga de hasta 5 cifras decimales. Además, cuenta con un puerto RS-232 para permitir la recolección de datos en un ordenador.

2. Sembrado de células agarosa Construcciones

1. Preparar 4% de agarosa: Añadir 0,8 g de agarosa a 20 ml de DMEM (sin aditivos) en un matraz de 50 ml, ebullición, y luego mantener a 70 ° C en horno hasta su uso.
2. Ajustar el volumen de la suspensión celular para la cantidad doble de la densidad de la siembra de células deseada. Esta suspensión se mezcla con un volumen igual de 4% w / v de agarosa para crear un gel de agarosa al 2% en la densidad de siembra deseada.
3. Coloque tanto la suspensión de células y una pipeta de 10 ml en la incubadora.
4. Establecer sistema de colada de gel. Un 1,5 mm y una placa de separación 0,75 mm se debe poner juntos para crear un gel espeso 2,25 mm. Otros tamaño de placas espaciadoras pueden ser utilizados para crear diferentes grosores de gel. El sistema de colada de gel no es lo suficientemente grande como para albergar estas placas togetella, por lo que debe estar bien pegado para evitar fugas.
5. El siguiente paso es mezclar rápidamente la suspensión de células con la agarosa y la pipeta previamente preparada en el molde antes de que el gel de agarosa se solidifica. Retire el líquido de agarosa del horno y colocar un termómetro estéril en ella. La agarosa debe enfriar a 42-43 ° C antes de mezclar con las células. Calentar la suspensión celular a 37 º C. Una vez que la agarosa se realiza 43 ° C, pipeta rápidamente la cantidad deseada y luego pipeta de inmediato la suspensión de células hacia arriba y abajo varias veces para mezclar. A continuación pipetear inmediatamente toda la mezcla en el molde de gel.
6. Deje que el gel se solidifique durante 10-15 minutos y luego incline con cuidado a una posición horizontal.
7. Retire la placa superior de cristal y los discos de perforación con la biopsia por punción. Los discos pueden ser recogidos con una pequeña espátula estéril. En nuestra experiencia, un gel de 9 ml fue lo suficientemente grande como para que más de un centenar de discos de 5 mm de diámetro.

3. Cultura de los discos

1. Coloque un disco en cada pocillo de una placa de cultivo no-tejido de 24 pocillos tratadas.
2. Añadir 2 ml de medio de diferenciación condrogénica libre de suero a cada pocillo.
3. Coloque las placas en la incubadora (37 ° C, 5% CO _2).
4. Para los cambios de medios, sustituya 1 ml por pocillo cada 2-3 días.

4. La inmovilización de las muestras de Carga mecánica

1. Preparar 4% de agarosa (sin suspensión celular original) y el gel debería ser más delgado que los propios muestras (para evitar interferencias durante la carga). El espesor recomendado es de 1.5 a 1.9 mm (para muestras de 2,25 mm de espesor).
2. Una vez gelificado, ponche discos de diámetro 16 mm para placas de 24 pocillos. En cada disco, ponche de un agujero de 5 mm de la muestra que se coloca pulg Si se desea, punzón otro agujero de 5 mm en el borde del disco de la pipeta para ser colocado durante los cambios de los medios de comunicación.
3. Una vez agarosa pozos se han hecho, en lugar de 24 y placa, como se muestra en la Figura 3.
4. Una vez que el W agarosaells se encuentran en la placa de 24 pocillos, ajuste a presión muestras en cada pocillo. La muestra debe sobresalir de la parte superior del pozo de agarosa.

5. Carga mecánica

1. Esterilizar platina (Figura 2).
2. Fije la placa de aluminio para la celda de carga. Secure carga plato / vaso / aluminio conjunto de la placa de carga hacia el escenario.
3. Encienda el controlador de motor paso a paso (interruptor en la parte trasera).
4. Encienda el programa abierto "APT usuario" (Figura 4) y PC.
   1. Pantalla izquierda controla el motor paso a paso horizontal. Pantalla de la derecha controla el motor paso a paso vertical. En cada pantalla, pestaña "control gráfico" permite un posicionamiento manual y registro "Sequencer Move" permite la automatización. Todas las unidades son mm.
5. Ir a la pestaña "Control de gráfico" en ambas pantallas y pulse el botón "Inicio / Zero". Ambos motores paso a paso tienen una gama de 50 mm. Pulsando la tecla "Inicio / Zero" enviará dos motores paso a paso a la posición cero (arriba y derecha-la mayoría de los puestos).
6. Prepare las muestras en la placa de 24 pocillos para la carga mediante la eliminación de algunos medios de comunicación de cada pocillo. No más de 1 ml de los medios de comunicación se debe dejar en cada pocillo para evitar el desbordamiento durante la carga. Asegúrese de que haya suficientes medios se queda en el pozo para mantener la muestra cubierta.
   1. Nótese que la incubadora se mantiene en condiciones de baja humedad para evitar el fracaso instrumento.
7. Lugar placa de 24 pocillos en biorreactor y alinearse cuidadosamente con la platina.
   1. La placa se fija al biorreactor usando cuatro localizadores cinemáticas ajustables. Para que sea más fácil alinear el plato, los dos localizadores izquierdo se han pre-posicionado. Apriete los dos localizadores adecuados para que la placa es seguro. Asegúrese de alinear la placa de arriba a ras con la parte frontal de la base del biorreactor.
   2. En la pestaña "Control gráfica", una posición específica del motor paso a paso se puede introducir manualmente haciendo clic en el cuadro de posición. Utilice esta función para bajar lentamente la platina y moverlo horizontalmente para alinear con la placa.
   3. Una vez que la placa está cerca de entrar en contacto con las muestras, empezar a poner la placa en incrementos muy lento (0,1 mm) hasta llegar a la posición de inicio predeterminada (véase la parte 6).
   4. Una vez alcanzada la posición de partida, vaya a "Mover Sequencer" ficha y cargar la secuencia de movimiento que desee pulsando "Cargar". A continuación, pulse "Ejecutar" para iniciar. (Figura 5) Véase la parte 7. Redacción de un protocolo de dosificación.
   5. Cuando haya terminado de cargar, elevar manualmente el rodillo. Si las muestras se pegan a la placa, coloque cuidadosamente de nuevo en el pocillo apropiado usando una espátula estéril.
   6. Retire placa de 24 pocillos de bioreactor y reemplazar los medios de comunicación.
   7. Retire con cuidado la placa de la célula de carga y luego se apagará instrumentos.

   6. Calibración Cargando platina

   Para asegurar que las cepas apropiadas se aplican a las muestras, cada platina debe calibrarse cuidadosamente antes de iniciar un experimento.

   1. Realice los pasos 5.1 a 5.8.
   2. Poner manualmente motor paso a paso horizontal en la posición de 25 mm.
   3. Con cuidado, la placa inferior hasta que apenas entra en contacto con la base del biorreactor. Célula de carga mostrará aumento de la carga en este punto. Tome nota de la posición exacta del motor paso a paso vertical (ser lo más preciso posible, ya que todas las mediciones de deformación de compresión se calcularán a partir de este valor).
   4. Anote la posición. Este valor se utiliza para escribir un protocolo de dosificación basado en dimensiones de la muestra y las cepas deseadas.

   7. Redacción de un protocolo de dosificación

   1. El biorreactor es capaz de aplicar tensión tanto a la compresión y cizalla, ya sea simultáneamente o individualmente. Tres principales parámetros deben decidirse: tara tensión de compresión, amplitud de deformación dinámica, y la carga de frecuencia.
   2. Una cepa de tara se aplica con el fin de evitar que el despegue de la platina de la muestra.
   3. Muestra amplitud de deformación dinámica y la carga de frecuenciafrecuencia se eligen.

   En este estudio se define tensión de compresión y de cizallamiento de la siguiente manera:
   

   Ejemplo de protocolo de dosificación Biaxial
   Espesor de la muestra: 2,25 mm
   Tara Cepa (compresión): 10% del espesor de la muestra (0,225 mm)
   Amplitud de deformación dinámica (compresión): 10% (+ / - 5% del espesor de la muestra)
   Frecuencia (compresión): 1 Hz
   Amplitud Dinámico de tensiones (cizallamiento): 25% del espesor de la muestra (0,5625 mm): Esfuerzo cortante es
   aplicada a la muestra por la platina se mueve horizontalmente.
   Frecuencia (Shear): 0,5 Hz
   Protocolo de dosificación habitual es de 3 horas de carga por día.

   En este ejemplo, la carga dinámica y la cizalladura se aplica simultáneamente en vez de secuencialmente. Creemos que este patrón mejor mimICS el entorno de carga compleja en la rodilla humana.

   4. Una vez que se ha seleccionado un protocolo de dosificación, un programa de secuencia de movimiento de compresión debe ser escrito.
   5. La secuencia de movimiento es exactamente lo que suena, una lista de posiciones que el motor paso a paso se moverá con una aceleración y velocidad máxima especificada.
   6. Calcular posiciones verticales ideales en función de la dosis de protocolo y el valor de calibración plato (de la parte 6).
   7. Ejemplo de cálculos para platina 1 se proporcionan a continuación:

   	Diferencia con el valor de calibración	Posición Vertical
   Platina Valor de calibración (toques fondo del biorreactor)	0 mm	29,7700 mm
   Platina hace contacto con la muestra (2,25 mm de la muestra)	4,4140 mm	25,3560 mm
   Stlluvia (5% Grosor)	4,3015 mm	25,4705 mm
   Strain (10% Grueso)	4,1890 mm	25,5810 mm
   Strain (15% Grueso)	4,0765 mm	25,6955 mm

   8. Una vez que las posiciones se computan, experimente con valores de aceleración y velocidad máxima para obtener la frecuencia correcta. El número de ciclos debe ser elegido, en consecuencia (por ejemplo, 10.800 ciclos de 3 horas a 1 Hz).
   9. Ejemplo de programa secuencia de movimientos de compresión dinámica (10% de compresión de tara, 10% amplitud de deformación dinámica, 1 Hz) (Figura 5)
   10. Cizalladura del programa de secuencia movimiento dinámico: El número de ciclos debe ser elegido de acuerdo a la frecuencia y la duración deseada (por ejemplo, 5.400 ciclos durante 3 horas a 0,5 Hz).
   11. Ejemplo de programa de secuencia movimiento de corte dinámico (10% de compresión de tara, 0,5625 mm (25% del espesor) dinámico de amplitud de deformación de cizallamiento, 0,5Hz) (Figura 5).

Resultados

El dispositivo fue probado mediante el uso de geles de agarosa se sembró con 20 millones de células / ml y se cultivaron condrocitos en presencia de uniaxial (compresión) o biaxial (compresión y cizalla) carga mecánica. Condrocitos primarios porcinos se aislaron a partir del cartílago articular de los cerdos 2-4 meses de edad. 5 mm de diámetro y 1,5 muestras mm de espesor se cultivaron en 2 ml de medio de cultivo condrogénica definido (DMEM alto en glucosa, 1% SU + Premezcla, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / m...

Discusión

Hemos diseñado un dispositivo de carga que es capaz de aplicar una tensión mecánica uniaxial o biaxial para construcciones de ingeniería de tejidos fabricados para el trasplante. El dispositivo se puede utilizar como un biorreactor para el cultivo in vitro de biocomposites ingeniería o como un dispositivo de prueba para describir las características mecánicas del tejido nativo o después de otros tratamientos previos a. Los sujetos de dispositivos diseñados construcciones de tejido a una carga ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM, High glucose, pyruvate	Invitrogen	11995
Agarose Type II	Sigma	CAS 39346-81-1
Penicillin Streptomycin Glutamine 100X	Invitrogen	10378-016
ITS+ Premix	BD Biosciences	354352
Pen Strep Glutamine	Invitrogen	10378-016
Amphotericin B	Invitrogen	041-95780
Ascorbic Acid	Sigma	A-2218
Nonessential Amino Acid Solution 100x	Sigma	M-7145
L-proline	Sigma	P-5607
Dexamethasone	Sigma	D-2915
Recombinant Human Transforming Growth Factor β1	R&D Systems	240-B-010
EQUIPMENT
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Single Channel Display	Honeywell	SC500
50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator	Thorlabs	LNR50SE/M
Two Channel Stepper Motor Controller	Thorlabs	BSC102
50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)	Thorlabs	DRV014
Adjustable Kinematic Locator (4)	Thorlabs	KL02
Precision Right Angle Plate	Thorlabs	AP90/M
Vertical Mounting Bracket	Thorlabs	LNR50P2/M
Solid Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB3030/M
Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates	BioRad	#1653312 and #1653310
Disposable Biopsy Punch, 5 mm	Miltex, Inc.	33-35
16 mm hollow punch	Neiko Tools
Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom	BD Biosciences	351147
Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens	McMaster-Carr	86735k19	Custom-machined