Conception d'un bioréacteur de chargement mécanique biaxial pour l'ingénierie tissulaire

Résumé

Nous avons conçu un nouveau bioréacteur de chargement mécanique qui peut appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à une biocomposites du cartilage avant la transplantation dans un défaut de cartilage articulaire.

Résumé

Nous avons conçu un dispositif de chargement qui est capable d'appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à un tissu biocomposites ingénierie fabriqués à la transplantation. Alors que le dispositif fonctionne principalement comme un bioréacteur qui imite les contraintes mécaniques indigènes, il est également équipé d'une cellule de charge pour fournir une rétroaction de force ou les essais mécaniques des constructions. Les sujets de périphériques conçus constructions de cartilage à biaxial chargement mécanique avec une grande précision de la dose de charge (amplitude et fréquence) et est assez compact pour tenir dans un incubateur de culture tissulaire standard. Il charge échantillons directement dans une plaque de culture de tissus, et de multiples formats de plaques sont compatibles avec le système. Le dispositif a été conçu en utilisant des composants fabriqués pour les applications laser à guidage de précision. Chargement bi-axial est réalisé en deux phases orthogonales. Les étapes ont une gamme de voyage de 50 mm et sont entraînés indépendamment par stepper actionneurs automobiles, contrôlés parun pas à pas conducteur en boucle fermée du moteur qui offre des capacités de micro-pas à pas, ce qui permet des tailles de pas de moins de 50 nm. Une polysulfone chargement cylindre est couplé à la plate-forme mobile bi-axiale. Mouvements des étapes sont contrôlées par Thor-laboratoires de technologie de positionnement avancé (APT) de logiciels. Le moteur pas à pas est utilisé avec le logiciel pour régler les paramètres de charge de fréquence et d'amplitude à la fois de cisaillement et de compression indépendante et simultanée. Les informations de localisation sont fournies par des codeurs optiques linéaires qui ont une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 um et une résolution de 20 nm, traduisant une précision de positionnement inférieure à 3 um sur la totalité de 50 mm de course. Ces codeurs fournissent la rétroaction de position nécessaire à l'électronique de commande pour assurer véritables capacités nanopositionnement. Afin d'assurer le retour de force pour détecter le contact et d'évaluer les réponses de chargement, une cellule de charge miniature de précision est positionné entre le plateau de chargement et le Movinplate-forme g. La cellule de charge a une précision élevée de 0,15% à 0,25% de la pleine échelle.

Introduction

Nous avons conçu un bioréacteur de chargement qui est capable d'appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à un tissu biocomposites ingénierie fabriqués à la transplantation. Ce dispositif est principalement conçu comme un bioréacteur pour les remplacements d'ingénierie pour le cartilage articulaire, il pourrait également être utilisé pour d'autres tissus porteurs dans le corps humain. Notre motivation dans cette conception de bioréacteur découle de Drachman et Sokoloff ^1, qui a fait l'observation séminale de formation anormale du cartilage articulaire dans des embryons de poulet paralysés en raison de l'absence de mouvement. De même, l'exercice physique est essentiel pour le développement du muscle normal et en os. En accord avec ce concept, de nombreux groupes de recherche ont étudié comment les différents modes de stimuli physiques pendant la culture in vitro module les propriétés biochimiques et mécaniques des biocomposites cellule de biomatériaux et d'explants de tissus ^2-7. Le concept de l'ingénierie tissulaire fonctionnelleimplique l'utilisation in vitro de stimuli mécaniques pour améliorer les propriétés fonctionnelles du tissu, à savoir les propriétés mécaniques qui permettent au tissu pour résister à la contrainte attendue in vivo et la souche ^8,9. De nombreuses études font état d'une charge mécanique de l'utilisation en termes de cisaillement et de compression pour stimuler constructions de cartilage d'ingénierie pour les joints articulaires. ¹⁰ Mauck et al. Suggèrent que le chargement mécanique seul peut induire chondrogénèse des cellules souches mésenchymateuses même en l'absence de facteurs de croissance qui sont considérés comme essentiels. Application de la charge mécanique intermittente comme la compression ou de cisaillement lors de la culture de tissus a été montré pour moduler cartilage et la formation osseuse, mais la dosimétrie optimale de chargement diffère selon les propriétés des tissus et cellules ^11.

La fonction la plus importante du cartilage articulaire est la capacité à résister à des forces de compression et de cisaillement à l'intérieurl'articulation, donc il doit avoir une grande compression et modules de cisaillement. Le manque de résistance mécanique fonctionnelle et ultrastructure physiologique dans le cartilage d'ingénierie a abouti à la répartition sur le néo-cartilage in vivo et l'échec des stratégies de remplacement de cartilage dans les articulations. Bien que la compression et de cisaillement ont été fréquemment démontré à moduler et améliorer la résistance mécanique des biocomposites du cartilage articulaire, une approche combinée est rare ^6,12-15. Wartella et Wayne ¹⁶ a conçu un bioréacteur qui applique la tension et de compression pour produire des substituts de cartilage du ménisque. Waldman et al. ¹⁵ conçu un dispositif pour appliquer une compression et un cisaillement de chondrocytes cultivés dans un substrat de polyphosphate de calcium poreux. Bian et al. ¹⁷ a démontré des propriétés mécaniques correspondant cartilage natif avec la culture in vitro des chondrocytes canins adultes dans les gels et l'application de deux axes mechanical chargement (compression déformation chargement et coulissant charge de contact).

Le bioréacteur de chargement mécanique biaxial a été initialement conçu par Danielle Chu dans notre laboratoire avec l'objectif global d'induire des adaptations morphologiques dans les tissus du cartilage fabriqué constructions obtenues dans des modules de compression et de cisaillement élevées que celles actuellement disponibles ^18. Nous croyons que cette recherche permettra d'accroître considérablement notre compréhension plus large de la façon dont mechanotransduction peut être modulée à l'ingénieur cliniquement tissus concernés.

Protocole

1. Biaxiale Chargement bioréacteur Conception

1. Le bioréacteur emploie deux étapes fabriqués par Thor-labs (Newton, MA) pour les applications laser à guidage de précision pour appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale de tissus fabriqués avec une grande précision de la dose de charge (amplitude et fréquence) et l'application d'un large éventail de conditions de culture de tissus de simple à plaques à 24 puits (Figure 1).
2. Chargement bi-axial est réalisé en deux étapes travelmax (LNR50SE). Ces étages sont montées orthogonalement dans une configuration XZ. La phase horizontale fournit des mouvements de cisaillement dynamiques en oscillant le long de l'axe des X. La phase verticale fournit une charge de compression dynamique en faisant osciller le long de l'axe Z. Ces étapes ont une gamme de voyage de 50 mm et sont entraînés indépendamment par stepper actionneurs à moteur (DRV014), commandé par un pilote de moteur pas à pas en boucle fermée (BSC102) qui offre des capacités de Micro-progression, ce qui permet des tailles de pas de moins de50 nm.
3. Le dispositif est monté sur un support rigide 25 cm x 30 cm x 12,5 plaque de base en aluminium de mm qui est utilisé en tant que plate-forme pour le montage de composants de la machine et pour le montage de plaques de culture de tissus. Butées réglables cinématiques sont utilisés pour verrouiller les plaques de culture de tissus en place sur la plaque de base en aluminium. Ces arrêts cinématiques ont des vis de réglage fin pour permettre un alignement précis qui est par ailleurs pas réalisable à la main. La conception modulaire de la plaque de base permet un placement souple de ces arrêts cinématiques pour accueillir des plaques de différentes tailles et formes (boîtes de Petri par rapport aux plaques multi-puits).
4. Une coutume-usiné polysulfone chargement plaque est couplée à la plate-forme mobile bi-axial via un usinage de précision crochet droit. Matériau polysulfone a été choisi en raison de sa biocompatibilité, une facilité d'usinage, et la facilité de stérilisation.
5. Mouvements des étapes sont contrôlées par la technologie de positionnement avancé Thor-laboratoires d'(APT) du logiciel. Le moteur pas à pas, c'est noused en association avec le logiciel qui permet l'ajustement de paramètres de charge de fréquence et d'amplitude à la fois de cisaillement et de compression indépendante et simultanée.
6. Rétroaction de position est fournie par des codeurs optiques linéaires qui sont attachés à chaque plate-forme mobile et sont intégrés au logiciel. Le système de codeur a une répétabilité bidirectionnelle de 0,1 um et une résolution de 20 nm, traduisant une précision de positionnement inférieure à 3 um sur la totalité de 50 mm de course. Ces codeurs fournissent la rétroaction de position nécessaire à l'électronique de commande pour assurer une véritable capacité de nanopositionnement et une lecture directe de la position absolue.
7. Afin d'assurer le retour de force nécessaire pour détecter un contact entre plateau et des échantillons et évaluer les réponses de chargement, une cellule de charge miniature de précision (Honeywell Modèle 31) est positionné entre le chargement d'impression et la plate-forme mobile (Figure 2). La cellule de charge a une précision élevées de0,15% à 0,25% de la pleine échelle. L'unité d'affichage (SC500) pour la cellule de charge peut également fournir des mesures de charge allant jusqu'à 5 décimales. En outre, il dispose d'un port RS-232 pour permettre la collecte de données sur un ordinateur.

2. Cell-ensemencées Agarose constructions

1. Préparer 4% d'agarose: Ajouter 0,8 g d'agarose à 20 ml de DMEM (sans additifs) dans un flacon de 50 ml, faire bouillir, puis garder à 70 ° C four jusqu'à utilisation.
2. Ajuster le volume de la suspension cellulaire de la double quantité de la densité d'ensemencement des cellules désirée. Cette suspension est mélangée à volume égal de 4% p / v d'agarose pour créer un gel d'agarose à 2% à la densité de semis voulue.
3. Placez la fois la suspension cellulaire et une pipette de 10 ml dans l'incubateur.
4. Mettre en place le système de coulée de gel. Une 1,5 mm et une plaque d'espacement de 0,75 mm devrait être mis ensemble pour créer un gel d'une épaisseur de 2,25 mm. D'autres plaques d'écartement de taille peuvent être utilisés pour créer un gel d'épaisseurs différentes. Le système de coulée de gel n'est pas suffisamment grand pour contenir ces plaques togetelle, alors ils doivent être scellés en toute sécurité pour éviter les fuites.
5. L'étape suivante consiste à mélanger rapidement la suspension de cellules avec de l'agarose et la pipette préparée précédemment dans le moule de gel avant que l'agarose se solidifie. Retirez le agarose liquide du four et placez un thermomètre stérile en elle. La gélose doit refroidir à 42-43 ° C avant de les mélanger avec les cellules. Réchauffer la suspension de cellules à 37 ° C. Une fois que l'agarose frappe 43 ° C, une pipette rapidement la quantité désirée puis pipette immédiatement la suspension de cellules de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Puis ajouter immédiatement la totalité du mélange dans le moule de gel.
6. Laisser le gel se solidifier pendant 10-15 minutes, puis inclinez-le soigneusement à l'horizontale.
7. Retirer la plaque de verre supérieure et disques de punch avec la biopsie. Les disques peuvent être ramassés avec une petite spatule stérile. Dans notre expérience, un ml de gel 9 est assez grand pour faire plus d'une centaine de disques de 5 mm de diamètre.

3. Culture des disques

1. Placer un disque dans chaque puits d'une plaque de culture non-tissulaire 24 ainsi traitée.
2. Ajouter 2 ml de milieu de différenciation chondrocytaire sans sérum à chaque puits.
3. Mettez les plaques dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO _2).
4. Pour les changements de supports, remplacer 1 ml par puits tous les 2-3 jours.

4. Immobilisation des échantillons pour Chargement mécanique

1. Préparer 4% d'agarose (pas de suspension cellulaire ajoutée) et le gel doit être plus mince que les échantillons eux-mêmes (pour éviter les interférences pendant le chargement). L'épaisseur recommandée est de 1,5-1,9 mm (pour les échantillons de 2,25 mm d'épaisseur).
2. Une fois gélifiées, les disques d'un diamètre de 16 mm poinçon pour plaques à 24 puits. Dans chaque disque, un trou de poinçon de 5 mm de l'échantillon à être placé in Si on le souhaite, un autre trou de poinçon de 5 mm sur le bord du disque à la pipette pour être placé lors de changements de supports.
3. Une fois que les puits d'agarose ont été faites, place dans 24 plaques à puits, comme le montre la figure 3.
4. Une fois le w agaroseElls sont en plaque de 24 puits, Press Fit échantillons dans chaque puits. L'échantillon ne doit faire saillie à partir de la partie supérieure du puits d'agarose.

5. Chargement mécanique

1. Stériliser plateau (Figure 2).
2. Fixer la plaque d'aluminium pour charger la cellule. Sécurisé platine / cellule / aluminium ensemble de plaque de charge à l'étage de charge.
3. Allumez le contrôleur de moteur pas à pas (interrupteur à l'arrière).
4. Allumez le programme ouvert "APT utilisateur" (Figure 4) et PC.
   1. Écran gauche contrôle moteur pas à pas horizontal. Écran droite contrôle moteur pas à pas vertical. Dans chaque écran, onglet "graphique de configuration» permet un positionnement manuel et onglet "Sequencer Move" permet l'automatisation. Toutes les unités sont mm.
5. Allez à l'onglet "Contrôle graphique" sur les deux écrans et appuyez sur le bouton "Home / Zero". Les deux moteurs pas à pas ont une portée de 50 mm. Appuyez sur "Accueil / Zero" enverra deux moteurs pas à pas à la position zéro (haut et à droite la plupart des postes).
6. Prepare les échantillons dans la plaque de 24 puits pour le chargement en supprimant certains médias de chaque puits. Pas plus de 1 ml de milieu doit être laissé dans chaque puits pour éviter tout débordement lors du chargement. Assurez-vous que suffisamment de médias sont laissés dans le puits pour maintenir l'échantillon couvert.
   1. Notez que l'incubateur est conservé dans des conditions de faible humidité pour éviter une défaillance de l'appareil.
7. Placer la plaque 24 puits en bioréacteur et aligner soigneusement avec la platine.
   1. La plaque est fixée à l'aide de quatre bioréacteur localisateurs cinématiques réglables. Pour rendre plus facile pour aligner le plateau, les deux locators gauche ont été pré-positionnés. Serrez les deux locators droite de sorte que la plaque est sécurisée. Assurez-vous d'aligner la plaque parfaitement sur le devant de la base du bioréacteur.
   2. Dans l'onglet "Contrôle graphique", une position moteur pas à pas spécifique peut être saisie manuellement en cliquant sur la case de position. Utilisez cette fonction pour réduire lentement le plateau et le déplacer horizontalement afin de s'aligner avec la plaque.
   3. Une fois que le plateau est proche d'entrer en contact avec des échantillons, commencer à mettre la platine vers le bas par incréments très lentes (0,1 mm) jusqu'à ce que vous atteignez la position de départ prédéterminée (voir partie 6).
   4. Une fois la position de départ est atteint, allez dans "Déplacer Sequencer" onglet et charger la séquence de déplacement souhaitée en appuyant sur "Load". Ensuite, appuyez sur "Exécuter" pour commencer. (Figure 5) Voir la partie 7. Rédaction d'un protocole de dosage.
   5. Lorsque vous avez terminé le chargement, le soulever manuellement le plateau. Si les échantillons sont collés sur la vitre d'exposition, soigneusement mis de nouveau dans le puits approprié à l'aide d'une spatule stérile.
   6. Retirer la plaque 24 et de bioréacteur et de remplacer les médias.
   7. Retirez délicatement le plateau de la cellule de charge, puis s'éteint instruments.

   6. Calibrage Chargement Platen

   Pour s'assurer que les souches appropriées sont appliquées aux échantillons, chaque plateau doit être soigneusement calibrée avant de commencer une expérience.

   1. Effectuer les étapes 5.1 et 5.8.
   2. Mettre manuellement moteur pas à pas de la position horizontale à 25 mm.
   3. Platine inférieure avec précaution jusqu'à ce qu'elle arrive juste à peine en contact avec le fond du bioréacteur. Cellule de charge indique l'augmentation des charges à ce point. Prenez note de la position exacte du moteur pas à pas vertical (être aussi précis que possible, que toutes les mesures de contrainte de compression seront calculés à partir de cette valeur).
   4. Enregistrer la position. Cette valeur sera utilisée pour écrire un protocole de dosage en fonction des dimensions de l'échantillon et les contraintes désirées.

   7. Rédaction d'un protocole de dosage

   1. Le bioréacteur est capable d'appliquer des contraintes à la fois en compression et en cisaillement, que ce soit simultanément ou individuellement. Trois paramètres principaux doivent être décidées: tare contrainte de compression, amplitude de la déformation dynamique, et la fréquence de chargement.
   2. Une souche de tare est appliquée afin d'empêcher le décollage de la platine à partir de l'échantillon.
   3. Exemple amplitude de la déformation dynamique et chargement frequence sont choisis.

   Dans cette étude, nous définissons une contrainte de compression et de cisaillement comme suit:
   

   Exemple protocole de dosage bi-axial
   épaisseur de l'échantillon: 2,25 mm
   Tare Strain (Compression): 10% de l'épaisseur de l'échantillon (0,225 mm)
   Amplitude de déformation dynamique (compression): 10% (+ / - 5% de l'épaisseur de l'échantillon)
   Fréquence (Compression): 1 Hz
   L'amplitude de déformation dynamique (cisaillement): 25% de l'épaisseur de l'échantillon (0,5625 mm): La contrainte de cisaillement est
   appliquée à l'échantillon par le cylindre d'impression se déplaçant horizontalement.
   Fréquence (cisaillement): 0,5 Hz
   Protocole de dosage typique est de 3 h de chargement par jour.

   Dans cet exemple, le chargement dynamique et de cisaillement est appliquée simultanément plutôt que séquentiellement. Nous croyons mieux ce modèle mimics l'environnement de chargement complexe dans le genou humain.

   4. Une fois le protocole de dosage a été sélectionné, un programme de séquence de déplacement de compression doit être écrit.
   5. La séquence de mouvement est exactement ce que cela ressemble, une liste des positions que le moteur pas à pas se déplace à une accélération spécifié et la vitesse maximale.
   6. Calculez des positions verticales souhaitées en fonction de dosage protocole et la valeur d'étalonnage plateau (de la partie 6).
   7. Exemple calculs pour Platen 1 sont fournis ci-dessous:

   	Différence de valeur d'étalonnage	Position verticale
   Platen valeur d'étalonnage (touche bas du bioréacteur)	0 mm	29,7700 mm
   Platen en contact avec l'échantillon (échantillon de 2,25 mm)	4,4140 mm	25,3560 mm
   Stpluie (5% Epaisseur)	4,3015 mm	25,4705 mm
   Strain (10% Epaisseur)	4,1890 mm	25,5810 mm
   Strain (15% Epaisseur)	4,0765 mm	25,6955 mm

   8. Une fois que les positions sont calculées, d'expérimenter avec l'accélération et les valeurs maximales de vitesse pour obtenir la bonne fréquence. Le nombre de cycles doit être choisi en conséquence (par exemple 10.800 cycles de 3 h à 1 Hz).
   9. Exemple de programme dynamique de compression de mouvement de la séquence (10% de tare compression, 10% de l'amplitude de la contrainte dynamique, 1 Hz) (Figure 5)
   10. Programme de séquence de déplacement de cisaillement dynamique: Le nombre de cycles doit être choisie en fonction de la fréquence et de la durée souhaitée (par exemple 5.400 cycles pendant 3 heures à 0,5 Hz).
   11. Exemple de programme dynamique de cisaillement de la séquence de déplacement (10% de compression de tare, 0,5625 mm (25% de l'épaisseur) de l'amplitude de la déformation de cisaillement dynamique, 0,5Hz) (Figure 5).

Résultats

Le dispositif a été testée en utilisant des gels d'agarose ensemencé avec 20 millions de cellules / ml et les chondrocytes cultivés en présence d'uniaxiale (compression) ou bi-axiale (compression et de cisaillement) chargement mécanique. Chondrocytes porcins primaires ont été isolés du cartilage articulaire des porcs âgés de 2-4 mois. 5 mm de diamètre et des échantillons de 1,5 mm d'épaisseur ont été cultivées dans 2 ml de milieu de culture chondrogénique défini (DMEM riche en glucose, 1%...

Discussion

Nous avons conçu un dispositif de chargement qui est capable d'appliquer une contrainte mécanique uniaxiale ou biaxiale à des constructions de l'ingénierie tissulaire fabriqués pour la transplantation. L'appareil peut être utilisé comme un bioréacteur pour la culture in vitro de biocomposites ingénierie ou comme un dispositif de contrôle de décrire les caractéristiques mécaniques du tissu natif ou après d'autres traitements avant. Les sujets de périphériques conçus cons...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM, High glucose, pyruvate	Invitrogen	11995
Agarose Type II	Sigma	CAS 39346-81-1
Penicillin Streptomycin Glutamine 100X	Invitrogen	10378-016
ITS+ Premix	BD Biosciences	354352
Pen Strep Glutamine	Invitrogen	10378-016
Amphotericin B	Invitrogen	041-95780
Ascorbic Acid	Sigma	A-2218
Nonessential Amino Acid Solution 100x	Sigma	M-7145
L-proline	Sigma	P-5607
Dexamethasone	Sigma	D-2915
Recombinant Human Transforming Growth Factor β1	R&D Systems	240-B-010
EQUIPMENT
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Single Channel Display	Honeywell	SC500
50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator	Thorlabs	LNR50SE/M
Two Channel Stepper Motor Controller	Thorlabs	BSC102
50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)	Thorlabs	DRV014
Adjustable Kinematic Locator (4)	Thorlabs	KL02
Precision Right Angle Plate	Thorlabs	AP90/M
Vertical Mounting Bracket	Thorlabs	LNR50P2/M
Solid Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB3030/M
Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates	BioRad	#1653312 and #1653310
Disposable Biopsy Punch, 5 mm	Miltex, Inc.	33-35
16 mm hollow punch	Neiko Tools
Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom	BD Biosciences	351147
Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens	McMaster-Carr	86735k19	Custom-machined