Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l'ingegneria tissutale

Riepilogo

Abbiamo progettato un nuovo bioreattore carico meccanico in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale per un biocomposite cartilagine prima del trapianto in un difetto della cartilagine articolare.

Abstract

Abbiamo progettato un dispositivo di caricamento che è in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale ad un tessuto biocompositi costruiti fabbricati per il trapianto. Mentre il dispositivo funziona principalmente come un bioreattore che imita le sollecitazioni meccaniche native, è anche dotato di una cella di carico per fornire forza feedback o prove meccaniche dei costrutti. I soggetti di dispositivi progettati costrutti cartilagine biassiale carico meccanico con grande precisione di dose di carico (ampiezza e frequenza) ed è abbastanza compatto per adattarsi all'interno di un tessuto culturale incubatore standard. Si carica campioni direttamente in una piastra di coltura tissutale, e molteplici dimensioni piatto sono compatibili con il sistema. Il dispositivo è stato progettato utilizzando componenti prodotti per applicazioni laser a guida di precisione. Carico biassiale è compiuta da due fasi ortogonali. Gli stadi hanno una gamma di corsa 50 mm e sono azionati in modo indipendente da stepper attuatori motore controllata daun passo-passo del driver a circuito chiuso del motore che dispone di funzionalità di micro-stepping, consentendo dimensioni passo inferiori a 50 nm. Un polisulfone caricamento platina è accoppiato alla piattaforma mobile biassiale. Movimenti delle fasi sono controllate da Thor-laboratori Advanced Positioning Technology (APT) software. Il driver motore passo-passo viene utilizzato con il software per regolare i parametri di carico di frequenza e ampiezza di taglio e compressione sia indipendente e simultaneo. Retroazione di posizionamento è fornita da encoder ottici lineari che hanno una ripetibilità bidirezionale di 0,1 micron e una risoluzione di 20 nm, traducendo ad una precisione di posizionamento inferiore a 3 micron sulla intero 50 mm di corsa. Questi encoder forniscono la necessaria retroazione di posizione per l'elettronica di azionamento per garantire reali capacità nanopositioning. Per fornire la retroazione di forza per rilevare contattare e valutare le risposte di carico, una cella di carico miniatura precisione è posizionato tra la piastra di carico e la movinpiattaforma g. La cella di carico è elevata precisione di 0,15% al ​​0,25% del fondo scala.

Introduzione

Abbiamo progettato un bioreattore di carico che è in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale ad un tessuto biocompositi costruiti fabbricati per il trapianto. Questo dispositivo è progettato principalmente come bioreattore per sostituzioni ingegnerizzati per cartilagine articolare, ma potrebbe essere utilizzato anche per altri tessuti portanti nel corpo umano. La nostra motivazione in questo disegno bioreattore nasce da Drachman e Sokoloff ^1, che ha fatto l'osservazione seminale di formazione anomala di cartilagine articolare in embrioni di pollo paralizzati a causa di assenza di movimento. Analogamente, l'esercizio fisico è essenziale per lo sviluppo di muscolo normale e ossa. In linea con questo concetto, molti gruppi di ricerca hanno studiato come le diverse modalità di stimoli fisici durante la coltivazione in vitro modula le proprietà biochimiche e meccaniche della cellula-biomateriale biocompositi ed espianti di tessuto ^2-7. Il concetto di ingegneria tissutale funzionalecoinvolge l'uso in vitro di stimoli meccanici per migliorare le proprietà funzionali dei tessuti, cioè le proprietà meccaniche che consentono il tessuto per resistere alla sollecitazione previsto in vivo e forzerebbe ^8,9. Numerosi studi riportano l'uso carico meccanico in termini di taglio e compressione per stimolare costrutti cartilaginei ingegnerizzati per giunti articolari. Mauck et al. ¹⁰ suggeriscono che sola carico meccanico può indurre condrogenesi di cellule staminali mesenchimali anche in assenza di fattori di crescita che sono considerati vitali. Applicazione del carico meccanico intermittente come compressione oa taglio durante la coltura tissutale è stato dimostrato per modulare cartilagine e formazione ossea, tuttavia la dosimetria ottimale di caricamento varia con cellule e proprietà del tessuto ^11.

La funzione più importante della cartilagine articolare è la capacità di sopportare forze di compressione e di taglio entroil giunto, quindi deve avere alta compressione e moduli di taglio. La mancanza di resistenza meccanica funzionale e ultrastruttura fisiologico nella cartilagine ingegnerizzata ha provocato la rottura di neo-cartilagine in vivo e il fallimento delle strategie di sostituzione della cartilagine delle articolazioni. Sebbene compressione e taglio sono stati comunemente dimostrato di modulare e migliorare la resistenza meccanica del biocompositi cartilagine articolare, un approccio combinazione è rara ^6,12-15. Wartella e Wayne ¹⁶ progettato un bioreattore che applicata tensione e compressione per la produzione di sostituti della cartilagine meniscale. Waldman et al. ¹⁵ progettato un dispositivo per applicare compressione e taglio di condrociti coltivati ​​in un substrato poroso calcio polifosfato. Bian et al. ¹⁷ hanno dimostrato proprietà meccaniche corrispondenti cartilagine nativa con la coltivazione in vitro dei condrociti canini adulti in gel e applicazione di biassiale mechmeccanicaa carico (compressione deformante carico e scorrevole contatto carico).

Il carico biassiale bioreattore meccanico è stato originariamente progettato da Danielle Chu nel nostro laboratorio con l'obiettivo generale di indurre adattamenti morfologici in tessuto cartilagineo ingegnerizzato costruisce con conseguente più alti moduli di compressione e di taglio rispetto a quelli attualmente disponibili ^18. Crediamo che questa ricerca aumenterà in modo significativo la nostra comprensione più ampia di come mechanotransduction può essere modulata per ingegnere tessuti clinicamente rilevanti.

Protocollo

1. Biassiale Caricamento bioreattore design

1. Il bioreattore impiega due stadi fabbricati da Thor-laboratori (Newton, MA) per applicazioni laser a guida di precisione per l'applicazione di sollecitazioni meccaniche uniassiale o biassiale per tessuti ingegnerizzati, con grande precisione di dose di carico (ampiezza e frequenza) e applicata a una vasta gamma di condizioni di coltura di tessuto da sola a piastre da 24 pozzetti (Figura 1).
2. Carico biassiale è compiuta da due fasi travelmax (LNR50SE). Queste fasi sono montati ortogonalmente in una configurazione XZ. La fase orizzontale prevede movimenti di rottura dinamica oscillando lungo l'asse X. La fase verticale consente il caricamento dinamico a compressione da oscillante lungo l'asse Z. Queste fasi hanno una gamma di corsa 50 mm e sono azionati in modo indipendente da stepper attuatori motore (DRV014), controllati da un driver del motore passo-passo ad anello chiuso (BSC102) che dispone di funzionalità di micro-stepping, consentendo dimensioni passo inferiori50 nm.
3. Il dispositivo è montato su un rigido 25 cm x 30 cm x 12,5 millimetri piastra di base in alluminio che viene utilizzato come piattaforma per l'assemblaggio di componenti di macchine e per il montaggio delle piastre di coltura tissutale. Fermate cinematici regolabili sono utilizzati per bloccare piastre di coltura tissutale in posizione sulla piastra di base in alluminio. Queste fermate cinematici hanno viti di regolazione di precisione per consentire l'allineamento preciso che non è altrimenti raggiungibile a mano. La struttura modulare della piastra di base consente la collocazione di queste fermate cinematici per accogliere lastre di diverse dimensioni e forme (piastre Petri vs piastre multi-pozzetto).
4. Un custom-lavorata polisulfone caricamento lastra è accoppiata alla piattaforma mobile bi-assiale tramite una parentesi angolare destra una macchina di precisione. Materiale polisulfone è stato scelto per la sua biocompatibilità, la facilità di lavorazione, e la facilità di sterilizzazione.
5. Movimenti delle fasi sono controllate da Advanced Technology Posizionamento Thor-Labs (APT) software. Il driver di motore passo-passo è noied in combinazione con il software che permette la regolazione dei parametri di carico di frequenza e ampiezza di taglio e compressione sia indipendente e simultaneo.
6. Retroazione di posizionamento è fornita da encoder ottici lineari che sono attaccati ad ogni piattaforma mobile e sono integrati con il software. Il sistema encoder ha una ripetibilità bidirezionale di 0,1 micron e una risoluzione di 20 nm, traducendo ad una precisione di posizionamento inferiore a 3 m oltre i ben 50 mm di corsa. Questi encoder forniscono la necessaria retroazione di posizione per l'elettronica di azionamento per garantire vere capacità nanopositioning e una lettura diretta della posizione assoluta.
7. Al fine di fornire la retroazione di forza necessaria per rivelare il contatto tra piastra e campioni e valutare le risposte di carico, una cella di carico miniatura di precisione (Honeywell Modello 31) è posizionato tra il carico platina e la piattaforma mobile (Figura 2). La cella di carico ha alte precisioni di0,15% al ​​0,25% del fondo scala. L'unità di visualizzazione (SC500) per la cella di carico può anche fornire misurazioni di carico fino a 5 decimali. Inoltre, dispone di una porta RS-232 per consentire la raccolta di dati su un computer.

2. Cella testa di serie agarosio costrutti

1. Preparare 4% agarosio: Aggiungere 0,8 g di agarosio a 20 ml di DMEM (senza additivi) in un pallone da 50 ml, bollire, e poi tenere in forno a 70 ° C fino al momento dell'uso.
2. Regolare il volume di sospensione cellulare per doppio importo della densità di semina cellulare desiderato. Questa sospensione viene miscelata con un volume uguale del 4% w / v agarosio per creare un gel di agarosio al 2% alla densità di semina desiderata.
3. Posto sia la sospensione cellulare e una pipetta 10 ml nell'incubatrice.
4. Configurare il sistema di colata di gel. Uno 1,5 mm e uno 0,75 millimetri piastra distanziale dovrebbe essere messo insieme per creare un gel di spessore 2,25 millimetri. Altre piastre distanziatrici dimensioni possono essere utilizzati per creare gel diversi spessori. Il sistema di colata di gel non è abbastanza grande per contenere questi piatti togetlei, in modo che deve essere registrato in modo sicuro per evitare perdite.
5. Il passo successivo è quello di miscelare rapidamente la sospensione cellulare con l'agarosio precedentemente preparato e pipetta nello stampo gel prima l'agarosio si solidifica. Rimuovere l'agarosio liquido dal forno e posizionare un termometro sterile in esso. L'agarosio deve raffreddare a 42-43 ° C prima della miscelazione con celle. Riscaldare la sospensione cellulare a 37 ° C. Una volta che l'agarosio colpisce 43 ° C, pipettare rapidamente l'importo desiderato e quindi dispensare immediatamente la sospensione cellulare su e giù un paio di volte per mescolare. Quindi dispensare immediatamente la miscela nello stampo gel.
6. Lasciar solidificare il gel per 10-15 minuti e poi inclinare accuratamente in una posizione orizzontale.
7. Rimuovere la lastra di vetro superiore e dischi punzone con la biopsia. I dischi possono essere raccolti con una piccola spatola sterile. Nella nostra esperienza, un ml di gel 9 era abbastanza grande per fare più di un centinaio di dischi di 5 mm di diametro.

3. Cultura dei dischi

1. Mettere un disco in ciascun pozzetto di una cultura non-tessuto piatto 24 trattati bene.
2. Aggiungere 2 ml di siero terreno di differenziamento condrogenico in ciascun pozzetto.
3. Mettere le piastre in incubatore (37 ° C, 5% CO _2).
4. Per i cambiamenti dei media, sostituire 1 ml per bene ogni 2-3 giorni.

4. Immobilizzazione di campioni per il carico meccanico

1. Preparare 4% agarosio (senza sospensione cellulare aggiunta) e il gel dovrebbe essere più sottile rispetto agli stessi campioni (per evitare interferenze durante il carico). Lo spessore consigliato è di 1,5-1,9 mm (2,25 campioni per mm di spessore).
2. Una volta gelificato, punzone 16 millimetri dischi di diametro per 24 pozzetti. In ogni disco, un punzone foro 5 mm per il campione da collocare in Se desiderato, punzone altro foro 5 mm sul bordo del disco per la pipetta ad essere immessi durante sostituzioni di supporti.
3. Una volta agarosio pozzi sono stati fatti, posto in 24 pozzetti, come mostrato in Figura 3.
4. Una volta che l'agarosio wells sono nel piatto ben 24, Press Fit campioni in ciascun pozzetto. Il campione deve sporgere dalla parte superiore del pozzo agarosio.

5. Carico meccanico

1. Sterilizzare piastra (Figura 2).
2. Fissare piastra di alluminio a cella di carico. Sicuro di carico lastra / cella di carico / alluminio assieme piastra sul palco.
3. Accendere il controller del motore passo-passo (interruttore sul retro).
4. Accendere il programma aperto "APT utente" (Figura 4) e PC.
   1. Schermo di sinistra controlla motore passo-passo orizzontale. Schermo destro controlla motore passo-passo verticale. In ogni schermata, "Graphical Control" scheda consente il posizionamento manuale e scheda "Sposta Sequencer" permette di automazione. Tutte le unità sono mm.
5. Vai alla scheda "Graphical Control" su entrambi gli schermi e premere il tasto "Home page / Zero". Entrambi i motori passo-passo hanno una gamma di 50 mm. Premendo il tasto "Home page / Zero" invierà entrambi i motori passo-passo alla posizione zero (top-e più a destra le posizioni).
6. Prepare i campioni nella piastra a 24 pozzetti per carico rimuovendo alcuni media da ciascun pozzetto. Non più di 1 ml di media dovrebbe essere lasciato in ciascun pozzetto per evitare overflow durante il caricamento. Assicurarsi che sufficienti mezzi è lasciato nel bene per mantenere il campione coperto.
   1. Si noti che l'incubatore è tenuto in condizioni di bassa umidità per evitare il fallimento dello strumento.
7. Luogo 24 pozzetti in bioreattore e con attenzione allinearsi con il rullo.
   1. La piastra è fissata al bioreattore mediante quattro localizzatori cinematiche regolabili. Per rendere più facile allineare la piastra, i due locatori sinistro sono stati pre-posizionati. Serrare i due locatori giusti in modo che la piastra è sicuro. Assicurarsi di allineare la piastra fino a filo con la parte anteriore della base bioreattore.
   2. Nella scheda "Graphical Control", una posizione specifica del motore passo-passo può essere inserito manualmente facendo clic sulla casella di posizione. Utilizzare questa funzionalità per abbassare lentamente il rullo e spostarlo orizzontalmente per allinearsi con la piastra.
   3. Una volta che la piastra è vicino a venire a contatto con i campioni, iniziare a portare la piastra verso il basso con incrementi molto lenti (0,1 mm) fino a raggiungere la posizione di partenza prestabilito (vedi parte 6).
   4. Una volta raggiunta la posizione di partenza, andare su "Sposta Sequencer" scheda e caricare la sequenza di spostamento desiderata premendo il tasto "Load". Quindi premere "Esegui" per iniziare. (Figura 5) Cfr. parte 7. Scrittura di un protocollo di dosaggio.
   5. Una volta terminato il caricamento, sollevare manualmente la piastra. Se i campioni sono attaccati alla piastra, con attenzione riporli negli appositi bene con una spatola sterile.
   6. Togliere 24 pozzetti da bioreattore e sostituire i mezzi di comunicazione.
   7. Rimuovere con cautela la piastra dalla cella di carico e poi spegnere gli strumenti.

   6. Calibrazione Caricamento Platen

   Per garantire che i ceppi adeguate sono applicati ai campioni, ciascuna piastra deve essere attentamente calibrata prima di iniziare un esperimento.

   1. Eseguire i punti da 5.1 a 5.8.
   2. Mettere manualmente motore passo-passo orizzontale alla posizione 25 mm.
   3. Platina attenzione abbassare che sia a malapena entra in contatto con la base del bioreattore. Cella di carico mostrerà maggiori carichi a questo punto. Prendere nota della posizione esatta del motore passo-passo verticale (essere il più preciso possibile, come tutte le misure di deformazione a compressione saranno calcolati da questo valore).
   4. Registrare la posizione. Questo valore verrà utilizzato per scrivere un protocollo di dosaggio in base a campioni dimensioni e ceppi desiderati.

   7. Scrittura di un protocollo di dosaggio

   1. Il bioreattore è capace di applicare ceppo sia a compressione ea taglio, contemporaneamente o singolarmente. Tre parametri principali devono essere decisi: ceppo di tara, ampiezza di deformazione dinamica di compressione, e la frequenza di carico.
   2. Un ceppo di tara viene applicato per prevenire decollo della platina dal campione.
   3. Esempio ampiezza di deformazione dinamica e caricamento frequenza sono scelti.

   In questo studio si definisce tensione di pressione e di taglio come segue:
   

   Esempio biassiale protocollo di dosaggio
   Spessore del campione: 2,25 millimetri
   Tara Strain (compressione): 10% dello spessore del campione (0,225 mm)
   Dinamico ampiezza di deformazione (compressione): 10% (+ / - 5% dello spessore del campione)
   Frequenza (compressione): 1 Hz
   Dinamico ampiezza della deformazione (taglio): 25% dello spessore del campione (0,5625 millimetri): Sforzo di taglio è
   applicata al campione dal piano mobile orizzontalmente.
   Frequenza (Shear): 0,5 Hz
   Protocollo tipico di dosaggio è di 3 ore di carica al giorno.

   In questo esempio, il caricamento dinamico e di taglio è applicata simultaneamente piuttosto che in sequenza. Crediamo che questo modello migliore mimic dell'ambiente caricamento complesso nel ginocchio umano.

   4. Una volta che un protocollo di dosaggio è stato selezionato, un programma di sequenza di spostamento di compressione deve essere scritto.
   5. La sequenza di movimento è esattamente quello che sembra, una lista di posizioni che il motore passo-passo si sposterà in una accelerazione e la velocità massima specificata.
   6. Calcolare le posizioni verticali auspicate in base dosaggio protocollo e il valore di calibrazione piastra (da parte 6).
   7. Calcoli di esempio per Platen 1 sono riportate di seguito:

   	Differenza dal valore di calibrazione	Posizione verticale
   Platen valore di taratura (raggiunge la base del bioreattore)	0 millimetri	29,7700 millimetri
   Platen entra in contatto con il campione (2,25 millimetri campione)	4,4140 millimetri	25,3560 millimetri
   Stpioggia (5% Spessore)	4,3015 millimetri	25,4705 millimetri
   Strain (10% Spessore)	4,1890 millimetri	25,5810 millimetri
   Strain (15% Spessore)	4,0765 millimetri	25,6955 millimetri

   8. Una volta che le posizioni sono calcolati, sperimentare con i valori di accelerazione e velocità massima per ottenere la frequenza corretta. Il numero dei cicli deve essere scelto, di conseguenza (es. 10.800 cicli per 3 ore a 1 Hz).
   9. Esempio Compressione dinamica Programma sequenza Move (10% tara compressione, ampiezza di deformazione dinamica 10%, 1 Hz) (Figura 5)
   10. Dinamico programma sequenza di spostamento di taglio: Il numero di cicli deve essere scelto in base alla frequenza desiderata e la durata (ad esempio 5.400 cicli per 3 ore a 0,5 Hz).
   11. Esempio dinamico a taglio Programma sequenza di spostamento (10% tara compressione, 0,5,625 mila millimetri (25% dello spessore) ampiezza della deformazione di taglio dinamico, 0.5Hz) (Figura 5).

Risultati

Il dispositivo è stato testato utilizzando gel di agarosio seminato con 20 milioni di cellule / ml e condrociti coltivati ​​in presenza di monoassiale (compressione) o biassiale (compressione e taglio) carico meccanico. Condrociti suina primari sono stati isolati dalla cartilagine articolare di 2-4 mesi di età maiali. Diametro di 5 mm e 1,5 campioni mm di spessore sono stati coltivati ​​in 2 ml di definito terreno di coltura condrogenico (High glucosio DMEM, 1% ITS + premiscela, 100 U / ml penicillina, 100 ug ...

Discussione

Abbiamo progettato un dispositivo di carico, che è in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale di tessuto costrutti ingegnerizzati fabbricato per il trapianto. Il dispositivo può essere utilizzato come un bioreattore per la coltura in vitro di biocompositi ingegnerizzati o come un dispositivo di prova per descrivere le caratteristiche meccaniche del tessuto nativo o dopo altri trattamenti precedenti. I soggetti dispositivi progettati costrutti di tessuto biassiale a carico meccanic...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DMEM, High glucose, pyruvate	Invitrogen	11995
Agarose Type II	Sigma	CAS 39346-81-1
Penicillin Streptomycin Glutamine 100X	Invitrogen	10378-016
ITS+ Premix	BD Biosciences	354352
Pen Strep Glutamine	Invitrogen	10378-016
Amphotericin B	Invitrogen	041-95780
Ascorbic Acid	Sigma	A-2218
Nonessential Amino Acid Solution 100x	Sigma	M-7145
L-proline	Sigma	P-5607
Dexamethasone	Sigma	D-2915
Recombinant Human Transforming Growth Factor β1	R&D Systems	240-B-010
EQUIPMENT
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Model 31 Load Cell (1000 g)	Honeywell	AL311
Single Channel Display	Honeywell	SC500
50 mm Linear Encoded Travelmax Stage with Stepper Actuator	Thorlabs	LNR50SE/M
Two Channel Stepper Motor Controller	Thorlabs	BSC102
50 mm Trapezoidal Stepper Motor Drive (2)	Thorlabs	DRV014
Adjustable Kinematic Locator (4)	Thorlabs	KL02
Precision Right Angle Plate	Thorlabs	AP90/M
Vertical Mounting Bracket	Thorlabs	LNR50P2/M
Solid Aluminum Breadboard	Thorlabs	MB3030/M
Gel Casting System with 1.5 mm and 0.75 mm spacer plates	BioRad	#1653312 and #1653310
Disposable Biopsy Punch, 5 mm	Miltex, Inc.	33-35
16 mm hollow punch	Neiko Tools
Non-Tissue Culture Treated Plates, 24 Well, Flat Bottom	BD Biosciences	351147
Ultra-Moisture-Resistant Polysulfone sheet for loading platens	McMaster-Carr	86735k19	Custom-machined