La manipulación genética del ratón en desarrollo a través de Hipotálamo<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

Resumen

A pesar de la importancia clínica y funcional del hipotálamo, En el útero Manipulación genética de su desarrollo rara vez se ha intentado. Te mostramos un procedimiento detallado para En el útero Electroporación en el hipotálamo del ratón y muestran resultados representativos de transfección hipotálamo total y parcial (regional).

Resumen

La modificación genética de regiones específicas del cerebro de los mamíferos es el desarrollo de un enfoque experimental muy potente. Sin embargo, la generación de nuevos mutantes de ratón suele ser lento y frustrante. Se ha demostrado que el acceso al cerebro de ratón en desarrollo en el útero con la supervivencia post-operatoria razonable es posible. Sin embargo, los resultados de este procedimiento se han reportado casi exclusivamente para la parte más superficial y de fácil acceso del cerebro en desarrollo, es decir, la corteza. El tálamo, una región más estrecha y más medial, ha resultado más difícil objetivo. Transfección en los núcleos más profunda, especialmente aquellos del hipotálamo, es quizás los resultados más difíciles y por lo tanto, muy pocos han sido reportados. Aquí se demuestra un procedimiento para orientar todo el neuroepitelio hipotalámica o parte de él (regiones hipotalámicas) para la transfección por medio de electroporación. Las claves de nuestro enfoque ya narcosis tiempos, inyección en el third ventrículo, y amable y la colocación de los electrodos apropiados. Además, mostramos los resultados de la focalización y el posterior análisis histológico del núcleo hipotalámico más rebajada, el cuerpo mamilares.

Introducción

La manipulación genética del cerebro de ratón embrionario es un enfoque preferido para aprender acerca de la regulación del desarrollo. La generación de líneas de ratones mutantes sin embargo, es lento y caro. Un método poderoso para introducir cambios genéticos específicos en el desarrollo de las neuronas del cerebro de mamífero es la electroporación en el útero. Esencialmente, la técnica consiste en transfectar ADN en el neuroepitelio embrionario del cerebro por medio de impulsos eléctricos, a continuación, permitiendo que el embrión para sobrevivir durante un cierto período de tiempo, recoger el cerebro y examinarlas para su posible novela, fenotipos informativos. De esta manera, el experimentador puede probar hipótesis casi de inmediato y sin los largos períodos de espera necesarios para la producción de mutantes de ratón.

La transfección de ADN en embriones en desarrollo se inició con la electroporación in ovo en embriones de pollo ^1. La prueba de concepto esencial para el ratón se realizó en la cultura 2. Esto fue seguido por las primeras descripciones de la técnica en el ratón en el útero ^3,4.

El principal problema es para transfectar el cerebro en desarrollo de los embriones en el útero sin matarlos o de la madre. Aprender a realizar la cirugía necesaria (laparotomía, inyección, electroporación) requiere un largo periodo de entrenamiento. Una vez que la cirugía ha sido dominado hasta el punto en que la tasa de supervivencia embrionaria es aceptable, la pregunta clave es: ¿qué estructuras cerebrales son accesibles? No es sorprendente que los primeros trabajos publicados que muestran los resultados obtenidos con la electroporación in utero se centraron en el desarrollo cortical ^5-9. Esto sigue siendo cierto para la mayoría de las publicaciones utilizando esta técnica, ya que la región del cerebro de ratón en desarrollo más accesible a los procedimientos quirúrgicos es la corteza (Figura 1). El procedimiento para la electroporación en el útero en la corteza ha sido descritaen la prensa ¹⁰ y ^{11 a 14} en el vídeo. Una modificación de la técnica se puede utilizar para tratar una parte ventral del telencéfalo, los ganglios basales ^15.

Más allá del telencéfalo, el diencéfalo (clásicamente dividido en tálamo y el hipotálamo) es una región del cerebro anterior más difícil de alcanzar. Un pequeño número de documentos de informes dirigidos a su parte dorsal y más accesible, el tálamo ^16-19.

El hipotálamo es la parte más ventral del cerebro anterior, por lo tanto, el uno localizada más profundamente a partir de la superficie dorsal (corteza) (Figura 1). Esta región sigue siendo un reto difícil para los investigadores comprometidos para manipular genéticamente el cerebro del ratón en el útero. Hasta donde sabemos, sólo muy pocos artículos informen sobre los resultados de la transfección útero en el hipotálamo de ratón ^20,21. Sin embargo, la importancia funcional del hipotálamo Cañot ser exagerada, ya que regula los comportamientos como comer y beber, el apareamiento, la reproducción y crianza de los hijos ^22. Por otra parte, las alteraciones en el desarrollo hipotalámico contribuyen a originar más adelante en las condiciones de vida como la obesidad, la hipertensión, la diabetes y la pubertad precoz ^23. Ser capaz de alterar genéticamente el hipotálamo durante el desarrollo sería una herramienta muy poderosa para entenderlo.

El protocolo quirúrgico básico para la laparotomía de ratones embarazadas que usamos aquí es similar a la utilizada en otros protocolos ^11,13,14,24. Vamos a describir aquí brevemente para completar. Clave para nuestro procedimiento, por otro lado, son del tipo de anestesia, el lugar de la inyección, el tipo de electrodos y la inserción y la posición del electrodo positivo con respecto a la cabeza del embrión. Nosotros preferimos para inducir y mantener la anestesia por inhalación de gas sobre la anestesia intraperitoneal sencilla, ya que el primero permite laperíodos algo más largos de la narcosis necesarios para una cirugía difícil. Resultados inhalación isoflurano en la recuperación más rápida de la anestesia, ya que por lo general la madre demuestra un comportamiento normal ya minutos después de la cirugía. El punto más fácil de la inyección de la solución de ADN con la micropipeta de vidrio es el ventrículo lateral, que sin embargo es completamente inadecuado para la electroporación hipotálamo. Inyección directa en el tercer ventrículo es de hecho fundamental orientar la diencephalic estructuras profundas. Es posible transfectar del hipotálamo o de E12.0 E12.5 con electrodos estándar, off-the-shelf. Hemos encontrado algunos de los electrodos fabricados por Nepa Gene (Chiba, Japón) particularmente adecuado para este propósito.

Con nuestro procedimiento se obtiene la transfección de todo el neuroepitelio hipotalámica o, transfección regional parcial dependiendo de la orientación del electrodo. Aquí se demuestra la técnica mediante la transfección del cuerpo mammillary, podría decirse quela más profunda y rebajada de todos los núcleos hipotalámicos. Además, se muestra el análisis histológico detallado de las células transfectadas hacia abajo hasta el nivel celular de la resolución.

Una comparación de la electroporación en el útero con otros enfoques para transfectar el cerebro en desarrollo en el útero del ratón se puede encontrar en la sección de Discusión.

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Protocolo

1. Preparación de ADN y vidrio Micropipetas para Inyección

1. Buenas micropipetas de vidrio de calidad son esenciales para reducir la velocidad inicial alta aborto debido a la pérdida de líquido amniótico. El procedimiento para sacar micropipetas de vidrio ha sido bien documentado ^13,18,25. Use 1,2 mm de diámetro capilares tirado en una convencional Sutter P-97 dispositivo con los ajustes P = 500; calor = 300; Tire = 40; Velocidad = 50; Tiempo = 50. Coloque el extractor de 3 mm filamentos "valle" (Sutter Instrument FT330B). Los filamentos de tamaño de 2 mm han dado para nosotros los resultados menos satisfactorios. Por otro lado, biselado de la micropipeta consejos no parece mejorar los resultados para nosotros.
2. Disolver purificada, plásmido de ADN libre de endotoxina en PBS (cultivo celular de grado) que contiene 0,1% Fast Green a una concentración final de 1 a 2 g / l. The Green Fast hará que la solución inyectada visible en el ventrículo del cerebro embrionario.
3. Cargar 10 l de la solución de ADN en la micropipeta de vidrio.
4. Conectar la micropipeta de vidrio para el sistema de inyección (Bomba Pico) o pipeta de boca.

2. Anestesia

Prepare la mesa de operaciones con una almohadilla eléctrica y los instrumentos quirúrgicos. Encienda las fuentes de luz fría para facilitar la visualización de los embriones. Desinfectar las herramientas quirúrgicas que utilizan, por ejemplo, un cordón esterilizador de vidrio.

Tres procedimientos de anestesia son posibles para este protocolo (ver Discusión). Aquí vamos a describir el que consideramos la mejor, usar la inhalación de isoflurano para la inducción de la anestesia (tasa de flujo de 0,5 L / min), así como de mantenimiento (tasa de flujo de 1 l / min).

1. Introducir el ratón embarazada en un pequeño transparente (por lo que el ratón permanece visible) recipiente conectado a la Komesaroff Marcos 5 Anestésico dispositivo por un tramo corto de tubo.
2. Llene el vaporizador con isoflurano, a continuación, abra la botella de oxígeno conectado al dispositivo. Sopla una o dos pulsos de isoflUrane / oxígeno (0,5 L / min) en el recipiente que contiene el ratón y el reloj de la narcosis de establecer pulg
3. Tome el ratón fuera, cubrir sus ojos con un ungüento para evitar que se sequen y se ajustan a la máscara de anestesia de flujo en la cabeza de inmediato.

3. Laparotomía

1. Coloque el ratón panza arriba sobre el cojín eléctrico (de lo contrario su temperatura corporal bajará muy rápido, disminuyendo las posibilidades de recuperación) y asegurar su cuerpo en su lugar, fijando sus cuatro patas a los lados con cinta adhesiva. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante la comprobación de la pérdida de la respuesta a la estimulación refleja (por ejemplo, los pies o el pellizco de la cola con una presión firme).
2. Afeitarse la superficie abdominal y desinfectar con el iodophorpovidone-yodo (Braunoderm).
3. Hacer una incisión longitudinal (1 a 1,5 cm de largo) sobre la piel abdominal. Luego se corta el peritoneo. Coloque una gasa de algodón alrededor de la incisión. Hacer un cuerno uterino visible y tire de ella con cuidado con unas pinzas romas en la PBS-enjuagado gauze. Enjuague el útero con PBS muy a menudo para mantener siempre humedecido (Figuras 2A y 2B). Durante todo el procedimiento de evitar tirar la mesometrio o el útero apretado, ya que la presión dentro del útero transmitirá al embrión aumenta las posibilidades de pérdida de fluido de la inyección resulta en aborto.

4. Inyección de ADN en el ventrículo cerebral

1. Mantenga el útero de tal manera que los ventrículos del cerebro pueden ser visualizados. No cambiar la posición ampliamente un embrión que se encuentra en una posición desfavorable - esto sólo aumenta las posibilidades de aborto.
2. En cuanto a la cabeza del embrión a partir de la parte superior, localizar visualmente el hueco o fisura entre los hemisferios corticales izquierdo y derecho. Los hemisferios son fáciles de distinguir y los ventrículos laterales dentro de ellos (por no ser objetivo) por lo general pueden ser percibidas como formas un tanto oscuras. Si se encuentra un embrión a ser perfectamente orientada para la inyección de ADN (FigurES 2C y 2D), es posible perforar la pared uterina y entran en el tercer ventrículo a la vez. Mantenga la micropipeta de vidrio a 45 ° a la pared uterina y la punción que en el extremo rostral de la brecha entre los hemisferios corticales, penetrando por alrededor de 1 mm. De esta manera, la punta de la micropipeta de vidrio entrará en el tercer ventrículo del cerebro (no el ventrículo lateral) (Figuras 2C y 2D). En embriones de menos orientados favorablemente es útil primero perforar la pared uterina (siempre a 45 °) en la proximidad de la cabeza embrionaria, colocar la punta de la micropipeta en la posición correcta entre los hemisferios corticales y sólo entonces perforar el cerebro. Inyectar aproximadamente 1 l de solución de ADN en el tercer ventrículo (una buena inyección llena el ventrículo con el líquido verde). Repita el mismo procedimiento con todos los embriones de un cuerno uterino. Esto permite algún tiempo para que la solución de ADN para mezclar uniformemente con el fluido del ventrículo y llegar a la entirneuroepitelio correo.

5. Orientación por el hipotálamo para electroporación

1. Cambie el electroporador y ajuste la configuración según la edad embrionaria (por E12.5 usamos 5 pulsos de onda cuadrada, 50 V, 50 ms ON/950 mseg OFF). Uso como polo positivo del electrodo de aguja de acero inoxidable (CUY550-10) y como polo negativo de un electrodo plano y redondo (CUY700P4L). (Es importante que los electrodos son más pequeños que el embrión, ya que de lo contrario la corriente sólo fluye alrededor del embrión, pero no a través de él.)
2. Seleccionar para electroporación esos embriones cuya parte dorsal es hacia arriba (es decir, se volvió hacia el experimentador) (ya que la mayoría de ellos lo son), y descartar aquellos cuya orientación no es favorable. Ahora es seguro tocar al útero con los dedos etanol desinfectados o con guantes. Sosteniendo el útero con fórceps, sin embargo, podría interferir con el flujo de corriente durante la electroporación.
3. Pierce la pared uterina por la cabeza del embrión entre el amniotic saco y la placenta empujando hacia abajo a través de él con la punta del electrodo de aguja. Utilice el dedo índice de la otra mano, como bloque de empuje. Acerca de 5 mm de la punta del electrodo deben ser ahora entre el saco amniótico y la pared uterina, a aproximadamente el nivel del mesencéfalo (Figuras 2E y 2F). Recuerde que este es el "electrodo de orientación", por lo que su posición va a determinar qué es lo más probable que se transfectaron parte del neuroepitelio hipotálamo. El embrión tiene que ser muy suavemente "exprimido" entre los electrodos.
4. Con la otra mano, la posición del electrodo plano y redondo fuera de la pared del útero en el lado opuesto de la cabeza del embrión (Figuras 2E y 2G).
5. Utilice el interruptor de pedal para aplicar tensión (50 V, 50 mseg ON, 950 mseg OFF, 5 pulsos de onda cuadrada).
6. Tire lentamente el electrodo de aguja del útero mientras que la celebración posterior del útero con el dedo índice de la otra mano - si amniolíquido tic se pierde a través de la pared perforada, por lo general el embrión será sometido a aborto. Repita el procedimiento con todos los embriones.
7. Devuelva el cuerno uterino en el abdomen y repetir la inyección y la electroporación en el cuerno remanente.

6. Para terminar la operación

1. Después de la inyección y la electroporación de todos los embriones, colocar el útero en el abdomen con mucho cuidado, posicionada exactamente como eran antes y húmeda de la cavidad peritoneal con solución salina antes de cerrarlo.
2. Suturar el peritoneo con catgut quirúrgico (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Para el cierre de la utilización piel "interrumpió la puntada" methodwith una sutura más resistentes (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner A 07171L).
3. Desinfectar la superficie del abdomen con povidona yodada (Braunoderm) e inyectar un no-esteroides anti-inflamatorios por vía subcutánea (por ejemplo, 100 l de una solución de 1:10 de Rimadyl en NaCl al 0,9%) o, mejor aún, un opioide como buprenorphine (Temgesic, 0,05 a 0,1 mg / kg de peso corporal en 0,9% NaCl) para aliviar el dolor.
4. Retire la madre de la máquina de anestesia y colocarlo en una jaula que es calentada por una resistencia de calentamiento. Supervisar el ratón continuamente hasta que esté completamente recuperado de la anestesia. Más tarde, visita a los animales diariamente para asegurar que se están recuperando de un procedimiento sin ningún signo de infección o dolor.

7. El análisis de los resultados

1. Cosecha de los embriones (o postnatals) de acuerdo con el día de análisis deseado. Ratones postnatales (1 a 2 días de edad) se sacrificaron por decapitación.
2. Separar cada embrión de acuerdo con la anotación electroporación anterior. Diseccionar el cerebro bajo un estereomicroscopio y comprobar bajo el microscopio para la señal fluorescente verde (GFP del reportero) en la región apropiada.
3. El cerebro seleccionado puede ser analizada "fresco": fijar el tejido durante un corto período de tiempo en 4% de paraformaldehído y incrustar en agarosa al 4% o en una gelatina-lbumin, a continuación, la sección en un dispositivo de tipo vibratomo (Figura 3). Para el análisis inmunohistoquímico más detallada (Figura 4), ​​crio-proteger el cerebro en solución de sacarosa al 30%, incrustar en medio de montaje (OCT Tissue Tek) luego se corta secciones 20 micras en un criostato.

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Resultados

La mayoría de las neuronas del hipotálamo nacen entre E11.5 a E15.2, según el análisis de nacimiento-dating en la rata ²⁶ traducido en el desarrollo de algo más corta ratón ^27,28. El pico de la neurogénesis hipotálamo se alcanza a E12.5 ^29-31. En consecuencia, a la edad de transfección elegido para el presente estudio (E12.5), una gran proporción de neuronas hipotalámicas puede ser etiquetado en cualquier nivel rostro-caudal dado.

Análisis en E18....

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Discusión

Acerca de la anestesia: Desde electroporación en el útero en el hipotálamo puede ser técnicamente difícil y requerir tiempos más largos narcosis, preferimos para inducir y mantener la anestesia mediante la administración de una mezcla de oxígeno e isoflurano. En nuestra experiencia, los animales se mantienen adecuadamente anestesiado de esta manera por períodos de hasta una hora por lo menos, la recuperación de la madre es muy rápido, y la supervivencia de los embriones mejorar. Otros enfoques para l...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Acepromazine	Sanofi GmbH		anesthetic
Isoflurane	Baxter	HDG9623	anesthetic
Ketamin	Pharma GmbH		anesthetic
Fast Green	Fluka	44715
Rimadyl	Pfizer		non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm	Braun	3887138	povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS	Gibco	14190
Temgesic (buprenorphine)	Essex Pharma		opioid analgesic
Eye Ointment	Pan-Ophtal	7136926
Xylazine	Bayer
			EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia	ACN 004 903 682
Capillary puller P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Compresstome	Precisionary Instr.	VF-300	Vibratome-type device
Confocal Microscope	Zeiss	LSM700
Cryostat	Leica	CM3050S
Electroporator	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY21EDIT
Electrode 1	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY550-10	Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY700P4L	Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source	Leica	KL2500 LCD
Glass capillaries	Harvard Apparatus	GC120T-15	1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer	Fine Science Tools	FST250
Heating pad	Harvard Apparatus	py872-5272
Injection device	World Precision Instruments	Pneumatic Pico Pump PV820
Suture Thread Coated Vicryl	Ethicon	V4914	Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	Skin Suture