Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Zusammenfassung

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus, In utero Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für In utero Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Zusammenfassung

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Einleitung

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentator Hypothesen fast sofort zu testen, ohne die langen Wartezeiten, die für die Produktion von Maus-Mutanten.

Transfektion von DNA in sich entwickelnden Embryonen begann mit in ovo Elektroporation auf Hühnerembryonen ^1. Der wesentliche Proof-of-Concept für die Maus wurde in Kultur durchgeführt ^{2. Dies wurde bald von den ersten Beschreibungen der Technik auf der Maus in utero 3,4 gefolgt.}

Das Hauptproblem ist, das Gehirn des Embryos in der Gebärmutter entwickeln ohne sie zu töten oder die Mutter transfektieren. Lernen, um die notwendige Operation durchführen (Laparotomie, Injektion, die Elektroporation) erfordert eine lange Einarbeitungszeit. Sobald die Operation bis zu dem Punkt, wo der Embryo Überlebensverhältnis akzeptabel ist gemeistert, ist der nächste entscheidende Frage: Welche Hirnstrukturen zugänglich sind? Nicht überraschend, die ersten veröffentlichten Arbeiten zeigt erhaltenen Ergebnisse mit in utero Elektroporation auf die kortikale Entwicklung ^5-9 konzentriert. Dies ist immer noch für die meisten Veröffentlichungen mit dieser Technik gilt, da der Bereich der Entwicklung Gehirn der Maus am besten zugänglichen chirurgischen Eingriffen ist der Kortex (Abbildung 1). Das Verfahren für die in utero Elektroporation in der Hirnrinde wurde beschriebenprint ¹⁰ und in Video ^11-14. Eine Modifikation der Technik kann verwendet werden, um einen ventralen Teil des telencephalon, die Basalganglien ¹⁵ abzuzielen.

Jenseits der telencephalon ist das Zwischenhirn (klassisch in Thalamus und Hypothalamus geteilt) eine Region des Vorderhirns mehr schwer zu erreichen. Eine kleine Anzahl von Papieren Berichte Targeting seiner Rückenflosse und am leichtesten zugängliche Teil, der Thalamus ^16-19.

Der Hypothalamus ist die ventralen Teil des Vorderhirns, damit die einen lokalisierten am tiefsten von der dorsalen Fläche (cortex) (Abbildung 1). Diese Region bleibt eine schwierige Herausforderung für die Forscher verpflichtet genetisch zu manipulieren das Gehirn der Maus in der Gebärmutter. Nach unserem Wissen, berichten nur sehr wenige Artikel über die Ergebnisse der in utero Transfektion in der Maus Hypothalamus ^20,21. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung des Hypothalamus cannot überbewertet werden, da sie Verhaltensweisen wie Essen und Trinken, Paarung, Aufzucht und Erziehung ²² regelt. Darüber hinaus tragen Veränderungen in Hypothalamus Entwicklung im späteren Leben Erkrankungen wie Übergewicht, Bluthochdruck, Diabetes und vorzeitige Pubertät ²³ stammen. Die Möglichkeit, genetisch verändern die Hypothalamus während der Entwicklung würde ein sehr mächtiges Werkzeug, um es zu verstehen.

Die grundlegende chirurgische Protokoll für die Laparotomie von schwangeren Mäusen, die wir verwenden hier ist ähnlich wie in anderen Protokollen ^11,13,14,24 verwendet. Wir werden sie hier kurz beschreiben auf Vollständigkeit. Der Schlüssel zu unserem Verfahren, auf der anderen Seite, sind die Art der Anästhesie, der Ort der Injektion, die Art der Elektroden und das Einsetzen und Position der positiven Elektrode in bezug auf die Embryos Kopf. Wir bevorzugen zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Einatmen Gas über einfache intraperitoneale Anästhesie, seit der ehemalige ermöglicht dieetwas längere Narkose für eine schwierige Operation erforderlich. Isofluran Einatmen führt zu einer schnelleren Erholung von der Narkose, da in der Regel die Mutter zeigt ein normales Verhalten bereits Minuten nach der Operation. Die einfachste Punkt der Injektion der DNA-Lösung mit dem Glas-Mikropipette ist die laterale Ventrikel, was jedoch völlig ungeeignet Hypothalamus Elektroporation. Injektion direkt in den dritten Ventrikel ist in der Tat wichtig, tief Zwischenhirn Strukturen zielen. Es ist möglich, den Hypothalamus von E12.0 oder E12.5 mit Standard-, off-the-shelf Elektroden transfektieren. Wir haben einige der Elektroden durch Nepa Gene (Chiba, Japan) besonders zu diesem Zweck geeignet hergestellt gefunden.

Mit unserem Verfahren erhalten wir Transfektion des gesamten Hypothalamus Neuroepithel oder teilweise, je nach regionalen Transfektion Elektrode Orientierung. Hier zeigen wir die Technik, durch Transfektion der mammillary Körper, wohldie tiefste und Einbau aller Hypothalamus Kerne. Darüber hinaus zeigen wir detaillierte histologische Analyse der transfizierten Zellen auf der zellulären Ebene der Auflösung.

Ein Vergleich der in utero Elektroporation mit anderen Ansätzen zur Transfektion der Maus entwickelnde Gehirn in utero kann in der Diskussion Abschnitt gefunden werden.

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Protokoll

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion

1. Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut ^13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm "Trog" Filamente (Sutter Instrument FT330B). Die 2 mm Größe Filamente für uns weniger zufriedenstellende Ergebnisse lieferte. Auf der anderen Seite, hat Abschrägung des Mikropipettenspitzen nicht scheinen, um für uns zu verbessern.
2. Auflösen gereinigt endotoxinfreiem Plasmid-DNA in PBS (Zellkultur), die 0,1% Fast Green bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 2 pg / pl. Die Fast Green machen den injizierten Lösung sichtbar im embryonalen Hirn Ventrikel.
3. Legen Sie 10 ul der DNA-Lösung in die Glasmikropipette.
4. Schließen Sie das Glasmikropipette dem Einspritzsystem (Pico Pump) oder Mund Pipette.

2. Anästhesie

Vorbereiten des Operationstisches mit einem Heizkissen und der chirurgischen Instrumente. Schalten Sie die kalte Lichtquellen, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente mit zum Beispiel eine Glasperle Sterilisator.

Drei verschiedene Anästhesieverfahren sind für dieses Protokoll möglich (siehe Diskussion). Hier beschreiben wir die, die wir für die besten halte, mit Isofluran Inhalation für Narkose (Durchfluss 0,5 l / min) sowie die Wartung (Durchfluss 1 L / min).

1. Führen Sie die Maus schwanger in einem kleinen transparenten (so die Maus bleibt sichtbar) Behälter mit dem Komesaroff Mark 5 Narkosegerät durch eine kurze Rohrlänge.
2. Füllen Sie den Verdampfer mit Isofluran, öffnen Sie dann die Sauerstoff-Flasche an das Gerät angeschlossen. Brennen Sie eine oder zwei Impulse isoflUrane / Sauerstoff (0,5 L / min) in den Behälter mit der Maus und Uhr für Narkose um in.
3. Nehmen Sie die Maus aus, bedecken ihre Augen mit Salbe zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen und passen die Flow-Anästhesie-Maske auf den Kopf sofort.

3. Laparotomie

1. Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch nach oben Heizkissen (sonst seine Körpertemperatur sinken wird sehr schnell abnimmt Heilungschancen) und sichern ihren Körper in Ort durch die Festsetzung seiner vier Beine an den Seiten mit Klebeband. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose, indem für den Verlust der Reaktion auf Reflexstimulation (zB Zeh oder Schwanz Prise mit festem Druck).
2. Rasur der Bauchdecke und desinfizieren sie mit dem iodophorpovidone-Iod (Braunoderm).
3. Einen Längsschnitt (1 bis 1,5 cm lang) auf der Bauchhaut. Dann schneiden Sie das Bauchfell. Zeigen Baumwolle Gaze um den Einschnitt. Machen Sie einen Uterushorns sichtbar und ziehen Sie es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette auf die PBS gespült gauze. Spülen Sie die Gebärmutter mit PBS sehr oft, damit es immer angefeuchtet (2A und 2B). Während des gesamten Verfahrens zu vermeiden Ziehen des Mesometrium oder die Gebärmutter eng, da hohe Druck in der Gebärmutter für den Embryo Erhöhung der Chancen der Verlust von Flüssigkeit beim Einspritzen was Abtreibung übertragen wird.

4. DNA-Injektion in das Gehirn Ventrikel

1. Halten des Uterus in einer Weise, dass die Hirnkammern visualisiert werden kann. Nicht umfassend neu ein Embryo, der sich in einer ungünstigen Position liegt - das erhöht nur die Chancen der Abtreibung.
2. Ein Blick auf die Embryo Kopf von oben, die Lücke visuell lokalisieren oder Riss zwischen den linken und rechten kortikalen Hemisphären. Die Halbkugeln sind leicht zu unterscheiden und die lateralen Ventrikel in ihnen (nicht ins Visier genommen werden) können in der Regel als etwas dunkler Formen wahrgenommen werden. Wenn ein Embryo sich als optimaler Ausrichtung zur DNA-Injektion (Figures 2C und 2D), ist es möglich, die Gebärmutterwand durchstoßen und in die dritte Kammer auf einmal. Halten der Glas-Mikropipette auf 45 ° an der Gebärmutterwand und durchstechen am rostralen Ende des Spalts zwischen kortikalen Halbkugeln, dringt etwa 1 mm. Auf diese Weise wird die Spitze des Glas-Mikropipette wird in die dritte Ventrikel des Gehirns (nicht die lateralen Ventrikel) (2C und 2D). In Embryonen ungünstiger orientiert ist es sinnvoll, zunächst durchbohren der Gebärmutterwand (immer bei 45 °) in der Nähe des embryonalen Kopf, legen Sie die Mikropipettenspitze in die richtige Position zwischen den kortikalen Hemisphären und erst dann zu perforieren das Gehirn. Spritzen etwa 1 ul DNA-Lösung in den dritten Ventrikel (eine gute Injektion füllt die Ventrikel mit grünen Flüssigkeit). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Embryonen von einem Uterus Horn. Dies ermöglicht einige Zeit für die DNA-Lösung gleichmäßig zu mischen mit dem ventrikulären Flüssigkeit und erreichen die Zellstofe Neuroepithel.

5. Targeting der Hypothalamus für die Elektroporation

1. Schalten Sie das Elektroporator auf und passen Sie die Einstellungen entsprechend der embryonalen Alter (für E12.5 verwenden wir 5 Rechteck-Pulse, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Verwendung Pluspol der Edelstahl Nadelelektrode (CUY550-10) und als negativer Pol einer runden flachen Elektrode (CUY700P4L). (Es ist wichtig, dass die Elektroden kleiner als die Embryos sind, da sonst der Strom nur fließt, um den Embryo, aber nicht durch sie.)
2. Wählen Sie für die Elektroporation jene Embryonen, deren dorsalen Seite nach oben (dh wandte sich dem Experimentator) (wie die meisten von ihnen sind), und entsorgen Sie diejenigen, deren Ausrichtung ist nicht günstig. Jetzt ist es sicher, um die Gebärmutter mit Ethanol desinfiziert Finger oder mit Handschuhen berühren. Halten des Uterus mit einer Pinzette, würde jedoch der Stromfluss bei der Elektroporation stören.
3. Pierce die Gebärmutterwand durch das Embryonenschutzgesetz den Kopf zwischen dem amniotic sac und der Plazenta in Abstützung nach unten durch sie mit der Spitze der Nadelelektrode. Verwenden Sie den Zeigefinger der anderen Hand als Widerlager. Über 5 mm von der Elektrodenspitze muss nun zwischen der Fruchtblase und der Gebärmutterwand, etwa auf dem Niveau des Mittelhirns (2E und 2F). Denken Sie daran, dass dies das "Targeting Elektrode" ist, so wird seine Position zu bestimmen, welcher Teil des Hypothalamus Neuroepithel höchstwahrscheinlich transfiziert bekommen ist. Der Embryo muss sehr vorsichtig "gequetscht" zwischen den Elektroden.
4. Mit der anderen Hand, positionieren Sie den runden flachen Elektrode außerhalb der Gebärmutter Wand auf der gegenüberliegenden Seite des Embryos Kopf (2E und 2G).
5. Verwenden Sie den Fußschalter, um Spannung anzulegen (50 V, 50 ms ON, 950 ms AUS, 5 Rechteckpulse).
6. Langsam ziehen die Nadel-Elektrode aus der Gebärmutter, während die Gebärmutter wieder mit dem Zeigefinger der anderen Hand - wenn amniotic Flüssigkeit durch den durchlöcherten Wand verloren geht, in der Regel der Embryo unterziehen Abtreibung. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Embryonen.
7. Bringen Sie den Uterushorns in den Bauch und wiederholen Sie die Injektion und Elektroporation in den Überrest Horn.

6. Finishing der Chirurgie

1. Nach der Injektion und Elektroporation von allen Embryonen, legen die Gebärmutter wieder in den Bauch sehr sorgfältig, exakt positioniert, wie sie vor und feucht die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung vor dem Schließen waren.
2. Naht das Bauchfell mit Catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Für die Schließung der Haut Verwendung "unterbrochen Stich" methodwith ein beständiger Naht (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L).
3. Desinfizieren Sie die Bauch Oberfläche mit PVP-Jod (Braunoderm) und injizieren eine nicht-steroidalen entzündungshemmenden subkutan (z. B. 100 ul einer Lösung von 1.10 Rimadyl in 0,9% NaCl) oder, noch besser, ein Opioid wie buprenorphine (Temgesic, 0,05 bis 0,1 mg / kg Körpergewicht in 0,9% NaCl), um Schmerzen zu lindern.
4. Entfernen Sie die Mutter aus der Narkose Maschine und legen Sie sie in einem Käfig, die von einem Heizkissen erwärmt wird. Überwachen Sie die Maus ständig, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Später, überprüfen Sie die Tiere täglich um sicherzustellen, dass sie von dem Verfahren ohne Anzeichen einer Infektion oder Schmerzen erholt.

7. Analyse der Ergebnisse

1. Ernten der Embryos (oder postnatals) entsprechend der gewünschten Tag der Analyse. Postnatale Mäuse (1 bis 2 Tage alten) werden durch Enthauptung getötet.
2. Trennen jedes Embryo nach dem vorhergehenden Elektroporation Annotation. Präparieren Sie das Gehirn unter einem Stereomikroskop und überprüfen unter dem Mikroskop grün fluoreszierende Signal (von der GFP-Reporter) in die entsprechende Region.
3. Der ausgewählte Gehirn kann "frisch" analysiert werden: fix das Gewebe für eine kurze Zeit in 4% Paraformaldehyd und einbetten in Agarose 4% oder in Gelatine-albumin, dann auf einem Abschnitt Vibratom-Typ (Abbildung 3). Nähere immunhistochemische Analyse (Abbildung 4), Kryo-schützen das Gehirn in 30% Saccharose-Lösung, in OCT Eindeckmediums (Tissue Tek) einzubetten dann schneiden 20 um Abschnitte in einem Kryostaten.

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Ergebnisse

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte ²⁶ in die etwas kürzer Mausentwicklung ^27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 ^29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden.

Analyse bei E18.5 auf ...

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Diskussion

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfüg...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS
Acepromazine	Sanofi GmbH		anesthetic
Isoflurane	Baxter	HDG9623	anesthetic
Ketamin	Pharma GmbH		anesthetic
Fast Green	Fluka	44715
Rimadyl	Pfizer		non-steroidal anti-inflammatory
Braunoderm	Braun	3887138	povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBS	Gibco	14190
Temgesic (buprenorphine)	Essex Pharma		opioid analgesic
Eye Ointment	Pan-Ophtal	7136926
Xylazine	Bayer
			EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5	Medical Developments Australia	ACN 004 903 682
Capillary puller P-97	Sutter Instrument Co.	P-97
Compresstome	Precisionary Instr.	VF-300	Vibratome-type device
Confocal Microscope	Zeiss	LSM700
Cryostat	Leica	CM3050S
Electroporator	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY21EDIT
Electrode 1	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY550-10	Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2	Nepa Gene Co. Ltd.	CUY700P4L	Cover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light source	Leica	KL2500 LCD
Glass capillaries	Harvard Apparatus	GC120T-15	1. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizer	Fine Science Tools	FST250
Heating pad	Harvard Apparatus	py872-5272
Injection device	World Precision Instruments	Pneumatic Pico Pump PV820
Suture Thread Coated Vicryl	Ethicon	V4914	Peritoneal Suture
Suture Thr. Supramid	Serag Wiessner	TO07171L	Skin Suture