JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

למרות החשיבות הפונקציונלית ורפואית של ההיפותלמוס, ברחם מניפולציה גנטית של הפיתוח שלה כבר ניסה רק לעתים נדירות. אנחנו מראים נוהל מפורט ל ברחם Electroporation ליפותלמוס העכבר ותוצאות נציג מופע של transfection (אזורי) ההיפותלמוס המוחלט והחלקית.

Abstract

שינוי גנטי של אזורים מסוימים במוח היונקים הפיתוח הוא גישה ניסויית חזקה מאוד. עם זאת, יצירת מוטציות עכבר רומן היא לעתים קרובות מתסכל איטית. הוכח כי הגישה למוח העכבר מתפתח ברחם בהישרדות לאחר ניתוח סביר אפשרית. ובכל זאת, עם תוצאות הליך זה כבר דיווח כמעט אך ורק לחלק השטחי ביותר ונגיש של המוח המתפתח, כלומר את קליפת המוח. התלמוס, אזור צר יותר ויותר המדיאלי, הוכיח קשה יותר ליעד. Transfection לגרעינים עמוקים יותר, במיוחד אלה של ההיפותלמוס, הוא אולי כבר דיווח על התוצאות המאתגרות ביותר, ולכן מעטים מאוד. כאן אנו מדגימים הליך למקד neuroepithelium ההיפותלמוס כולו או חלק ממנו (אזורי ההיפותלמוס) לtransfection באמצעות electroporation. המפתחות לגישה שלנו הם יותר הרדמת פעמים, הזרקה בtתוכי חדר, ואדיב ומיקום של האלקטרודות מתאימים. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של מיקוד והניתוח היסטולוגית הבא של גרעין ההיפותלמוס השקוע ביותר, הגוף הפיטמתיים.

Introduction

מניפולציה גנטית של מוח העכבר העוברי היא גישה מועדפת כדי ללמוד על רגולציה התפתחותית. הדור של קווי עכבר מוטציה עם זאת הוא איטי ויקר. שיטה רב עוצמה אחד כדי להציג את השינויים גנטיים ספציפיים בפיתוח תאי עצב במוח היונקים היא electroporation ברחם. בעיקרו של דבר, הטכניקה מורכבת transfecting דנ"א לתוך neuroepithelium המוח העוברי באמצעות פולסים חשמליים, ולאחר מכן מאפשר לעובר לשרוד לתקופה מסוימת של זמן, לאסוף את המוח ולבחון אותם לרומן אפשרי, פנוטיפים אינפורמטיבי. בדרך זו, הנסיין יכול לבחון השערות באופן כמעט מיידי ללא תקופות המתנה הארוכות הנדרשות לייצור מוטציות עכבר.

Transfection של ה-DNA לעוברי מתפתחים התחיל עם ב electroporation אובו בעוברי 1 חומוס. הוכחה של הקונספט החיוני לעכבר בוצע בתרבות 2. זה היה זמן קצר אחריו את התיאורים הראשונים של הטכניקה על העכבר ברחם 3,4.

הבעיה העיקרית היא transfect המוח של עוברים מתפתחים ברחם בלי להרוג אותם או האם. למידה כדי לבצע את הניתוח הדרוש (laparotomy, זריקה, electroporation) דורשת תקופת הכשרה ארוכה. לאחר הניתוח כבר שולט לנקודה שבה יחס הישרדות העובר מקובל, שאלת המפתח הבאה היא: שהמבנים מוחיים נגישים? באופן לא מפתיע, את המסמכים הראשונים שפורסמו מראים תוצאות שהושגו עם electroporation ברחם מתמקדים בהתפתחות קליפת המוח 5-9. זה עדיין נכון עבור רוב הפרסומים באמצעות טכניקה זו, שכן האזור במוח העכבר מתפתח הנגיש ביותר לפרוצדורות כירורגיות הוא קליפת המוח (איור 1). ההליך לelectroporation ברחם לתוך קליפת המוח תוארבדפוס 10 ובוידאו 11-14. שינוי של הטכניקה יכול לשמש יעד חלק הגחון של telencephalon, גרעיני בסיס 15.

מעבר telencephalon, diencephalon (מחולק באופן קלאסי לתלמוס וההיפותלמוס) הוא אזור של המוח הקדמי יותר הקשה להגיע. מספר קטן של דיווחי ניירות מיקוד של חלק הגבי ונגיש ביותר שלו, התלמוס 16-19.

ההיפותלמוס הוא חלק הגחון ביותר של המוח הקדמי, ולכן אחד מקומי בצורה העמוקה ביותר מהמשטח הגבי (קליפת המוח) (איור 1). אזור זה עדיין מהווה אתגר קשה לחוקרים שביצעו כדי לתפעל את מוח העכבר ברחם מבחינה גנטית. למיטב ידיעתנו, רק מעט מאוד מאמרים מדווחים על התוצאות בtransfection הרחם אל ההיפותלמוס עכבר 20,21. עם זאת, חשיבותו התפקודית של canno ההיפותלמוסלא להיות מוגזם, שכן הוא מסדיר התנהגויות כמו אכילה ושתייה, חיזור, רבייה והורות 22. יתר על כן, שינויים בפיתוח ההיפותלמוס לתרום למקורן מאוחר יותר בתנאי חיים כמו השמנה, יתר לחץ דם, סוכרת ומפותחת לגיל התבגרות 23. היכולת לשנות גנטי ההיפותלמוס במהלך הפיתוח הייתי לספק כלי חזק מאוד כדי להבין את זה.

הפרוטוקול כירורגית הבסיסית לlaparotomy של עכברים הרה שאנו משתמשים כאן דומה לזה המשמש בפרוטוקולים אחרים 11,13,14,24. נתאר אותן כאן בקצרה לשלמות. מפתח להליך שלנו, לעומת זאת, הם הסוג של הרדמה, את מקומה של זריקה, הסוג של אלקטרודות והחדרה ומיקום של האלקטרודה החיובית ביחס לראשו של העובר. אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות שאיפת גז על פני הרדמה intraperitoneal פשוטה, שכן לשעבר מאפשריםתקופות ממושכות יותר של הרדמה נדרשות לניתוח קשה. תוצאות isoflurane משאיפת בהתאוששות מהירה יותר מהרדמה, שכן לרוב האם מדגים התנהגות נורמלית כבר דקות לאחר הניתוח. הנקודה הקלה ביותר של זריקה של פתרון ה-DNA עם micropipette הזכוכית היא החדר לרוחב, שעם זאת היא אינו מתאים לחלוטין ליפותלמוס electroporation. הזרקה ישירות בחדר השלישי היא אכן חיונית כדי למקד מבני diencephalic עמוקים. אפשר transfect ההיפותלמוס מE12.0 או E12.5 עם אלקטרודות סטנדרטיות, ה-off-מדף. מצאנו כמה אלקטרודות שיוצרו על ידי NEPA ג'ין (צ'יבה, יפן) המתאימים במיוחד למטרה זו.

עם ההליך שלנו אנו מקבלים transfection של neuroepithelium ההיפותלמוס השלם או החלקית transfection האזורית, בהתאם לאורינטציה של האלקטרודה. כאן אנו מדגימים את הטכניקה על ידי transfecting הגוף הפיטמתיים, ללא ספקהעמוק ביותר והשקוע ביותר של כל גרעיני ההיפותלמוס. בנוסף, אנו מציגים ניתוח היסטולוגית מפורט של תאי transfected עד לרמה התאית של רזולוציה.

ניתן למצוא השוואה של electroporation ברחם עם גישות אחרות לtransfecting המוח המתפתח העכבר ברחם בסעיף הדיון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנה של ה-DNA וזכוכית Micropipettes להזרקה

  1. micropipettes זכוכית באיכות טובה הם חיוני כדי להפחית את שיעור הפלות גבוה ראשוני עקב אובדן של מי שפיר. ההליך למשוך micropipettes הזכוכית תועד 13,18,25 היטב. השתמשו בקוטר 1.2 מ"מ נימים משך בסאטר קונבנציונלי P-97 מכשיר עם ההגדרות P = 500; חום = 300; משוך = 40; מהירות = 50; זמן = 50. להתאים את חולץ עם 3 מ"מ חוטים "שוקת" (סאטר Instrument FT330B). את 2 חוטי מ"מ הגודל הניבו עבורנו תוצאות פחות משביעות רצון. מצד השני נראה, beveling של הטיפים micropipette לא כדי לשפר את התוצאות עבורנו.
  2. ממיסים מטוהר ה-DNA, ללא רעלן פנימי פלסמיד ב PBS (כיתה תרבית תאים) המכילה 0.1% מהיר גרין לריכוז סופי של 1 עד 2 מיקרוגרם / μl. גרין המהיר יהפוך את הפתרון המוזרק לעין בחדר המוח העוברי.
  3. טען 10 μl של פתרון ה-DNA לתוך micropipette הזכוכית.
  4. חבר את micropipette הזכוכית למערכת ההזרקה (פיקו משאבה) או פיפטה בפה.

2. הרדמה

הכן את השולחן כירורגית עם כרית חימום ואת מכשירי הניתוח. הפעל את מקורות האור קר כדי להקל על ההדמיה של העוברים. לחטא את הכלים כירורגיים באמצעות למשל מעקר חרוז זכוכית.

שלוש פרוצדורות הרדמה שונות אפשרית עבור פרוטוקול זה (ראה דיון). כאן אנו מתארים את אחד אנו רואים את הטוב ביותר, תוך שימוש בשאיפת isoflurane לזירוז הרדמה (קצב זרימה 0.5 ליטר / דקה), כמו גם התחזוקה (ליטר / דקה קצב זרימת 1).

  1. להציג את העכבר בהריון במכל קטן שקוף (כך העכבר נשאר גלוי) מחובר למכשיר ההרדמה Komesaroff מארק 5 באורך של צינורות קצרים.
  2. מלא את מכשיר האדים עם isoflurane, ואז לפתוח את בקבוק החמצן המצורף למכשיר. לפוצץ פולסים אחת או שניים של isoflurane / חמצן (0.5 ליטר / דקה) לתוך המכל מחזיק את העכבר ולצפות להרדמה להגדיר פנימה
  3. קח את העכבר, מכסה את עיניו עם משחה כדי למנוע מהם מהתייבשות ולהתאים את מסכת זרימת ההרדמה על ראשו באופן מיידי.

3. Laparotomy

  1. מניחים את עכבר בטן על כרית החימום (אחרת טמפרטורת הגוף שלו תרד מהר מאוד, ומקטין את סיכויי החלמה) ולאבטח את הגוף שלו למקומו על ידי תיקון ארבע רגליו לצדדים עם קלטת. להעריך את עומק ההרדמה על ידי בדיקה לאובדן של תגובה לגירוי רפלקס (למשל הבוהן או קמצוץ זנב עם לחץ חזק).
  2. לגלח את משטח הבטן ולחטא אותו עם iodophorpovidone יוד (Braunoderm).
  3. לעשות חתך אורכי (עוד 1 עד 1.5 ס"מ) בעור הבטן. ואז לחתוך את הצפק. הנח גזה כותנה סביב החתך. הפוך את קרן רחם אחת לעין ולמשוך אותו החוצה בזהירות עם מלקחיים בוטים על gauz PBS והשטףדואר. שטוף את הרחם עם PBS לעתים קרובות מאוד לשמור עליו תמיד הרטיב (איורים 2 א ו -2). במהלך ההליך כולו להימנע ממשייכת mesometrium או הרחם צר, שכן בתוך הרחם בלחץ גבוה ישדר לעובר להגדיל את הסיכויים של אובדן הנוזלים וכתוצאה מכך על זריקת הפלה.

4. הזרקת DNA לתוך חדר המוח

  1. להחזיק את הרחם בצורה כזו שהחדרים במוח יכולים להיות דמיינו. לא בהרחבה האם למקם את עובר שנמצאת בעמדה שלילית - זה מגדיל את הסיכוי של הפלה בלבד.
  2. כאשר מסתכל על ראשו של העובר מלמעלה, בתרגום חזותי פער או הסדק בין שני חצאים קליפת המוח השמאליים וימניים. האונות הן קלה להבחין וחדרים לרוחב בתוכם (שלא להיות ממוקד) יכולים בדרך כלל להיתפס כצורות מעט כהות יותר. אם עובר נמצא להיות מכוון בצורה מושלמת להזרקת ה-DNA (Figures 2C ו 2D), זה אפשרי כדי לחדור את דופן הרחם ולהיכנס לחדר השלישי ובעונה אחת. החזק את micropipette הכוס ב 45 מעלות לקיר ולנקב אותו בסוף מקורי של הפער בין ההמיספרות בקליפת המוח הרחם, לחדור לכ 1 מ"מ. בדרך זו קצה micropipette הזכוכית ייכנס לחדר השלישי של המוח (לא חדר לרוחב) (איורים 2 ג ו 2D). בעוברים פחות נוחה בכיוון זה שימושי הראשון פירס דופן הרחם (תמיד על 45 מעלות) בסביבתו של הראש העוברי, מקום קצה micropipette במיקום הנכון בין שני חצאים קליפת המוח, ורק לאחר מכן לנקב את המוח. הזרק על μl 1 של פתרון ה-DNA לתוך החדר השלישי (זריקה טובה ממלאת את החדר בנוזל ירוק). חזור על אותו התהליך עם כל העוברים של קרן רחם אחד. זה מאפשר קצת זמן לפתרון ה-DNA כדי לערבב באופן שווה עם נוזל חדרית ולהגיע entirneuroepithelium הדואר.

5. מיקוד היפותלמוס לElectroporation

  1. לעבור electroporator ובלהתאים את ההגדרות בהתאם לגיל העוברי (לE12.5 אנו משתמשים 5 פולסים מרובעים גל, 50 V, 50 אלפיות השני ON/950 אלפיות OFF). השתמש כקוטב חיובי האלקטרודה מחט הנירוסטה (CUY550-10) וכקוטב שלילי האלקטרודה עגולה ושטוחה (CUY700P4L). (חשוב שהאלקטרודות הם קטנות יותר מאשר את העובר, שכן אחרת הנוכחי פשוט זורמת סביב העובר, אבל לא דרכו.)
  2. בחר עבור electroporation אותם העוברים הגבי צד הוא למעלה (כלומר פנה הנסיין) (כמו רובם), ולמחוק את אלה שנטייה שלו היא לא חיובי. עכשיו זה בטוח לגעת ברחם עם אצבעות אתנול חיטוי או עם כפפות. מחזיק את הרחם עם מלקחיים, לעומת זאת, הייתי מפריע לזרימה של זרם במהלך electroporation.
  3. פירס דופן הרחם על ידי ראשו של העובר בין א.מ.נ.השק iotic ושליה על ידי דחיפה כלפי מטה דרכו עם הקצה של האלקטרודה המחט. השתמש באצבע המורה של היד השנייה כמקשה דחף. בערך 5 מ"מ של קצה האלקטרודה חייב להיות עכשיו בין השק מי השפיר ודופן הרחם, בערך ברמה של המוח התיכון (איורים 2E ו2F). זכור כי זה "מיקוד אלקטרודה", כך עמדתו תהיה לקבוע איזה חלק מההיפותלמוס neuroepithelium הוא הסיכוי טוב ביותר להשיג transfected. העובר צריך להיות בעדינות רבה "סחט" בין האלקטרודות.
  4. עם מצד השני, עמדת האלקטרודה העגולה והשטוחה מחוץ לקיר הרחם בצד השני של ראשו של העובר (2E ו 2G דמויות).
  5. השתמש במתג הדוושה כדי להחיל מתח (50 וולט, 50 אלפיות שנייה ON, 950 אלפיות השני OFF, 5 פולסים מרובעים גל).
  6. לאט לאט למשוך את האלקטרודה המחט מחוץ לרחם תוך מתאפק הרחם עם אצבע המורה של היד השנייה - אם בדיקה מי שפירנוזל הטיק הולך לאיבוד דרך הקיר המנוקב, בדרך כלל את העובר יעבור הפלה. לחזור על התהליך עם כל העוברים.
  7. להחזיר את קרן הרחם לתוך הבטן ולחזור על ההזרקה וelectroporation בצופר השריד.

6. גמר הניתוח

  1. לאחר ההזרקה וelectroporation של כל העוברים, הצב את הרחם בחזרה לתוך הבטן בזהירות רבה, ממוקם בדיוק כפי שהיו לפני ולח חלל הצפק עם מי מלח לפני שתסגרו אותו.
  2. תפר את הצפק עם מיתר כירורגית (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). לסגירתו של שימוש עור "קטע את התפר" methodwith תפר עמיד יותר (ניילון Supramid, 6-0, Serag Wiessner ל07171L).
  3. לחטא את משטח הבטן עם povidone-יוד (Braunoderm) ולהזריק ללא סטרואידים אנטי דלקתי תת עורי (לדוגמה: 100 μl של פתרון 1:10 Rimadyl ב0.9% NaCl) או, אפילו טוב יותר, כמו אופיואידים buprenorphine (Temgesic, 0.05-0.1 משקל גוף מ"ג / ק"ג ב0.9% NaCl) כדי להקל על כאב.
  4. הסר את האמא מהמכונה ההרדמה ולמקם אותו בכלוב אשר מחומם על ידי כרית חימום. לפקח על העכבר ללא הרף עד שהוא התאושש לגמרי מההרדמה. בשלב מאוחר יותר, לבדוק את החיות היומיות כדי להבטיח שהם מתאוששים מההליך ללא כל סימן לזיהום או כאב.

7. ניתוח התוצאות

  1. לקצור את העוברים (או postnatals) לפי היום הרצוי של ניתוח. עכברים לאחר לידה (יום 1 עד 2 ישן) הם נהרגו על ידי עריפת ראש.
  2. הפרד כל עובר על פי ביאור electroporation הקודם. מנתחים את המוח תחת stereomicroscope ולבדוק מתחת למיקרוסקופ לאות פלואורסצנטי ירוקה (GFP מהכתב) באזור המתאים.
  3. המוח שנבחר יכול להיות מנותח "טרי": לתקן הרקמות לזמן קצר בparaformaldehyde 4% ולהטביע ב% agarose 4 או בג'לטיןlbumin, ולאחר מכן חלק על מכשיר vibratome סוג (איור 3). לניתוח מפורט יותר immunohistochemical (איור 4), cryo-להגן על המוח בפתרון saccharose 30%, להטביע בהרכבה בינונית אוקטובר (רקמות Tek) לאחר מכן לחתוך את 20 סעיפי מיקרומטר בcryostat.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

רוב הנוירונים היפותלמוס נולדים בין E11.5 לE15.2, על פי ניתוח היכרויות לידה בעכברוש 26 מתורגמים לפיתוח עכבר 27,28 הקצר יותר במקצת. השיא של neurogenesis ההיפותלמוס הוא הגיע בE12.5 29-31. בהתאם לכך, בגיל transfection נבחר למחקר הנוכחי (E12.5), יכול להיות מתויג בחלק גדול של תאי עצב ה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לגבי ההרדמה: מאז electroporation ברחם ליפותלמוס יכול להיות מבחינה טכנית מפרך ודורש פעמים הרדמה ארוכות יותר, אנחנו מעדיפים לשמור על הרדמה ולגרום באמצעות ממשל מתערובת של חמצן וisoflurane. מניסיוננו, חיות יכולות להישאר כראוי מורדמות בדרך זו לתקופות של עד שעה אחת לפחות, ההתאושש...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי קרן המחקר הגרמני (דויטשה Forschungsgemeinschaft).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
 REAGENTS
AcepromazineSanofi GmbHanesthetic
IsofluraneBaxterHDG9623anesthetic
KetaminPharma GmbHanesthetic
Fast GreenFluka44715 
RimadylPfizernon-steroidal anti-inflammatory
BraunodermBraun3887138povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBSGibco14190 
Temgesic (buprenorphine)Essex Pharmaopioid analgesic
Eye OintmentPan-Ophtal7136926 
XylazineBayer 
 EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5Medical Developments AustraliaACN 004 903 682 
Capillary puller P-97Sutter Instrument Co.P-97 
CompresstomePrecisionary Instr.VF-300Vibratome-type device
Confocal MicroscopeZeissLSM700 
CryostatLeicaCM3050S 
ElectroporatorNepa Gene Co. Ltd.CUY21EDIT 
Electrode 1Nepa Gene Co. Ltd.CUY550-10Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2Nepa Gene Co. Ltd.CUY700P4LCover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light sourceLeicaKL2500 LCD 
Glass capillariesHarvard ApparatusGC120T-151. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizerFine Science ToolsFST250 
Heating padHarvard Apparatuspy872-5272 
Injection deviceWorld Precision InstrumentsPneumatic Pico Pump PV820 
Suture Thread Coated VicrylEthiconV4914Peritoneal Suture
Suture Thr. SupramidSerag WiessnerTO07171LSkin Suture

References

  1. Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).
  2. Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation. Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).
  3. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).
  4. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
  5. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice. J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).
  7. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling. Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).
  8. Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
  9. Shimogori, T., Grove, E. A. Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation. J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).
  10. Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).
  11. Dixit, R., et al. Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).
  12. Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons. J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).
  13. Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (6), e239(2007).
  14. Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos. J. Vis. Exp. (6), e236(2007).
  15. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).
  16. Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern. Front Neurosci. 6, 27(2012).
  17. Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection. J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).
  19. Vue, T. Y., et al. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
  20. Tanaka, S., et al. Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).
  21. Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).
  22. Canteras, N. S. The Mouse Nervous System. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).
  23. Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus. Horm. Res. 64, 222-230 (2005).
  24. Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).
  25. Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. A Mouse Model of in Utero Transplantation. J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).
  26. Altman, J., Bayer, S. A. The Development of the Rat Hypothalamus. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).
  27. Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105, 7-17 (2001).
  28. Clancy, B., et al. Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans. Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).
  29. Ishii, Y., Bouret, S. G. Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice. Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).
  30. Karim, M. A., Sloper, J. C. Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus. J. Anat. 130, 341-347 (1980).
  31. Shimada, M., Nakamura, T. Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei. Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).
  32. Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions. Neural. Dev. 7, 4(2012).
  33. Vann, S. D., Aggleton, J. P. The mammillary bodies: two memory systems in one. Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).
  34. Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos. Genesis. 37, 12-17 (2003).
  35. Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).
  36. Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection. Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).
  37. Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).
  38. Xin, H., et al. The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles. Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).
  39. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
  40. Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus. Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).
  41. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
  42. Londrigan, S. L., et al. Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets. Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience77diencephalonTransfectionelectroporation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved