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要約

視床下部の機能や医療の重要性にもかかわらず、子宮内遺伝子操作はほとんど試みられていない。私たちは、の詳細な手順を示す子宮内マウスの視床下部へのエレクトロポレーションと合計と部分（地域）視床下部のトランスフェクションの代表的な結果を示しています。

要約

開発哺乳類の脳の特定の領域の遺伝子組み換えは非常に強力な実験的なアプローチです。しかし、小説のマウス変異体を生成することはしばしばいらいら遅いです。これは、合理的なポスト手術用生存率と子宮内現像マウスの脳へのアクセスが可能であることが示されている。それでも、この手順と結果は脳の発達の最も表面的かつ簡単にアクセスできる部分はほぼ全面的に報告されており、皮質、すなわち 。視床、狭く、より内側の領​​域は、ターゲットへのより困難であることが判明しました。特に深い核、視床下部のものへのトランスフェクションは、最も困難なので、非常にいくつかの結果が報告されているかもしれないです。ここでは、全体の視床下部の神経上皮またはエレクトロを通じてトランスフェクションのためにその一部を（視床下部の領域）が対象とする手順を示しています。我々のアプローチの鍵は、長い昏睡回、T中の注射ですhird心室、適切な種類と電極の位置。さらに、我々はターゲティング最も凹ん視床核、乳頭体のその後の組織学的分析の結果を示す。

概要

マウス胎児の脳の遺伝子操作が発達規制について学ぶために好ましいアプローチである。変異マウス線の生成は、しかし遅く、高価である。哺乳類の脳の神経細胞の開発に特定の遺伝的変化を導入する一つの有力な方法は、 子宮内エレクトロポレーションである。本質的に、この技術は、胚は、一定時間生き残る脳を収集し、可能な新規な、有益な表現型のためにそれらを調べることができ、その後、電気的パルスによって胚脳の神経上皮へのDNAのトランスフェクションから構成される。この方法では、実験者は、マウス変異体の生産に必要な長い待機期間なしでほとんど即座仮説をテストすることができます。

発展途上胚へのDNAのトランスフェクションは、ニワトリ胚1上のOVOエレクトロポレーションで始まりました。マウスに不可欠な概念実証は、文化の中で行われたまで。これは、すぐに子宮内 3,4 でマウスの技術の最初の説明が続いた。

主な問題は、それらまたは母を殺すことなく、 子宮内での開発の胚の脳をトランスフェクトすることです。必要な手術（開腹、インジェクション、エレクトロポレーション）を実行するために学ぶことは、長い訓練期間を必要とします。手術が胚の生存率が許容できるポイントに習得された後、次の重要な問題は、次のとおりです。脳構造がアクセス可能である？驚くことではないが、 子宮内エレクトロポレーションで得られた結果を示した最初の論文は、皮質開発5-9に焦点を当てた。外科的処置に最もアクセス現像マウス脳の領域が皮質（ 図1）であるので、これは、この技術を用いて出版物のほとんどは依然として当てはまる。皮質に子宮内エレクトロポレーションでの手順が記載されているプリント10とビデオ11〜14インチ技術の変更が終脳の腹側部分、大脳基底核15を標的するために使用することができる。

終脳を超えて、間脳は（古典的視床と視床下部に分けて）に到達することがより困難脳の領域である。その背と最もアクセス部分、視床16-19の標的論文·レポートの数が少ない。

視床下部は、脳の中で最も腹側部分であるので、1背面（皮質）（ 図1）から最も深くローカライズ。この領域は、遺伝的に子宮内でマウスの脳を操作することを約束し研究者のための困難な課題である。我々の知る限りでは、ごく少数の記事では、マウスの視床下部20,21に子宮内トランスフェクションの結果を報告する。しかし、視床下部cannoの機能的重要性それは食べたり飲んだり、交配、繁殖と子育て22のような行動を規制するため、T、誇張すること。また、視床下部の開発の変化は、肥満、高血圧、糖尿病、思春期早発症23のような生活条件の後半発信に貢献しています。開発中に遺伝的に視床下部を変更することができることは、それを理解するための非常に強力なツールを提供するでしょう。

我々はここで使用している妊娠マウスの開腹するための基本的な外科的プロトコルは、他のプロトコル11,13,14,24で使用されているものと似ています。私たちは、完全を期すためにここで簡単にそれらを記述します。我々の手順の鍵と、他方では、麻酔のタイプ、注入の代わりに、電極の種類や挿入および胚の頭部に対する正電極の位置である。前者は可能にするため、我々は、単純な腹腔内麻酔上ガス吸入による麻酔を誘導し、維持することを好む難しい手術に必要な麻酔のやや長い期間。麻酔からの迅速な復旧にイソフルラン吸入結果、通常、母親は既に手術後の分を通常の動作を示しているので。ガラスマイクロピペットでDNA溶液を注入するための最も簡単な点は、しかし、視床下部のエレクトロポレーションのために完全には不向きである側脳室、です。直接第三脳室に注入は確かに深い間脳構造を標的とすることが重要です。標準の、既製の電極にE12.0またはE12.5から視床下部をトランスフェクトすることができる。私たちは、特にこの目的に適してNEPAジーン（千葉県、日本）によって製造された電極の一部を発見した。

私たちの手順では、我々は全体の視床下部神経上皮や電極の向きに応じて部分的な、地域のトランスフェクションのトランスフェクションを得る。ここで我々は間違いなく、乳頭体をトランスフェクトすることによって技術を実証深いとすべての視床核の最も凹んだ。さらに、我々は、解像度の細胞レベルにトランスフェクションされた細胞の詳細な組織学的分析を下に示す。

子宮内でマウスの脳の発達をトランスに他のアプローチと子宮内エレクトロポレーションでの比較は考察の項に記載されています。

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プロトコル

1。注射用DNAとガラスマイクロピペットの作製

  1. 良質のガラスマイクロピペットは、羊水の損失のために初期高い流産率を減少させるために不可欠です。ガラスマイクロピペットを引っ張るための手順は、よく13,18,25を文書化されています。ヒート= 300;; 1.2ミリメートル径の毛細管を使用し、設定P = 500と従来のサターでP-97のデバイスを引っ張っ= 40を引いて、速度= 50;時間= 50。 3ミリメートル "トラフ"フィラメント（サッタートゥルFT330B）でプーラーを取り付けます。 2ミリメートル径フィラメントは私たちのために少なく満足のいく結果が得られている。一方、マイクロピペットの先端を面取りすると、私たちのために結果を改善していないようです。
  2. 1から2μgの/μlに最終濃度0.1％ファストグリーンを含むPBSで精製し、エンドトキシンフリーのプラスミドDNA（細胞培養グレード）に溶解する。ファストグリーンは、胚の脳室に注入された目に​​見える解決策を作ります。
  3. ガラスマイクロピペットへのDNA溶液10μlをロードします。
  4. 噴射システム（ピコポンプ）や口のピペットにガラスマイクロピペットを接続します。

2。麻酔

加熱パッドや手術器具で手術台を準備します。胚の可視化を容易にするために、冷光源をオンにします。例えばガラスビーズ滅菌器を使用した手術器具を消毒する。

三つの異なる麻酔手順は、（説明を参照）は、このプロトコルのために可能です。ここで我々は麻酔導入（流量0.5 L /分）と同様のメンテナンス（流量1リットル/分）のためにイソフルラン吸入を使用して、最善を考えるものを説明します。

  1. チューブの短い長さによってKomesaroffマーク5麻酔デバイスに接続されている（そのため、マウスが表示されたまま）、透明の小さな容器に妊娠しているマウスをご紹介します。
  2. イソフルランを気化器を満たし、その後、デバイスに接続されている酸素ボンベを開きます。 isoflの1つまたは2つのパルスを吹くurane /麻酔が入って設定するためのマウスと時計を保持する容器への酸素（0.5L /分）
  3. マウスを取り出し、乾燥からそれらを防ぐために、すぐに頭に流れ麻酔マスクに適合するように軟膏との目をカバーしています。

3。開腹

  1. 加熱パッド（そうでなければ、その体温が回復の可能性を減少させる、非常に高速に下がるだろう）上に腹マウスを置き、テープで側面に4つの足を固定することにより、所定の場所に、その本体を固定します。反射刺激（しっかり圧例えばつま先またはテールピンチ）への応答の損失のためにチェックすることによって、麻酔の深さを評価する。
  2. 腹部の表面を剃るとiodophorpovidone-ヨウ素（Braunoderm）でそれを消毒。
  3. 腹部皮膚上の縦切開（1〜1.5センチメートル長い）を作る。その後、腹膜を切った。切開の周り綿ガーゼを置きます。 1子宮角が見えるようにし、PBS-すすぎgauzに鈍ピンセットで慎重にそれを引き出し電子。非常に多くの場合、それは常に（ 図2Aおよび2B）湿ら保つためにPBSで子宮を洗浄します。全体の手順の間に子宮内部の高い圧力が中絶になり注射により流体の損失の可能性を増加胚に送信しますので、タイトな子宮間膜や子宮を引っ張って避けてください。

4。脳室へのDNAインジェクション

  1. 脳室を可視化することができるような方法で子宮を保持する。広範囲に不利な立場にある胚の位置を変えてはいけない - これが唯一の中絶の可能性が高くなります。
  2. 上部から胚の頭を見て、視覚的に左右の皮質半球間のギャップや亀裂をローカライズ。半球は区別することが容易であり、それらの内側側脳室は（対象としないように）通常はやや暗めの形状として認識することができます。胚（FIGUR DNA注射のために完全に配向させることが判明した場合ES 2C及び2D）、それが貫通する子宮壁可能であり、一度に第三脳室に入る。約1mmのために貫通、皮質半球間のギャップの吻側終わりに子宮壁と穿刺それに45°のガラスマイクロピペットを保持します。このようにして、ガラスマイクロピペットの先端は、脳（ではない側脳室）（ 図2Cおよび2D）の第三脳室に入ります。それは胚の頭部の近傍で最初貫く子宮壁（常に45°）に便利です不利指向の胚では、皮質半球の間に正しい位置にマイクロピペットの先端を配置し、だけにして脳を穿孔。第三脳室（良い注射が緑流体で心室を埋める）にDNA溶液を約1μLを注入します。 1子宮ホーンのすべての胚と同じ手順を繰り返します。これは、DNA溶液を、心室流体で均等に混ぜるとentirに到達するためのいくつかの時間を可能にします電子神経上皮。

5。エレクトロポレーションのための視床下部を標的

  1. にエレクトロを切り替えて胚年齢（E12.5のために我々は5方形波パルスを使用し、50 V、50ミリ秒ON/950ミリ秒OFF）に応じて設定を調整します。正極として、ステンレス製の針電極（CUY550-10）を使用し、負極ラウンドフラット電極（CUY700P4L）として。 （電流だけでなく、それを介して胚の周りを流れそうでないので、それは、電極胚よりも小さいことが重要である。）
  2. エレクトロポレーションのために、その背側（それらのほとんどがあるように）（ つまり、実験者の方を向いて）アップしているそれらの胚を選択して、その方向性に有利で ​​はないものを捨てる。これは、エタノール消毒指で、または手袋を子宮に触れても安全です。鉗子で子宮を持って、しかし、エレクトロポレーション時の電流の流れを妨げる。
  3. ピアースAMNの間に胚の頭で子宮壁針電極の先端とそれを介して下方へ突き出すことによりiotic嚢と胎盤。スラストブロックとしてもう一方の手の人差し指を使用してください。電極先端の5mm程度は中脳（ 数字は2Eと2F）の程度のレベルで、羊膜嚢と子宮壁との間で今でなければなりません。これは "ターゲット電極"であることを忘れないので、その位置は、トランスフェクトされ得る可能性が最も高い視床下部の神経上皮のどの部分を決定します。胚は非常に優しく、電極間に "圧迫"されなければならない。
  4. 一方、位置と胚の頭（ 図2Eと2G）の反対側の子宮壁の外側ラウンドフラット電極。
  5. 電圧（50 V、50ミリ秒ON、950ミリ秒OFF、5方形波パルス）を適用するためにペダルスイッチを使用します。
  6. もう一方の手の人差し指で子宮をバック保持しながらゆっくりと子宮の針電極を引き出します - もしamnioチック液がパンクした壁を通して失われ、通常胚は妊娠中絶を受けることになる。すべての胚との手順を繰り返します。
  7. 腹部に子宮ホーンを返し、残りの角の注射およびエレクトロポレーションを繰り返します。

6。手術を終えて

  1. すべての胚の注入とエレクトロポレーションした後、彼らはそれを閉じる前に生理食塩水で腹腔前と湿っていたとおりに正確に配置され、非常に慎重に腹部に子宮を後ろに置きます。
  2. 手術腸線（VICRYLポリグラクチン910、5-0、エチコンV4914）で腹膜を縫合。肌用の閉鎖methodwithより耐性縫合（Supramidナイロン、6-0、Serag Wiessner 07171L TO） "ステッチが中断"。
  3. ポビドンヨード（Braunoderm）と腹部の表面を消毒し、非ステロイド皮下抗炎症（ 例えば 、0.9％NaCl中Rimadyl 1:10の溶液100μl）、または、より良い、BUのようなオピオイドを注入prenorphine（Temgesic、0.9％NaCl中0.05〜mg / kg体重）痛みを緩和する。
  4. 麻酔マシンから母親を外し、加熱パッドにより加熱されるケージに入れてください。それは完全に麻酔から回復されるまで、継続的にマウスを監視します。その後、感染症や痛みの兆候なしで、彼らはプロシージャから回復して保証するために、毎日動物を確認してください。

7。結果の分析

  1. 分析の希望日に応じて胚（またはpostnatals）収穫。出生後のマウス（1から2日齢）を断頭により殺される。
  2. 以前エレクトロ注釈によると、すべての胚を分離。実体顕微鏡下で脳を解剖して、適切な地域の緑色蛍光シグナル（GFPレポーターから）のために顕微鏡下で確認してください。
  3. 選択された脳は、 "新鮮"を分析することができます：4％パラホルムアルデヒド中で短い時間のために組織を固定し、アガロース4％またはゼラチンで埋め込むlbumin、その後ビブラトーム型デバイス上のセクション（ 図3）。より詳細な免疫組織化学的分析のために（ 図4）、10月マウンティング培地（ティッシュテック）に埋め込 ​​む30％ショ糖溶液を、脳を凍結保護はその後クライオスタットで20μmのセクションをカット。

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結果

ほとんどの視床下部のニューロンはやや短いマウス開発27,28に翻訳ラット26で出生デートの分析によると、E11.5 E15.2の間に生まれています。視床下部の神経発生のピークはE12.5 29-31に到達する。そこで、本研究（E12.5）のために選択されたトランスフェクションの年齢で、視床下部ニューロンの大部分は、任意の与えられた吻側 - 尾レベルでラベルを付けることができま...

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ディスカッション

麻酔について：視床下部に子宮内エレクトロポレーションでは技術的に困難であると長い麻酔時間を必要とすることができるので、我々は、酸素とイソフルランの混合物を投与することにより麻酔を誘導し、維持することを好む。我々の経験では、動物は少なくとも1時間までの期間について、このように適切に麻酔残ることができ、母親の回復は非常に高速であり、胚の生存率...

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開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

この作品は、ドイツ研究協会（ドイツ学術振興）によって賄われていた。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
 REAGENTS
AcepromazineSanofi GmbHanesthetic
IsofluraneBaxterHDG9623anesthetic
KetaminPharma GmbHanesthetic
Fast GreenFluka44715 
RimadylPfizernon-steroidal anti-inflammatory
BraunodermBraun3887138povidone-iodine
Phosphate Buffer Saline PBSGibco14190 
Temgesic (buprenorphine)Essex Pharmaopioid analgesic
Eye OintmentPan-Ophtal7136926 
XylazineBayer 
 EQUIPMENT
Anaesthetic Device Komesaroff Mark-5Medical Developments AustraliaACN 004 903 682 
Capillary puller P-97Sutter Instrument Co.P-97 
CompresstomePrecisionary Instr.VF-300Vibratome-type device
Confocal MicroscopeZeissLSM700 
CryostatLeicaCM3050S 
ElectroporatorNepa Gene Co. Ltd.CUY21EDIT 
Electrode 1Nepa Gene Co. Ltd.CUY550-10Stainless Steel Needle Electrode, 10 mm-Tip, 0. 5 mm diam.
Electrode 2Nepa Gene Co. Ltd.CUY700P4LCover Round Platinum Plate 4 mm diameter
Fiberoptic cold light sourceLeicaKL2500 LCD 
Glass capillariesHarvard ApparatusGC120T-151. 2 mm O.D. x 0. 94 mm I.D.
Glass bead sterilizerFine Science ToolsFST250 
Heating padHarvard Apparatuspy872-5272 
Injection deviceWorld Precision InstrumentsPneumatic Pico Pump PV820 
Suture Thread Coated VicrylEthiconV4914Peritoneal Suture
Suture Thr. SupramidSerag WiessnerTO07171LSkin Suture

参考文献

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