Neural Circuito de grabación de una cucaracha sistema nervioso intacto

Resumen

En este artículo se describe la disección cordón nervioso ventral cucaracha y grabaciones extracelulares del nervio cercal y conectivas. Respuestas evocadas se generan por la estimulación eléctrica del nervio cercal o estimulación mecánica directa de la Cerci.

Resumen

La preparación cordón nervioso ventral cucaracha es un sistema manejable para experimentos neuroetología, modelado de redes neuronales, y probar los efectos fisiológicos de los insecticidas. Este artículo describe el alcance de las modalidades sensoriales de cucarachas que se pueden utilizar para someter a ensayo cómo un sistema nervioso de los insectos responde a las perturbaciones ambientales. El énfasis aquí está en la conducta de escape mediada por cercos de transmisión de fibra gigante en Periplaneta americana. Esta preparación in situ sólo requiere de habilidad y experiencia de disección moderada electrofisiológico para generar grabaciones reproducibles de la actividad neuronal. Los péptidos u otros reactivos químicos a continuación, se pueden aplicar directamente al sistema nervioso en solución con la solución salina fisiológica. Los insecticidas también pueden ser administradas antes de la disección y el circuito de escape pueden servir como un proxy para el estado excitable del sistema nervioso central. En este contexto, los ensayos descritos en el presente documento también serían útiles para ros investigadores interesados ​​en la regeneración de las extremidades y la evolución del desarrollo del sistema nervioso para que P. americana es un organismo modelo establecido.

Introducción

Hay más de 4.000 especies de cucarachas, pero sólo alrededor del 30 son plagas domésticas. Tal vez el más reconocido es el mal llamado cucaracha americana Periplaneta americana que se originó en África, y ahora se encuentra en casi todas partes del planeta. Además de su rápida velocidad de carrera ¹ y el comportamiento evasivo, en el trópico P. americana es capaz de ^2,3 de vuelo.

Las características predominantes del sistema nervioso central cucaracha (SNC) son su naturaleza segmentada y la descentralización del control de procesos de ^4,5. El cerebro, torácica, abdominal y ganglios están unidos por conectores interganglionic emparejados para formar el cordón nervioso ventral (VNC).

Los ganglios en cada segmento están integrando centros. Ellos se componen de una región exterior, cortical que contiene células responsables de la permeabilidad de la barrera sangre-cerebro, justo debajo de ellos, y la somas de las neuronas oriNating en que ganglio. Estos cuerpos celulares pueden pertenecer a las interneuronas, neuronas moduladoras, o neuronas motoras. Suministran axones que quedan dentro del ganglio de origen (interneuronas locales), o axones que se proyectan entre los ganglios del sistema nervioso central (interneuronas interganglionic) o que terminan en las células del músculo periférico (neuronas motoras). La mayoría de los cuerpos celulares se sitúan ventral o ventrolateralmente en la corteza ganglionar ^5. Los pares, conectivas interganglionic sólo contienen axones y no hay cuerpos de células neuronales.

El neuropil de un ganglio contiene células gliales (neuroglia), tractos de axones, haces de axones y dendritas, (neuritas) de las neuronas. El neuropil carece de cuerpos de células neuronales. Esta es la región en el ganglio donde ocurre la comunicación sináptica directa entre las células nerviosas y la integración de los insumos.

La capacidad de la cucaracha americana P. americana de detectar y de repente responder a un depredador que se acerca (de pie, de hanD, etc.) se ha atribuido a un circuito de reflejo que consiste en la Cerci y ^6,7 gigante sistema de fibra. Los cercos son un par de estructuras sensibles al viento como cuernos situados en el extremo del abdomen (Figura 1). En P. americana de la superficie ventral de cada cercus contiene alrededor de 200 filiformes (rosca) pelos que se organizan en 14 columnas. Nueve de estas columnas se pueden identificar de forma consistente en diferentes animales de acuerdo con las propiedades de respuesta de la célula asociada al receptor y el axón. Cada pelo está en un zócalo que permite que se doble más fácilmente en un plano que es específico de la columna. Movimiento del pelo en una dirección a lo largo de su plano induce una despolarización en la célula receptora y una ráfaga de potenciales de acción (AP) en la neurona sensorial. El movimiento en la dirección opuesta inhibe cualquier APs espontáneos en curso ^8. El plano preferido de deflexión y la direccionalidad de la respuesta es diferente en cada columna. Por lo tanto, la filiforcomplejos m pelo de los receptores son responsables no sólo de detectar el movimiento del aire, sino también para 'codificar', en forma de puntos de acceso, la dirección desde la que se originó la corriente de aire. El procesamiento de esta información por parte del SNC da como resultado una "apropiada" respuesta de escape ^6,7. Esta especificidad funcional, columnar de los pelos sensoriales se conserva de animal a animal.

La célula receptora de cada pelo filiforme es responsable de la transducción de la deflexión mecánica del cabello en un evento neuronal (que resulta en una explosión o la inhibición de los puntos de acceso en el axón de la célula del receptor ^9. Los puntos de acceso viajan al ganglio abdominal terminal (A6) a través de cercal XI nervio, donde hacen sinapsis con los axones gigantes del cordón nervioso ventral (VNC). Los axones gigantes se cree que son responsables de la transmisión y la posterior excitación de las neuronas motoras que se traduce en un comportamiento de escape ^6,10,11.

La latencia de comportamiento Of la respuesta de escape de P. americana es uno de los más cortos de cualquier animal ^7. Latencia del comportamiento es el tiempo entre la llegada de un estímulo a un mecano y la iniciación de una respuesta de escape. En experimentos con la cinematografía de alta velocidad para registrar el intento de fuga de un sapo de atacar, se observó la cucaracha para comenzar su vez lejos del sapo en unos 40 ms (tiempo de comienzo de extensión lengua para cucarachas movimiento ^7,12. Usando bocanadas de viento controladas , la latencia de comportamiento se podría reducir a 11 mseg. Otros experimentos revelaron que una velocidad de soplo de viento mínima de 12 mm / ms (con una aceleración de 600 mm / mseg ²⁾ puede evocar una respuesta de escape, mientras que las velocidades aún más bajos (3 mm / seg) causada cucarachas para detener móvil ^{de 12} caminando lentamente.

La fuerte correlación que normalmente existe entre los sistemas de fibras gigantes y comportamiento de escape ha sido bien documentada ^13,14. En instances donde es necesario y suficiente para evocar un comportamiento en particular una célula particular, la célula se conoce como una neurona del sistema ^15,16. Interneuronas gigantes (IG) en el circuito de escape viento de P. americana no son necesarios para el reflejo. Los animales que han ablacionadas experimentalmente IG todavía exhiben el comportamiento de escape, por tanto, estos soldados no se consideran las neuronas comando ^17,18. La ruptura de conectivas cervicales que son rostral al circuito sensoriomotor también influye en el comportamiento, lo que indica que la entrada descendente desde el cerebro tiene un efecto en la dirección de escape ^19. Estos aspectos de un control preciso y la redundancia son de suma importancia para la supervivencia del organismo y se complementan con la modulación neuroquímica mediante aminas biógenas ^20.

El P. preparación cordón nervioso americana ha sido un modelo de sistema elegante para neuroethologists durante las últimas décadas a partir de los trabajos pioneros de Roeder ^{21. Se permite a los estudiantes para registrar, mostrar y analizar la actividad sensorial primaria y las respuestas resultantes de las interneuronas gigantes para su 22,23,24 entrada. Además de transmitir la idea de que los circuitos neuronales identificables subyacen a las respuestas de comportamiento en el medio ambiente, estos ejercicios deberían inculcar el aprecio por las contribuciones biológicas realizadas por esta plaga común de la casa.}

Protocolo

1. Disección

Solución salina Cucaracha utilizado en todo este protocolo tiene la siguiente composición:

Solución salina Cucaracha ^36: (gramos por 100 ml)
210 mM de NaCl (1,227 g)
2,9 mM de KCl (0,0216 g)
1,8 mM de CaCl ₂ (0,0265 g)
0,2 mM NaH ₂ PO ₄ • 2H ₂ O (0,0032 g)
1,8 mM Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O (0,0483 g)
(PH 7.2. Ajustar el pH con NaOH 1 M o HCl 1 M).

1. Seleccionar una cucaracha macho del tanque de retención que tiene cercos robusta (Figura 1). Los últimos segmentos del macho son estrechas en comparación con el sexo femenino, y que no contiene ovarios y masa de huevos, los machos son más fáciles de diseccionar. Los machos de P. americana tienen un par de estiletes corto entre la cercos. Estos lápices ópticos no se observan en las hembras.
2. Cortar las alas, las patas y la cabeza y el pin del cuerpo, ventral hacia arriba, a una dish forrado con elastómero de silicona.
3. Con unas pinzas recogen las placas ventrales y quienes las cortan con tijeras finas, comenzando en el extremo posterior y el trabajo anterior. Siempre mantenga los órganos internos húmeda con solución salina al tratar de mantener el cercos seco. Uno puede usar cera o piezas de goma para colocar los arriba abdomen para evitar que la solución salina de mojar la cercos. Si no se mojan, séquelos con un trozo de papel de seda. Empuje a un lado los órganos internos y la sustancia blanca (grasa corporal). El VNC es en el centro del campo, corre a lo largo del abdomen y debe ser visible entre las tráqueas brillante. El cordón nervioso es translúcido y puede ser inicialmente difícil de ver hasta que la iluminación está ajustado correctamente (Figura 2). NO manipule el VNC con fórceps o pins de insectos, sino manipularlo utilizando sondas de vidrio.
4. Despejar sistema de tráqueas de los animales de la mejor manera posible a partir del cordón nervioso con fórceps y con un par de necesidad vidrio finoles, dividió con mucho cuidado las conectivas VNC longitudinalmente entre A6 y A5 o A5 y A4 ganglios (Figura 3). Cuna del cercos y el abdomen hacia arriba fuera del baño de solución salina con alfileres de insectos acortados y la cera o una cuña de elastómero de silicona que se puede cortar para adaptarse a la preparación (Figuras 4A y B). Tenga mucho cuidado en el último segmento abdominal de no dañar los nervios Cercal que se proyectan en el ganglio (Figuras 2D y 5).

2. Registro extracelular

1. El aparato de preparación, microscopio, y la grabación diseccionado debe ser configurado dentro de una jaula de Faraday para bloquear particularmente de CA, campos externos, eléctricos que podría invalidar señales de las neuronas (Figura 6).
2. Coloque el microscopio de modo que es con vistas a la platina del microscopio. Una vez que la preparación se coloca en el escenario, ajuste la posición del haz de iluminación de alta intensidadpara una visualización óptima de la misma.
3. Conecte el amplificador diferencial AC / DC a la unidad de registro de datos integrado (información sobre la configuración de hardware y software específicos han sido previamente descrito ^25). La etapa de la cabeza que sostiene un electrodo de succión debe ser conectado al amplificador. Un cable de tierra de plata que ha sido recubierto con Cl ^- insertado en los resultados abdomen en grabaciones más estables. La razón es que si la solución en la cavidad del cuerpo no está en contacto con el fluido de baño en el plato, el fluido asociado con el electrodo de registro permanece conectado a tierra.
4. Establezca la frecuencia de grabación de 4 kHz. Establecer la escala de tensión (eje y) a 500 mV (esto se puede ajustar para optimizar la visualización de la traza). Ejecutar el software de grabación en el modo continuo o un osciloscopio para registrar la actividad neuronal en respuesta a estímulos.
5. Cortar una de las conectivas VNC cerca de A5 y colocar el extremo cortado unido a A6 en un electrodo de succión. Asegúrese de pull solución salina en el electrodo de succión para cubrir el alambre de plata en su interior antes de chupar en el nervio.
6. Con un golpe de aire seco en la pipeta a los pelos situados en cada cercus. A ver si la estimulación de los pelos en el ipsilateral cercus al conectivo registrado da una respuesta diferente a la contralateral. Tomar nota de la amplitud de las respuestas y el número de picos en un intervalo de tiempo dado durante la estimulación.
7. Mueva el electrodo de succión a un nervio cercal para la grabación. Para conseguir un mejor ajuste, cambie a una punta del electrodo con una apertura más pequeña si es necesario.
8. Cortar el nervio cerca cercal a A6 y luego aspirar el nervio que conduce a la cercus. No debe haber activación espontánea de los potenciales de acción. Ahora, soplar aire en el Cerco y anote las respuestas.

3. La estimulación eléctrica de los nervios sensoriales para determinar Reclutamiento

1. Cambiar el software de grabación en el modo de barrido para que grabe los rastros (100-500 msec). cada vez que un estímulo se activa.
2. Conectar el electrodo de estimulación a la salida del estimulador.
3. Conecte el cable del estimulador con los dos cables mini-ganchos o clips.
4. Conecte la salida de disparo BNC del estimulador de la entrada de disparo de la unidad de grabación.
5. Los siguientes parámetros de estimulación deben evocar una respuesta: Duración: 0,3 seg; retardo: 10 ms; frecuencia: 1 Hz; Voltaje: ajustar según sea necesario para obtener una señal en las grabaciones (justo por encima del umbral y ser capaz de obtener una respuesta máxima). No hay razón para ir a voltajes mucho más altos que el umbral máximo para la contratación como un alto voltaje puede ser perjudicial para el nervio.
6. Cortar el nervio cercal como distal posible para que una raíz nerviosa de largo se puede tirar en el electrodo de succión estimulante (Figura 7, punta de flecha). El conectivo entre A6 y A5 o otro segmento más anterior se puede utilizar.
7. Ajuste el electrodo de succión de grabación para que pueda pull una conjuntivo cortado en el electrodo. Asegúrese de tirar un poco de solución salina en los electrodos de succión para cubrir el alambre de plata en su interior antes de chupar en los nervios. Asegúrese de que el electrodo de estimulación también se basa en la solución salina baño (en el abdomen cerca A3 es ideal).
8. Entregar una serie de estímulos individuales de aumento de la tensión hasta que aparezca un potencial de acción en la pantalla. Hay que hacer un registro de la tensión estimulante mínima y duración de reclutar una respuesta. Aumentar la intensidad hasta que se observe una respuesta sináptica en las conectivas. El gran pico (puntos de acceso extracelulares) de los axones gigantes aparece primero, y luego otra más pequeña de AP también se puede observar.

Resultados

La estimulación de los pelos de la cercos por una bocanada de aire hace que las descargas de las neuronas sensoriales primarias que se pueden grabar usando electrodos de aspiración extracelular conectados ya sea a conectivas entre ganglios abdominales o el propio nervio cercal (Figura 8). Amplitudes de Spike grabadas de las dos regiones están en el orden de varios micro-voltios a milivoltios. Debido a la integración sensorial en el ganglio de la cantidad de picos observados en el potencial de acción compuesto o como picos individuales grabadas desde el nervio cercal es notablemente mayor que la observada en las grabaciones de las conectivas. Sin embargo también en cuenta que no es sustancialmente menor ruido en la grabación en el conectivo debido al sello más apretado entre el electrodo y el tejido nervioso.

Por soplar aire a los grandes picos Cerci se puede observar en las conectivas (Figura 8A). El uso de este método estimulante, grabaciones entre A3 y A4 típica ly mostrar una gran característica pico del interneuronas gigantes (s). Grabación desde un nervio cercal mientras físicamente frotando la cercos con pinzas produjo una fuerte busto de actividad (Figura 8B _1). En otra grabación, 2 bocanadas de aire cada produjeron una respuesta rápida que revienta en el nervio cercal (Figura 8B _2). Cuando se estimula eléctricamente el nervio cercal con un electrodo de succión y la grabación en el conectivo entre A3 y A4, se puede observar un umbral en la estimulación de respuestas evocadas (Figura 8C _1). La estimulación eléctrica del nervio cercal provoca claramente una respuesta en términos de enlace que se puede cuantificar para los estudios de manipulación con agentes farmacológicos o rodea el local del medio ambiente, como la temperatura (Figura 8C _2).

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Figura 1. Periplaneta americana con cercos intacta.

Figura 2. Vista ventral del cordón nervioso de cucarachas como se ve con la cutícula ventral eliminado (A). Una vista ampliada del segmento se indica por las flechas se ve en (B). En (C) las conectivas se derramaron entre A4 y A3 con una sonda de vidrio. El ganglio abdominal 6 ^ª se muestra en (D) con los dos nervios Cercal dejando en el extremo caudal.

Figura 3. Vista ventral esquemática del cordón nervioso cucaracha.

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Figura 4. Los cercos se colocan hacia arriba fuera del baño de solución salina. Los abdomen abiertos pueden ser inundadas con solución salina (A) con el extremo caudal de la cucaracha de ser elevado con una pequeña pieza en forma de cuña de elastómero de silicona con el fin de mantener la cercos cabo del baño (B).

Figura 5. La 6 ^ª ganglio abdominal con el nervio cercal (que se señala con flechas).

Figura 6. El equipo configurado. Haga clic aquí para ver la larfigura ger.

Figura 7. Estimulante e electrodo de registro establecidos.

Figura 8. Grabaciones neurales de los conectivos y el nervio cercal con diversos procedimientos de estimulación. Grabación con un electrodo de succión de las conectivas entre A3 y A4, mientras que soplar aire en la Cerci (A). Grabación de las neuronas Cercal primarias con un electrodo de succión mientras sea físicamente frotando (B ₁₎ o la prestación de bocanadas de aire (B ₂₎ resulta en explosiones rápidas de la actividad en el nervio cercal. La estimulación eléctrica del nervio cercal produce respuestas en conectivas ( C _1). Tenga en cuenta el aumento gradual de la intensidad de la estimulación (las flechas indican la amplitud de la artefacto estimulante) y la intensidad de las siguientes respuestas evocadas. La estimulación eléctrica del nervio cercal proporciona un medio relativamente más controladas de estimular el nervio cercal para la consistencia en la estimulación para la cuantificación de las respuestas (C _2).

Discusión

Una de las razones para la exposición de técnicas para esta preparación clásica es que el sistema de cercos ha sido y sigue siendo un área activa de investigación en el tratamiento de las cuestiones de desarrollo de circuitos neuronales, así como cuestiones relativas a la reparación sináptica y regeneración ^26-31. Cualquiera de los métodos de evocar la actividad en el cordón nervioso ventral cucaracha puede ser utilizado para examinar los efectos de los agentes farmacológicos o insecticidas en la función del sistema nervioso. Estos experimentos se realizan por simple disolución de productos químicos neuroactivos en solución salina. Después de intercambiar esta solución con el medio baño normal, cambios en la actividad evocada o espontánea se pueden observar durante la grabación de conectivas o un nervio motor para dar una lectura coherente de los efectos del producto químico sobre la función del SNC.

Como en todos los experimentos neurofisiológicos un problema común es el ruido eléctrico. Probablemente el mayor factor en la calidad de señal para estos preparados is el sello electrodo de succión en el tejido nervioso. Un sello hermético que no llama por completo en el nervio cercal o conectivo es ideal. Las grabaciones también se pueden hacer con electrodos de gancho doble colocados bajo el cordón nervioso y el aislamiento de la VNC con una mezcla de aceite mineral y vaselina. La mezcla se puede cargar en una jeringa y expulsado alrededor del cordón del nervio ^32. También una disección cuidadosa es tan crítico aquí como en cualquier preparación del SNC. Algunos pueden encontrar más fácil el acceso al SNC mediante la disección de la cutícula dorsal. Mientras que esto reduce la posibilidad de dañar el cordón nervioso ventral puede ser más difícil de eliminar todas las vísceras utilizando este enfoque.

No se describe aquí, pero esta preparación es susceptible de registro intracelular en las interneuronas gigantes ^32,33. El cordón nervioso entero también se puede quitar para acomodar varios electrodos de registro y estimulante al mismo tiempo. De hecho la exploración del lóbulo antenal, bo setasdy, y otras estructuras del SNC anterior está todavía en curso ^34-35. Mientras que la cucaracha CNS sigue arrojar luz sobre la investigación neurobiológica moderna esta preparación particular es lo suficientemente simple para ser utilizado en laboratorios académicos de pregrado.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sylgard	Dow Corning	182 silicone kit	182 silicone elastomer kit
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
NaH2PO4•2H2O	Sigma-Aldrich	71505
Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaOH	Sigma-Aldrich	221465	To adjust pH
HCl	Sigma-Aldrich	H1758	To adjust pH
Material Name
Dissecting tools	World Precision Instruments	assortment
Insect Pins	Fine Science Tools, Inc	26001-60
Dissecting microscope	World Precision Instruments	PZMIII-BS
Glass electrodes	Sigma-Aldrich	CLS7095B5X	Box of 200, suction electrodes
Micromanipulator	World Precision Instruments	MD4-M3-R	Can fix for base or on a metal rod
Silver wire (10/1,000 inch)	A-M Systems	782500
Computer	any company
AC/DC differential amplifier	A-M Systems	Model 3000
PowerLab 26T	AD Instruments	27T
Head stage	AD Instruments		Comes with AC/DC amplifier
LabChart7	AD Instruments
Electrical leads	any company
Glass tools	make yourself		For manipulating nerves
Cable and connectors	any company
Pipettes with bulbs	Fisher Scientific	13-711-7	Box of 500
Beakers	any company
Wax or modeling clay	any company or local stores
Stimulator	Grass Instruments	SD9 or S88
Plastic tip for suction electrode	local hardware store (Watt's brand)	¼ inch OD x 0.170 inch ID	Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.