신경 회로 녹화 본래대로 바퀴벌레 신경계에서

요약

이 문서에서는 바퀴벌레 복부 신경 코드 해부 cercal 신경과 connectives에서 세포 녹음을 설명합니다. 유발 반응은 cercal 신경 또는 cerci 직접 기계적 자극의 전기 자극에 의​​해 생성됩니다.

초록

바퀴벌레 복부 신경 코드 준비 neuroethology 실험, 뉴럴 네트워크 모델링 및 살충제의 생리적 효과를 테스트하기위한 시스템에 온순하다. 이 문서에서는 곤충 신경계 환경 교란에 응답하는 방법을 분석 실험하는 데 사용할 수있는 바퀴벌레의 감각 양식의 범위를 설명합니다. 여기에서 강조 Periplaneta 아메리의 거대한 섬유 전송에 cerci에 의해 매개 탈출 행동입니다. 이 현장 준비에 신경 활동의 재현 기록을 생성하는 유일한 적당한 해부 기술과 전기 생리학 전문 지식을 필요로합니다. 펩티드 또는 다른 화학 시약은 생리 식염수 용액에 신경 시스템에 직접 적용 할 수있다. 살충제는 해부하기 전에 투여 될 수 있고 탈출 회​​로는 중추 신경계의 흥분성 상태 프록시 역할을 할 수있다. 이러한 맥락에서 본원에 기재된 분석법은 또한 R에 유용 할 것이다사지의 재생 및 신경 시스템 개발의 진화에 관심이 esearchers하는 대한 P. 아메리 설립 모델 생물이다.

서문

거기에 4,000 개 이상의 바퀴벌레 종은 만 30 가정용 해충이다. 아마도 가장 인정 아프리카에서 유래 이름을 잘못 부른 미국의 바퀴벌레 Periplaneta 아메리이며, 지금은 거의 모든 곳에서 지구상에서 발견된다. 열대의 빠른 실행 속도 ^1과 회피 행동 외에도 P. 아메리 비행 ^2,3 할 수있다.

바퀴벌레 중추 신경계 (CNS)의 주된 특성은 컨트롤의 분할 자연과 지방 분권은 ^4,5를 처리합니다. 뇌, 흉부, 복부 신경은 복부 신경 코드 (VNC)을 형성 한 쌍이 절간 connectives에 의해 함께 결합된다.

각 세그먼트의 신경이 센터를 통합하고 있습니다. 그들은 그들 아래 뇌 혈관 투과성 배리어에 대해 책임 세포를 포함하는 외측 피질 영역 및 뉴런 origi의 인 somata 구성된다그 신경절에 출력용 스위치. 이러한 인 somata은의 interneurons, 조절 성 신경 또는 운동 신경에 속할 수 있습니다. 그들은 원산지 (지역 interneuron의)의 신경절 내에서 유지 축삭, 또는 CNS (절간의 interneurons)의 신경 또는 그 주변 근육 세포 (운동 뉴런)에 종료 사이에 프로젝트 축삭을 공급한다. 대부분의 인 somata은 신경절 피질 ⁵ 배쪽으로 또는 ventrolaterally 위치한다. 쌍, 절간 connectives은 축삭없이 신경 세포 기관을 포함한다.

신경절의 neuropil는 아교 세포 (neuroglia), 축삭 책자, 축삭의 번들 및 신경 세포의 수상 돌기 (신경 돌기)가 포함되어 있습니다. neuropil는 신경 세포 기관은없는 것입니다. 이 신경 세포와 입력 통합 간의 직접적인 통신이 발생할 시냅스 신경절 내의 영역이다.

미국 바퀴벌레 P.의 능력 (발, 한을 감지하고 갑자기 접근하는 포식자에 대응하기 아메리D, 등.) cerci 거대한 섬유 시스템 ^6,7로 구성된 반사 회로에 기인하고있다. cerci 복부의 끝 (그림 1)에있는 뿔처럼, 바람에 민감한 구조의 쌍입니다. P.에서 아메리 각 cercus의 복부 표면은 약 200 사상 (실), 14 열으로 구성되어 머리카락이 포함되어 있습니다. 이러한 열의 아홉은 지속적으로 관련 수용체 세포와 축삭의 응답 특성에 따라 다른 동물에서 확인 할 수있다. 각 머리는 열 고유 한 평면에 가장 쉽게 구부릴 수있는 소켓입니다. 그 평면을 따라 한 방향으로 머리의 움직임 수용체 세포의 탈분극 및 감각 신경 세포에서 활동 전위의 버스트 (APS)을 유도한다. 반대 방향으로 운동이 진행중인 자연 AP에 ^8을 억제한다. 응답의 편향과 방향성의 바람직한면은 각 열에서 다릅니다. 따라서, filiform 머리 - 수용체 착물은 공기의 움직임을 검출하기위한 AP들뿐만 아니라, 공기 흐름이 시작된 방향의 형태로, '코딩'에 대한뿐만 책임진다. CNS하여이 정보의 처리는 '적절한'탈출 응답 ^6,7 발생합니다. 감각 머리카락이 기능, 원주, 특이도는 동물에서 동물로 유지됩니다.

각 사상 머리의 수용체 세포는 수용체 세포의 축삭 ⁹ AP를 버스트 또는 억제의 결과로 신경 이벤트 (에 머리의 기계적 변형을 형질 도입에 대한 책임이 있습니다.의 AP는 cercal를 통해 터미널 복부 신경절 (A6)에 여행 그들은 복부 신경 코드 (VNC)의 거대한 축삭과 시냅스 신경 XI는. 거대한 축삭은 탈출 행동 ^6,10,11 결과 운동 신경의 전송 이후 여기에 대한 책임을 것으로 생각됩니다.

행동 대기 오P.의 탈출 응답 F 아메리 어떤 동물 ^(7)의 짧은 중 하나입니다. 행동 지연 mechanoreceptor에서 자극의 도착과 탈출 반응의 시작 사이의 시간입니다. 공격 두꺼비에서 시도 된 탈출을 기록하는 고속 촬영을 사용하여 실험에서 바퀴벌레가 이동 ^{7,12 바퀴벌레} 혀 확장의 시작에서 약 40 밀리 초 (시간 거리에 두꺼비에서의 회전을 시작하는 것으로 관찰되었다. 제어 바람 퍼프를 사용하여 , 행동 대기 시간이 11 밀리 초를 줄일 수있다. 다른 실험을하는 동안 더 낮은 속도 (3 월 / (밀리 600mm / ^2의 가속도) / 밀리 12mm의 최소 바람 퍼프 속도가 탈출 반응을 불러 일으킬 수있는 것으로 나타났습니다 초) 천천히 ^{12 이동을} 중지하는 바퀴벌레 걷기가 발생했습니다.

일반적으로 거대한 섬유 시스템 및 탈출 행동 사이에 존재하는 강한 상관 관계가 아니라 ^{13, 14을} 기록하고있다. 이달의특정 셀이 필요하고 특정 동작을 연상시키기에 충분하다 동시에 사용은 셀 커맨드 뉴런 ^{15,16이라고한다.} P.의 바람 탈출 회로 거인의 interneurons (GIS) 아메리 반사에 필요하지 않습니다. 실험적으로 병사를 절제 한 동물은 여전히 탈출 행동 때문에 이러한 병사는 명령 뉴런 ^{(17, 18)로} 간주되지 않습니다을 나타낸다. 감각 회로 주동이 아르 자궁 connectives를 절단하는 것이 또한 뇌에서 입력을 내림차순 것은 이스케이프 ^(19)의 방향에 대한 효과가 있음을 나타내는 동작에 영향을 미친다. 미세 제어 및 이중화의 이러한 측면은 유기체의 생존에 중요하고 생체 아민 ^(20)을 통해 신경 화학적 변조에 의해 보완된다.

P. 아메리 신경 코드의 준비는 위 Roeder <의 선구적인 작업부터 시작하여 지난 수십 년에 걸쳐 neuroethologists에 대한 우아한 모델 시스템이다> 21 일 저녁을 먹다. 그것은 그들의 입력 ^22,23,24에 거인의 interneurons로 기본 감각 활동과 그 결과 응답을 기록, 표시 및 분석 할 학생들을 허용합니다. 식별 신경 회로가 환경에 대한 행동 반응의 기초가 있다는 생각을 전달하는 것 외에도,이 운동이 일반 가정 해충에 의해 생물학적 기여 감사를 주입해야합니다.

프로토콜

1. 해부

이 프로토콜에서 사용 바퀴벌레 식염수 용액은 다음 조성을 갖는다 :

바퀴벌레 식염수 ³⁶ : (100 ML에 대한 그램)
210 mM의 염화나트륨 (1.227 g)
2.9 밀리미터의 KCl (0.0216 g)
1.8 mM의 _염화칼슘 (0.0265 g)
0.2 밀리미터의 NaH ₂ PO ₄ • 2H ₂ O (0.0032 g)
1.8 밀리미터 나 ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O (0.0483 g)
(pH가 7.2. 1 M 수산화 나트륨 또는 1 M HCl로 산도를 조정).

1. 강력한 cerci (그림 1)가 저장 탱크에서 남성 바퀴벌레를 선택합니다. 남성의 마지막 세그먼트는 여성에 비해 좁고, 그리고 난소와 산란 량 더를 포함하지 않는, 남성은 해부하기 쉽다. P.의 남성 아메리 cerci 사이의 짧은 스타일러스의 한 쌍있다. 이 스타일러스는 여성에서 관찰되지 않습니다.
2. 날개, 다리와 머리를 잘라 디에 몸 복부 측면을 위로, 핀쉬 실리콘 엘라스토머로 늘어서있다.
3. 집게는 복부 접시를 들고 뒤쪽 끝에서 시작하여 전방 작업, 미세 가위로 잘라와. cerci 건조하게 유지하는 동안 항상 식염수로 습기가 내부 장기를 유지합니다. 하나 cerci 습윤제에서 식염수를 방지하기 위해 복부 위쪽 위치를 왁스 또는 고무 조각을 사용할 수있다. 습한 경우, 조직 종이로 건조. 측면으로 내부 장기와 흰색 물질 (지방의 몸)을 밀어 넣습니다. VNC는 필드의 중앙에, 복부의 길이를 실행하고 반짝 tracheae 사이에 볼 수 있어야합니다. 신경 코드는 반투명이고, 처음에 조명 (그림 2) 적절하게 조절 될 때까지 확인하기 어려울 수 있습니다. 집게 또는 곤충 핀으로 VNC를 처리하지 않는 대신 유리 프로브를 사용하여 조작 할 수 있습니다.
4. 동물의 tracheae 시스템으로 최고의 집게로 신경 코드에서 가능한 한 정밀 유리 필요 한 쌍을 제거하다레는 매우 신중하게 길이 방향으로 A6와 A5 또는 A5와 A4 신경절 (그림 3) 사이의 VNC의 connectives을 분할. 요람 cerci 짧아 곤충 핀 왁스 또는 준비 (그림 4A 및 B)를 맞게 절단 할 수있는 실리콘 엘라스토머의 쐐기 식염수 목욕 중 위쪽 복부. 신경절에 투영 cercal 신경 손상을 방지하기 위해 마지막 복부 세그먼트에있는 여분의주의 (그림 2D 및 5).

2. 세포 외 기록

1. 해부 준비, 현미경 및 기록 장치 (그림 6) 신경 세포에서 신호를 재정의 할 수 있습니다 외부, 특히 AC, 전기장을 차단하는 패러데이 케이지 안에 설치해야합니다.
2. 그것은 현미경의 무대를 내려다되도록 현미경을 배치합니다. 제제가 스테이지에 배치되면, 고강도 일루미네이터 빔의 위치를​​ 조정그것의 가장 좋은 시각화를위한.
3. 통합 된 데이터 기록 장치에 AC / DC 차동 증폭기를 연결합니다 (특정 하드웨어 및 소프트웨어 설정에 대한 자세한 내용은 이전에 ^25를 설명했습니다). 흡입 전극을 들고 머리 단계는 앰프에 연결해야합니다. 망할 CIA에 코팅 된은 접지선 ^-보다 안정적인 레코딩 복부 결과에 삽입. 체강 내의 용액이 접시에 입욕 유체와 접촉, 기록 유지 전극이 접지에 연결된 유체가 아닌 경우 이유이다.
4. 4 kHz로 기록 주파수를 설정합니다. 500 MV (이것은 미량의 시각화를 최적화하도록 조정될 수있다)로 스케일 전압 (Y 축)을 설정한다. 자극에 반응하여 신경 활동을 기록하는 연속 또는 오실로스코프 모드에서 기록 소프트웨어를 실행.
5. A5에 가까운 VNC의 connectives 중 하나를 잘라 흡입 전극에 A6에 장착 된 단면을 배치합니다. 피하십시오신경에 흡입하기 전에 내부의 실버 와이어를 커버하는 흡입 전극에 날개 펼진 식염수.
6. 각 cercus에있는 머리카락에에 건조 피펫 타격 공기. 기록 결합에 cercus의 동측에 머리를 자극하면 반대측 아닌 다른 응답을 제공하는 경우를 참조하십시오. 응답의 진폭과 자극하는 동안 주어진 시간 간격에서 스파이크의 수를 적어 둡니다.
7. 녹음 cercal 신경에 흡입 전극을 이동합니다. 필요한 경우 작은 구멍에 전극의 끝 부분에 더 잘 맞는, 스위치를 얻을 수 있습니다.
8. A6에 cercal 신경 가까이 잘라 다음 cercus로 이어지는 신경을 빨아. 활동 전위의 자연 발화가 있어야합니다. 이제 cercus에 공기를 불어 응답을 확인합니다.

3. 전기 모집을 결정하는 감각 신경을 자극

1. 그것은 (100 ~ 500 MSE 흔적을 기록하도록 모드를 청소하는 레코딩 소프트웨어를 변경C.)마다 자극이 트리거됩니다.
2. 자극의 출력에 자극 전극을 연결합니다.
3. 두 개의 미니 후크 리드 나 클립을 자극 케이블을 연결합니다.
4. 기록 장치의 트리거 입력에 자극에서 BNC 트리거 출력을 연결합니다.
5. 10 밀리 초; 주파수 :; 재생 시간 : 지연 0.3 초​​ 다음 자극 파라미터는 응답 연상해야 1 Hz에서, 전압 : 레코딩에서 신호를 획득하기 위해 필요에 따라 (단지 임계치 이상 및 최대 반응을 얻을 수있는) 조정한다. 높은 전압이 신경에 손상을 입을 수로 채​​용을 위해 최대 임계 값보다 훨씬 높은 전압에 갈 이유가 없다.
6. 긴 신경근이 자극 흡입 전극에 (그림 7, 화살표 머리)를 뽑아 될 수 있도록 가능한 한 말단으로 cercal 신경을 잘라. A6와 A5 또는 다른 부분보다 전방 사이의 결합을 사용할 수 있습니다.
7. 기록 흡입 전극을 설정 할 수 있도록 PU전극에 컷 결합을거야. 신경에 흡입하기 전에 내부의 실버 와이어를 커버하는 흡입 전극에 식염수를 끌어해야합니다. 자극 전극도 (A3 근처의 복부에 이상적입니다) 목욕 식염수에 접지되어 있는지 확인합니다.
8. 활동 전위는 화면에 표시 될 때까지 점증 전압의 하나의 자극의 시리즈를 전달한다. 하나는 응답을 보충하는 최소한의 자극의 전압과 시간의 기록을 확인해야합니다. connectives에서 시냅스 반응이 관찰 될 때까지 강도를 높입니다. 거대한 축삭에서 큰 스파이크 (세포 AP는) 먼저 표시 한 다음 다른 작은 AP의도 관찰 할 수있다.

결과

공기의 퍼프로 cerci에 털이 자극 중 하나 복부 신경절 또는 cercal 신경 자체 (그림 8) 사이 connectives에 부착 된 세포 흡입 전극을 사용하여 기록 할 수있는 기본 감각 뉴런의 방전의 원인이됩니다. 두 지역에서 기록 스파이크 진폭 밀리 볼트에 몇 마이크로 볼트의 순서에 있습니다. 때문에 신경절의 감각 통합의 복합 활동 전위 또는 cercal 신경으로부터 기록 개별 스파이크로서 관찰 스파이크의 개수는 connectives로부터 녹음 관찰보다 현저하게 크다. 그러나 인해 전극과 신경 조직 사이의 긴밀한 씰 결합의 기록에 실질적으로 더 적은 소음이 있습니다.

cerci 큰 스파이크에 공기를 내뿜는으로 connectives (그림 8A)에서 관찰 할 수있다. 이 자극 방법을 사용하여, A3 및 A4 간의 레코딩 전형적인 LY 거대한 interneuron의 (들)의 큰 스파이크 특성을 보여줍니다. 물리적으로 집게로 cerci을 마찰하면서 cercal 신경에서 녹음 활동의 강한 버스트 (그림 (b) ₁₎ 생산. 다른 기록에서, 공기의 2 퍼프는 각각 cercal 신경의 급격한 파열 응답 (그림 (b) ₂₎ 생산. 전기 A3와 A4 사이의 결합에 흡입 전극과 녹음 cercal 신경을 자극하면, 하나는 (그림 8C ₁₎ 반응을 유발하는 자극에 임계 값을 관찰 할 수 있습니다. cercal 신경의 전기 자극은 명확하게, 온도 등의 약리 대리인 또는 지역의 환경은 주변과 속임수 공부를 정량화 할 수 connectives의 응답 (그림 8C _2)를 이끌어 낸다.

fig1.jpg "/>
그대로 cerci 그림 1. Periplaneta 아메리.

그림 2. 제거 복부 표피와 같이 바퀴벌레 신경 코드의 복부보기 (A). 화살표로 설명 된 세그먼트의 확대는 (B)에서 볼 수있다. (C)에서 connectives은 유리 프로브 A4 및 A3 사이에 엎질러 하였다. 6 ^회 복부 신경절은 두 cercal 신경 꼬리 끝에서 떠나와 (D)에 표시됩니다.

그림 3. 바퀴벌레 신경 코드의 회로도 복부보기.

YS ">
그림 4. cerci은 식염수 목욕 중 위쪽으로 배치됩니다. 열린 복부 밖으로 cerci을 유지하기 위해 실리콘 엘라스토머의 작은 쐐기 모양의 조각으로 상승되는 바퀴벌레의 꼬리 끝 식염수 (A)와 홍수 할 수 있습니다 목욕의 (B).

그림 5. (화살표로 설명) cercal 신경과 제 6 ^회 복부 신경절.

그림 6. 장비를 설정합니다. 고맙다을 보려면 여기를 클릭하십시오GER 그림입니다.

그림 7. 자극과 기록 전극을 설정합니다.

그림 8. 다양한 자극 절차에 connectives 및 cercal 신경의 신경 녹음. cerci에 공기를 내뿜는 동안 A3와 A4의 connectives에서 흡입 전극과 기록 (A). 물리적으로 (B ₁₎ 마찰이나 cercal 신경 활동의 빠른 버스트 에어 퍼프 (B ₂₎ 결과를 제공하거나 동안 흡입 전극과 기본 cercal 뉴런에서 기록. 전기 cercal 신경을 자극하는 (connectives에서 응답을 생성 C _1). 자극 강도의 점진적인 증가 (화살표는 자극 인공물의 진폭을 나타낸다)와 다음 유발 반응의 강도를 참고. cercal 신경의 전기 자극은 응답 (C ₂₎ 정량 자극의 일관성에 대한 cercal 신경을 자극 상대적으로 더 많은 제어 방법을 제공합니다.

토론

이 고전적인 제조에 대하여 기술을 나타내는 이유 중의 하나는 cerci 시스템되었음을이며 여전히 신경 회로의 개발의 문제를 해결뿐만 아니라 시냅스 수리 및 재생 ^26-31 질문에 대한 연구의 활성 영역이다. 바퀴벌레 복부 신경 코드의 활동을 되살리는의 두 방법 모두 신경계 기능에 약리학 제 또는 살충제의 영향을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 실험은 단순히 식염수로 신경 활성 화학 물질을 용해하여 수행됩니다. CNS 기능에 대한 화학 물질의 효과의 일관된 판독을 제공하는 connectives 또는 운동 신경에서 기록하는 동안 일반 목욕 ​​매체로이 솔루션을 교환 한 후, 유발 또는 자발적인 활동의 변화를 관찰 할 수있다.

모든 신경 생리 학적 실험에서와 마찬가지로 일반적인 문제는 전기 노이즈입니다. 이러한 준비에 대한 신호 품질에 아마도 가장 큰 요인 I신경 조직에 관련된 흡입 전극 실. 완전히 cercal 신경 또는 결합에 그려지지 않는 단단한 물개가 이상적입니다. 레코딩은 또한 신경 코드 및 미네랄 오일 및 바셀린의 혼합물과 VNC 절연막하에 넣었다 이중 훅 전극으로 이루어질 수있다. 혼합물을 주사기로로드 및 신경 코드 ^(32)의 주위에 배출 될 수있다. 또한주의 절개는 CNS의 준비로 여기로 중요합니다. 일부는 쉽게 지느러미 표피를 해부하여 CNS에 액세스 할 찾을 수 있습니다. 이것은 복부 신경 코드의 손상의 가능성을 감소하면서,이 방법을 이용하여 내장을 모두 제거하는 것이 더 어려울 수있다.

그것은 여기에 설명되지 않고,이 혼합물은 거인의 interneurons ^{(32, 33)의} 세포 내 기록에 대한 의무입니다. 전체 신경 코드는 동시에 여러 기록 및 자극 전극을 수용하기 위해 제거 될 수있다. 더듬이 로브, 버섯 보의 사실 탐사DY 및 기타 전방 CNS의 구조는 진행 ^{34 ~ 35에} 아직도있다. 바퀴벌레 CNS는 현대 신경 생물학 연구에 빛을 발산하기 위해 계속하는 동안이 특별한 준비는 학부 대학 실험실에서 사용하기에 충분한 간단합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sylgard	Dow Corning	182 silicone kit	182 silicone elastomer kit
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
NaH2PO4•2H2O	Sigma-Aldrich	71505
Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaOH	Sigma-Aldrich	221465	To adjust pH
HCl	Sigma-Aldrich	H1758	To adjust pH
Material Name
Dissecting tools	World Precision Instruments	assortment
Insect Pins	Fine Science Tools, Inc	26001-60
Dissecting microscope	World Precision Instruments	PZMIII-BS
Glass electrodes	Sigma-Aldrich	CLS7095B5X	Box of 200, suction electrodes
Micromanipulator	World Precision Instruments	MD4-M3-R	Can fix for base or on a metal rod
Silver wire (10/1,000 inch)	A-M Systems	782500
Computer	any company
AC/DC differential amplifier	A-M Systems	Model 3000
PowerLab 26T	AD Instruments	27T
Head stage	AD Instruments		Comes with AC/DC amplifier
LabChart7	AD Instruments
Electrical leads	any company
Glass tools	make yourself		For manipulating nerves
Cable and connectors	any company
Pipettes with bulbs	Fisher Scientific	13-711-7	Box of 500
Beakers	any company
Wax or modeling clay	any company or local stores
Stimulator	Grass Instruments	SD9 or S88
Plastic tip for suction electrode	local hardware store (Watt's brand)	¼ inch OD x 0.170 inch ID	Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.