עצבית במעגל הקלטה ממערכת עצבים מקק שלמה

Summary

מאמר זה מתאר את נתיחת מקק הגחון עצב בחוט והקלטות תאית מן העצב וconnectives cercal. עוררו תגובות מופקות על ידי גירוי חשמלי של עצב cercal או הגירוי מכאני ישיר של cerci.

Abstract

הכנת כבל עצב הגחון המקק היא מערכת צייתנית לניסויי neuroethology, דוגמנות רשת עצבית, ובדיקת ההשפעות הפיזיולוגיות של חומרי הדברה. מאמר זה מתאר את היקף מערכות חוש מקק שיכול לשמש לassay איך מערכת עצבים של חרקים מגיבה להפרעות סביבתיות. דגש כאן הוא על הבריחה בתיווכו של cerci להעברת סיבים ענק באמריקנה Periplaneta ההתנהגות. זה בהכנת אתר דורש רק מיומנות לנתח מתונה ומומחיות אלקטרו ליצור הקלטות לשחזור של פעילות עצבית. אז יכולים להיות מיושמים פפטידים או כימיקלים אחרים באופן ישיר למערכת העצבים בתמיסה עם תמיסת מלח הפיזיולוגי. חרקים יכולים גם להינתן לפני לנתיחה ומעגל הבריחה יכול לשמש כמדד למצבו הנרגש של מערכת העצבים המרכזית. בהקשר זה מבחני שתוארו במסמך זה יהיו שימושי גם לימיןesearchers המעוניין בהתחדשות איבר ואת האבולוציה של התפתחות מערכת עצבים שלפ אמריקנה היא אורגניזם מודל שנקבע.

Introduction

יש יותר מ -4,000 מיני מקק אלא רק על 30 הם ביתיים מזיקים. אולי המוכר ביותר הוא אמריקנה Periplaneta התיקן האמריקאי misnamed שמקורו באפריקה, וכעת הוא נמצא כמעט בכל מקום על פני כדור הארץ. בנוסף למהירות שלו המהירה הריצה ¹ והתנהגות מתחמקת, באזורים הטרופיים פ אמריקנה מסוגלת ^2,3 טיסה.

המאפיינים העיקריים של מערכת מקק העצבים המרכזית (CNS) הם הטבע שלה מפולח וביזור שליטת תהליכי ^4,5. המוח, בית החזה, וגרעיני בטן הם חברו יחד על ידי connectives interganglionic לזווג כדי ליצור את חוט עצב הגחון (VNC).

הגרעינים בכל פלח הם שילוב מרכזים. הם מורכבים מאזור חיצוני, קליפת המוח מכיל תאים אחראים על מחסום חדירות דם למוח ממש מתחתיהם, וsomata של origi נוירוניםnating בגנגליון ש. somata אלה עשויים להשתייך לinterneurons, הנוירונים ויסות, או נוירונים מוטוריים. הם מספקים אקסונים הנשארים בתוך הגנגליון ממוצא (interneuron המקומי), או אקסונים שפרויקט בין הגרעינים של מערכת העצבים המרכזית (interneurons interganglionic) או שתסתיימו בתאי שריר היקפי (הנוירונים מוטוריים). רוב somata ממוקם ventrally או ventrolaterally בקליפת ganglionic ^5. Connectives לזווג, interganglionic מכיל רק אקסונים ולא גופי תא עצביים.

Neuropil של הגנגליון מכילה תאי גליה (neuroglia), קטעי האקסון, צרורות של אקסונים ודנדריטים (neurites) של נוירונים. Neuropil נטולת גופי תא עצביים. זהו האזור בתוך הגנגליון שבו תקשורת הסינפטי ישירה בין תאי עצב ואינטגרציה של תשומות להתרחש.

יכולתו של התיקן האמריקאי פ אמריקנה לזהות ופתאום להגיב לטורף מתקרב (רגל, האןד, וכו '.) יוחס למעגל רפלקס שמורכב מcerci ^ו6,7 מערכת סיבים הענק. Cerci הוא זוג, מבני רוח רגישה כמו קרן ממוקמים בקצה של הבטן (איור 1). בפ אמריקנה פני השטח הגחון של כל cercus מכיל כ 200 filiform (חוט) שערות המסודרים ב14 עמודות. תשעה עמודים אלה יכולים להיות מזוהים באופן עקבי בבעלי חיים שונים על פי מאפייני התגובה של תא קולטן הקשורות ואקסון. כל שערה היא בשקע המאפשר לה להתכופף בקלות ביותר במישור אחד שהוא ספציפי עמודה. תנועה של השיער בכיוון אחד לאורך המטוס שלה גורמת לשלילת קוטביות בתא קולטן ופרץ של פוטנציאל פעולה (APS) בתא העצב התחושתי. תנועה בכיוון ההפוך מעכבת כל נקודתי גישה ספונטניות שוטפת ^8. המטוס המועדף של סטיה והכיווניות של התגובה הוא שונה בכל טור. לפיכך, filiforמתחמים מ 'שיער קולטן אחראים לא רק לאיתור התנועה של אוויר, אלא גם עבור' קידוד ', בצורה של נקודתי גישה, הכיוון שממנו זרם האוויר שמקורו. עיבוד מידע זה על ידי מערכת העצבים המרכזית גורם לתגובה מתאימה "בריחה ^6,7. ייחוד זה פונקציונלי, עמודים של השערות חושיות נשמר מבעלי החיים לבעלי חיים.

תא קולטן של כל שיער filiform אחראי לtransducing הסטייה מכאנית של השיער לאירוע עצבי (וכתוצאה מכך פרץ או עיכוב של נקודתי גישה בהאקסון של תא קולטן ^9. נקודתי הגישה לנסוע לגנגליון בטן המסוף (A6) באמצעות cercal XI עצב, שם הם סינפסה עם אקסונים ענק של חוט עצב הגחון (VNC). הם האמינו אקסונים הענק שיהיו אחראי על העברת והעירור הבא של הנוירונים מוטוריים שגורם לבריחת התנהגות ^6,10,11.

O חביון התנהגותייםf תגובת הבריחה של פ אמריקנה היא אחת הקצר ביותר של כל בעל חיים ^7. חביון התנהגות הוא הזמן שבין הגעתו של גירוי בmechanoreceptor והייזום של תגובת בריחה. בניסויים באמצעות צילום במהירות גבוהה כדי להקליט את ניסיון הבריחה מקרפדה לתקוף, המקק נצפה להתחיל התור שלה הרחק מהקרפדה בכ -40 אלפיות שניים (זמן מתחילת הארכת לשון למקק תנועת ^7,12. שימוש פחזנית רוח מבוקרת ניסויים אחרים, חביון התנהגותיים יכול להיות מופחת ל11 אלפית שניים. גילו כי מהירות משב רוח מינימאלית של מ"מ 12 / אלפיות שניים (עם האצת 600 מ"מ / msec ²⁾ יכולה לעורר תגובת בריחה, ואילו מהירויות נמוכות עוד יותר (3 מ"מ / שניות) הנגרם על הליכה איטית מקקים להפסיק לנוע ^12.

המתאם החזק שקיים בדרך כלל בין מערכות סיבים ענקית ובריחת התנהגות תועד היטב ^13,14. בinstances בי תא מסוים הוא הכרחי ומספיק כדי לעורר התנהגות מסוימת של התאים המכונה נוירון פקודה ^15,16. interneurons הענק (GIS) במעגל בריחת רוח של פ אמריקנה נחוצות לא לרפלקס. בעלי חיים שהניסוי ablated חיילים אמריקאים עדיין מפגינים התנהגות הבריחה ולכן חיילים אלה לא נחשבים נוירונים פקודת ^17,18. ניתוק connectives צוואר הרחם, כי הם מקורי למעגל הסנסורית גם משפיע על ההתנהגות, מצביע על כך שיש יורד קלט ממוח השפעה על כיוון הבריחה ^19. היבטים אלה של שליטה ויתירות קנס הם בעל חשיבות עליונה להישרדותו של האורגניזם ומשלימים אפנון neurochemical באמצעות אמינים יוגניים ^20.

פ הכנת חוט עצב אמריקנה כבר מערכת מודל אלגנטית לneuroethologists במשך עשרות שנים רבות בעבר החל בעבודתם החלוצית של רדר ^{21. זה מאפשר לתלמידים להקליט, להציג ולנתח את פעילות העיקרית חושית ותגובות שנוצרה על ידי interneurons הענק ל22,23,24 הקלט שלהם. בנוסף להעברת הרעיון שמעגלים עצביים הניתנים לזיהוי בבסיס תגובות התנהגותיות לסביבה, התרגילים האלה צריכים להנחיל הערכה לתרומתם הביולוגית שנעשתה על ידי מזיקים ביתיים נפוצים זה.}

Protocol

1. בתור

יש תמיסת מלח מקק בשימוש בכל פרוטוקול זה את ההרכב הבא:

תמיסת מלח מקק ^36: (גרם ל100 מיליליטר)
210 מ"מ NaCl (1.227 ז)
2.9 מ"מ KCl (.0216 ז)
1.8 מ"מ CaCl ₂ (.0265 ז)
0.2 מ"מ אא ₂ PO ₄ • 2H ₂ O (g 0.0032)
1.8 מ"מ Na ₂ HPO ₄ • 7H ₂ O (g 0.0483)
(PH 7.2. התאם ל-pH עם 1 M NaOH או 1 M HCl).

1. בחר מקק גברי מהטנק מחזיק שיש cerci חזק (איור 1). הקטעים האחרונים של הזכר צרים בהשוואה לנשים, ומכילים לא השחלות ומסת ביצה, זכרים הם קלים יותר לנתח. הזכרים של פ יש לי אמריקנה זוג מחט קצרה בין cerci. מחט אלה לא נצפו בנקבות.
2. חותכים את הכנפיים, הרגליים וראש ולהצמיד את הגוף, צד עד הגחון, לdish מצופה סיליקון אלסטומר.
3. עם מלקחיים להרים את צלחות הגחון וקטעו אותם עם מספריים בסדר, מתחילים בקצה האחורי ועובדים anteriorly. תמיד לשמור על האיברים הפנימיים לחים עם מי מלח בעת שניסה לשמור על יבש cerci. אפשר להשתמש בשעווה או חתיכות גומי כדי למקם את כלפי מעלה הבטן כדי למנוע מלוח מהרטבת cerci. אם הם נרטבים, לייבש אותם עם חתיכת נייר הטישו. לדחוף לצד האיברים הפנימיים וחומר הלבן (שומן בגוף). VNC היא במרכז השדה, מפעיל את האורך של הבטן וצריך להיות גלוי בין tracheae המבריק. חוט העצב הוא שקוף ועשוי בתחילה להיות קשה לראות עד התאורה מותאמת כראוי (איור 2). לא להתמודד עם VNC עם מלקחיים או סיכות חרקים; במקום לתפעל אותו באמצעות בדיקות זכוכית.
4. לסלק מערכת tracheae של בעל החיים בצורה הטובה ביותר שאפשר מחוט העצב עם מלקחיים ועם זוג צורך זכוכית עדינהles, לפצל בזהירות רבה connectives VNC אורכים בין A6 וA5 או A5 וגרעיני A4 (איור 3). עריסת cerci ובטן כלפי מעלה אל מחוץ לאמבטיה מלוחה עם סיכות קיצרו חרקים ושעווה או טריז של אלסטומר סיליקון שניתן לחתוך כך שיתאימו להכנה (איורים 4 א 'וב'). להיות זהיר במיוחד בקטע הבטן האחרון שלא לפגוע בעצבי cercal שמקרינים לגנגליון (2D ואיורים 5).

2. הקלטה תאית

1. מנגנון ההכנה, מיקרוסקופ, והקלטה גזור צריך להיות התקנה בתוך כלוב פאראדיי לחסום במיוחד AC, שדות חיצוניים, חשמליים, שיכול לעקוף אותות מתא העצב (איור 6).
2. מקם את המיקרוסקופ כך שהוא משקיף על הבמה מיקרוסקופ. לאחר ההכנה מושם על הבמה, להתאים את המיקום של אלומת הפנס בעוצמה הגבוההלהדמיה הטובה ביותר שלו.
3. חברו את מגבר ההפרש AC / DC ליחידת הקלטת נתונים המשולב (פרטים על הגדרות חומרה ותוכנה הספציפיות כבר תאר ²⁵ בעבר). שלב הראש מחזיק האלקטרודה יניקה צריך להיות מחובר למגבר. חוט כסף קרקע שכבר מצופה בCl ^- מוכנס לתוך תוצאות הבטן בהקלטות יציבה יותר. הסיבה לכך היא אם הפתרון בחלל הגוף הוא לא במגע עם נוזל הרחצה בצלחת, הנוזל הקשורים לאלקטרודה ההקלטה נשאר מקורקע.
4. הגדר את תדירות ההקלטה עד 4 קילוהרץ. הגדר את קנה המידה המתח (ציר y) ל500 mV (זה יכול להיות מותאם כדי לייעל ויזואליזציה של העקבות). הפעל את תוכנת הקלטה במצב רציף או אוסצילוסקופ להקליט פעילות עצבית בתגובה לגירויים.
5. חותכים אחד connectives VNC הקרוב לA5 ולמקם את הקצה החתוך מצורף A6 לתוך האלקטרודה יניקה. הקפד pמלוח ull לתוך האלקטרודה היניקה כדי לכסות את חוט הכסף בתוכו לפני שמוצץ בעצב.
6. עם אוויר מכת פיפטה יבש לשערות הממוקמים על כל cercus. לראות אם מגרה את השערות על ipsilateral cercus לחיבור נרשם נותן תגובה שונה מאשר נגדי אחת. שימו לב למשרעת של התגובות ומספר הקוצים במרווח זמן נתון במהלך הגירוי.
7. הזז את האלקטרודה היניקה לעצב cercal להקלטה. כדי לקבל כושר, מתג טוב יותר לקצה האלקטרודה עם פתח קטן יותר במידת צורך.
8. חותכים את העצב הקרוב cercal לA6 ולאחר מכן למצוץ את העצבים מובילים אל cercus. לא צריך להיות ירי ספונטני של פוטנציאלי פעולה. עכשיו, לפוצץ באוויר על cercus ולציין את התגובות.

3. גירוי חשמלי לעצבים התחושתיים קבע גיוס

1. לשנות את תוכנת הצריבה לטאטא מצב כך שהוא מתעד את העקבות (MSE 100-500ג.) בכל פעם שגירוי מופעל.
2. חבר את האלקטרודה מגרה לתפוקה של ממריץ.
3. חבר את כבל ממריץ עם מוביל מיני קרס שתיים או קליפים.
4. חברו את יציאת הדק BNC מהממריץ לכניסת ההדק על יחידת ההקלטה.
5. הפרמטרים הגירוי הבאים צריכים לעורר תגובה: משך: 0.3 שניות; עיכוב: 10 אלפיות שנייה; תדר: 1 הרץ; מתח: להתאים לפי צורך כדי לקבל אות בהקלטות (רק מעל הסף ולהיות מסוגל לקבל תגובה מקסימלי). אין שום סיבה ללכת למתחים גבוהים בהרבה מסף מקסימאלי לגיוס כמתח גבוה יכול להזיק לעצבים.
6. חותכים את עצב cercal כדיסטלי ככל האפשר, כך ששורש עצב ארוך יכול להיות מורם אל תוך האלקטרודה יניקת הגירוי (איור 7, ראש חץ). ניתן להשתמש בם החיבור בין A6 וA5 או קטע אחר קדמי יותר.
7. הגדר את האלקטרודה יניקת הקלטה, כך שאתה יכול pull את חיבור לחתוך לאלקטרודה. הקפד למשוך כמה מלוחה לאלקטרודות היניקה כדי לכסות את חוט הכסף בתוכו לפני שמוצץ בעצבים. ודא את האלקטרודה מגרה היא גם מעוגנת במלח האמבט (בבטן ליד A3 הוא אידיאלי).
8. לספק סדרה של גירויים בודדים של מתח גובר, עד פוטנציאל פעולה מופיע על המסך. אחד צריך לעשות תקליט של מתח המגרה המינימלי ומשך לגייס תגובה. הגבר את העצמה עד שתגובה הסינפטית בconnectives הוא ציין. עלייה הגדולה (APS תאי) מאקסונים הענק מופיעה ראשונה, ולאחר מכן קטן יותר של AP אחר עשויים גם להיות שנצפה.

תוצאות

גירוי של שערות על cerci ידי משב אוויר גורם לפריקות של עצב סנסורי עיקרי שניתן להקליט באמצעות אלקטרודות יניקה תאית מצורפים או לconnectives בין גרעיני בטן או עצב cercal עצמו (איור 8). אמפליטודות ספייק נרשמה משני האזורים הן בסדר הגודל של כמה מיקרו וולטים למיליוולט. בגלל אינטגרציה חושית בגנגליון מספר הקוצים שנצפו בפוטנציאל הפעולה המורכב או כקוצים בודדים שנרשמו מעצב cercal להפליא יותר מאשר נצפה בהקלטות מconnectives. עם זאת גם לציין כי יש באופן משמעותי פחות רעש בהקלטה בחיבור בשל החותם הדוק יותר בין האלקטרודה ורקמת העצבים.

על ידי מתנשף אוויר בקוצים הגדולים cerci ניתן לצפות בconnectives (איור 8 א). שימוש בשיטה זו מגרה, קלטות בין A3 ו-A4 טיפוסי ly להראות אופייני ספייק גדול של interneuron הענק (ים). הקלטה מעצב cercal תוך שפשוף cerci עם מלקחיים פיזי הופקה חזה חזק של פעילות (איור 8 ב _1). בהקלטה אחרת, 2 נשיפות של אוויר בכל המיוצרים על תגובת קורע מהירה בעצב cercal (איור 8 ב _2). כאשר גירוי חשמלי עצבי cercal עם האלקטרודה יניקה והקלטה בחיבור בין A3 ו-A4, אפשר להתבונן בסף הגירוי לעורר תגובות (איור 8C _1). הגירוי החשמלי של עצב cercal בבירור מעורר תגובה בconnectives שניתן לכמת ללימודים מניפולטיביים עם סוכנים תרופתיים או הסביבתי המקומי מקיף, כגון טמפרטורה (איור 8C _2).

fig1.jpg "/>
איור 1. אמריקנה Periplaneta עם cerci ללא פגע.

איור 2. תצוגת הגחון של חוט עצב מקק כפי שראו עם ציפורן הגחון הוסרה (). תצוגה מוגדלת של המגזר שהותווה על ידי חיצים נראית ב( ב '). ב (ג) connectives נשפך בין A4 ו-A3 עם בדיקה זכוכית. הגנגליון בטן 6 ^ה מוצג ב( ד ') עם שני עצבי cercal עוזבים בסוף הזנב.

איור 3. תצוגת הגחון סכמטי של חוט עצב מקק.

י"ש ">
איור 4. Cerci מוצב כלפי מעלה אל מחוץ לאמבטיה מלוחה. יכולה להיות מוצפת הבטן פתחה עם מי מלח (א ') עם קצה הזנב של המקק שמוגבה עם תקוע פיסה בצורה קטנה של אלסטומר סיליקון על מנת לשמור cerci החוצה באמבטיה (ב ').

איור 5. הגנגליון הבטן ^ה -6 עם עצב cercal (שתואר על ידי חיצים).

איור 6. הציוד להגדיר. לחץ כאן לצפייה larדמות ger.

איור 7. להגדיר מגרה והאלקטרודה הקלטה.

איור 8. הקלטות עצביות של connectives ועצב cercal עם נהלי גירוי שונים. הקלטה עם האלקטרודה יניקה מconnectives בין A3 ו-A4 בעוד מתנשפים אוויר בcerci (א '). הקלטה מהנוירונים cercal העיקריים עם האלקטרודה יניקה תוך שפשוף או פיזי (ב ₁₎ או מתן נשיפות אוויר (ב ₂₎ תוצאות בפרצים מהירים של פעילות בעצב cercal. גירוי חשמלי עצבי cercal מייצר תגובות בconnectives ( C _1). שים לב העלייה ההדרגתית בעוצמת הגירוי (חיצים מצביעים על המשרעת של חפץ המגרה) ואת עוצמת עוררו התגובות הבאות. הגירוי החשמלי של עצב cercal מספק אמצעים יחסית יותר מבוקרים של גירוי העצבי cercal לעקביות בגירוי לכימות התגובות (C _2).

Discussion

אחת הסיבות למציגים טכניקות להכנה הקלסית הזה הוא שמערכת cerci הייתה ועדיין הוא אזור פעיל של מחקר בהתמודדות עם שאלות של הפיתוח של מעגלים עצביים, כמו גם שאלות לגבי תיקון הסינפטי והתחדשות ^26-31. כך או שיטה לעורר פעילות בחוט עצב הגחון המקק יכולה לשמש כדי לבחון את ההשפעות של סוכנים או חומרי הדברה תרופתיים על תפקוד מערכת עצבים. ניסויים אלו נעשים פשוט על ידי המסת כימיקלים neuroactive למלוחה. אחרי שהחלפתי את הפתרון הזה עם מדיום הרחצה הרגיל, שינויים בפעילות עוררת או ספונטנית אפשר לראות בעת ההקלטה מconnectives או עצב מוטורי לתת קריאת נתונים של ההשפעה של החומר הכימי על תפקוד מערכת העצבים המרכזית עולים בקנה אחד.

כמו בכל הניסויים נוירופיזיולוגיות בעיה נפוצה היא רעש חשמלי. הגורם כנראה הגדול ביותר באיכות אות להכנות אלה iשל חותם האלקטרודה היניקה על רקמת העצב. חותם חזק שלא לצייר לגמרי בעצב או חיבור cercal הוא אידיאלי. הקלטות גם יכולות להתבצע באמצעות אלקטרודות וו כפולה ממוקמת מתחת לחוט העצב ובידוד VNC בתערובת של שמן מינרלים ווזלין. התערובת יכולה להיות טעונה לתוך מזרק וגורשה סביב חוט העצב ^32. גם נתיחה זהירה היא קריטית כאן כמו בכל הכנה של מערכת העצבים המרכזית. חלקם עשוי למצוא את זה קל יותר לגשת למערכת העצבים המרכזית על ידי לנתח הציפורן הגבי. אמנם זה מקטין את האפשרות של פגיעה בעצב בחוט הגחון זה יכול להיות קשה יותר להסיר את כל הקרביים שימוש בגישה זו.

זה לא תואר כאן, אבל הכנה זו ניתנת להקלטה תאית בinterneurons הענק ^32,33. חוט העצב כולו ניתן גם להסיר כדי להתאים כמה אלקטרודות הקלטה ומגרה בו זמנית. בחקר עובדה של אונה, בו פטריות מחושיםdy, ומבנים במערכת העצבים המרכזית קדמי אחרים הוא עדיין בעיצומה ^34-35. אמנם תיקן מערכת העצבים המרכזית ממשיך לשפוך אור על מחקר הנוירוביולוגי מודרני ההכנה הספציפית הזה היא פשוטה מספיק כדי לשמש במעבדות אקדמיות לתואר ראשון.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Sylgard	Dow Corning	182 silicone kit	182 silicone elastomer kit
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
NaH2PO4•2H2O	Sigma-Aldrich	71505
Na2HPO4•7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaOH	Sigma-Aldrich	221465	To adjust pH
HCl	Sigma-Aldrich	H1758	To adjust pH
Material Name
Dissecting tools	World Precision Instruments	assortment
Insect Pins	Fine Science Tools, Inc	26001-60
Dissecting microscope	World Precision Instruments	PZMIII-BS
Glass electrodes	Sigma-Aldrich	CLS7095B5X	Box of 200, suction electrodes
Micromanipulator	World Precision Instruments	MD4-M3-R	Can fix for base or on a metal rod
Silver wire (10/1,000 inch)	A-M Systems	782500
Computer	any company
AC/DC differential amplifier	A-M Systems	Model 3000
PowerLab 26T	AD Instruments	27T
Head stage	AD Instruments		Comes with AC/DC amplifier
LabChart7	AD Instruments
Electrical leads	any company
Glass tools	make yourself		For manipulating nerves
Cable and connectors	any company
Pipettes with bulbs	Fisher Scientific	13-711-7	Box of 500
Beakers	any company
Wax or modeling clay	any company or local stores
Stimulator	Grass Instruments	SD9 or S88
Plastic tip for suction electrode	local hardware store (Watt's brand)	¼ inch OD x 0.170 inch ID	Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size.