La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

Resumen

Se introduce un protocolo para la generación de números grandes (miles a cientos de miles) de talla y esferoides tumorales composición controlado uniforme, utilizando placas de micropocillos disponibles en el mercado.

Resumen

Esferoides tumorales se reconoce cada vez más como un importante modelo in vitro para el comportamiento de las células tumorales en tres dimensiones. Más fisiológicamente relevante de cultivos adherentes hojas convencionales, que recapitulan más exactamente la complejidad y las interacciones presentes en tumores reales. Con el fin de aprovechar este modelo para evaluar mejor la biología del tumor, o la eficacia de nuevos agentes terapéuticos, es necesario ser capaz de generar esferoides de forma reproducible, de una manera controlada y en cantidades significativas.

El sistema AggreWell consta de una matriz de alta densidad de micropocillos en forma de pirámide, en el que se centrifuga una suspensión de células individuales. Los números de células agrupación en la parte inferior de cada micropocillo, y el número y la proporción de distintos tipos de células involucradas depende sólo de las propiedades de la suspensión introducida por el experimentador. Por lo tanto, somos capaces de generar esferoides tumorales de tamaño y composición arbitraria ena necesidad de modificar la tecnología de la plataforma subyacente. Los cientos de micropocillos por centímetro cuadrado de superficie de cultivo a su vez, aseguran que los niveles de producción extremadamente altas pueden alcanzarse a través de un proceso sencillo,-no laboral intensiva. Por tanto, esperamos que este protocolo será ampliamente útil para los investigadores en el campo esferoide tumor.

Introducción

Hay un creciente cuerpo de evidencia de que las células tumorales se comportan de manera diferente en las tres culturas dimensiones que lo hacen cuando cultivadas en plástico, y que los agentes terapéuticos presentes en las plataformas de cultivo de tejidos convencionales pueden perder eficacia cuando la transición a un sistema más fisiológicamente relevantes ^1. Es por lo tanto deseable para estudiar el comportamiento de las células cancerosas en estas condiciones, tanto para obtener información sobre su biología subyacente, y también para aumentar la tasa de éxito de la transición de nuevos agentes terapéuticos de la planta de filtrado a la clínica. Un sistema de modelo útil con una larga historia emplea agrupaciones tridimensionales de las células cancerosas conocidas como esferoides tumorales ^1,2. Idealmente, las técnicas para la formación de esferoides permitirían la producción de un gran número de esferoides homogéneos, cuyo tamaño y composición son controlados por el experimentador. Aunque la gota pendiente y bien-placa enfoques ^3,4 son capaces de cumplir con algunos de estos rerequisitos, el rendimiento es generalmente limitada, y la generación de un gran número de esferoides se convierte en una tarea de trabajo intensivo.

Recientemente hemos desarrollado un sistema para resolver problemas similares en el campo de la medicina regenerativa ^5. El empleo de la agregación forzada dentro de una serie de pozos a escala micrométrica densamente empaquetadas (véase la figura 1), este enfoque permite la generación de esferoides de números arbitrarios de células, incluidas las mezclas de múltiples tipos de células ^6, así como la incorporación de diversos biomateriales ^7. Los esferoides se forman en grandes números - miles a cientos de miles o más - y pueden ser extraídos inmediatamente o mantenerse en los micropocillos en el que se formaron con intercambio de medio de al menos un ⁸ a dos (observación no publicada) semanas. Este sistema está por lo tanto muy adecuado para la generación de un gran número de uniforme y esferoides tumorales reproducibles para la evaluación de la efectiveness de nuevos agentes antitumorales o investigaciones biológicas básicas.

Protocolo

NOTA: placas de micropocillos están disponibles en diferentes formatos, dependiendo de los resultados deseados. Especificaciones así como directrices aproximadas para el número mínimo y máximo de las células que se deben utilizar con cada formato se muestran en la Tabla 1. Los micropocillos más pequeños se estrechan a un punto agudo, por lo que no hay límite de tamaño menor, aunque la variabilidad entre los esferoides se hace más significativa en tamaños más pequeños. La producción rutinaria de esferoides de un promedio de tan sólo 20 células cada uno es directo ^8. El tamaño más grande de micropocillos no es completamente cónica, por lo tanto, los intentos de formar esferoides de pequeños números de células puede resultar en múltiples esferoides más pequeñas en cada micropocillo. Debido a ligeras diferencias en las propiedades de la superficie, con la preparación de la solución de tensioactivo (paso 1.2) no es opcional cuando se utiliza placas AggreWell 400EX.

Este protocolo se basa en el uso de placas de AggreWell 400 - para otros formatos de contrasULT Tabla 1. El número de células que se cargan en cada pocillo se determina multiplicando el número de micropocillos que contiene el número de células que se agrupan para cada esferoide. Por ejemplo, para generar esferoides de 1000 células cada uno, cada pocillo se debe cargar con esferoides (1200 veces 1000 células cada uno) = 1,2 x 10 ⁶ células. La densidad celular debe calcularse teniendo en cuenta que las células se cargan en un volumen de 0,4 ml. Así que para el ejemplo de esferoides formados a partir de 1000 células cada uno, 1,2 x 10 ⁶ células en 0,4 ml se traduce en una densidad de 3 x 10 ⁶ células por ml.

1. Los micropocillos se preparan para recibir las células

1. Microplacas son estériles como siempre, y sólo deben ser retirados de sus envases en un ambiente estéril, tal como un gabinete de bioseguridad de flujo laminar. La esterilidad se debe mantener durante todo el protocolo. En caso de que se vea comprometida la esterilidad, los pocillos se esterilizarse utilizando etanol al 70% en agua usando ellos siguientes pasos opcionales.
   1. Añadir 0,5 ml de etanol al 70% a cada pocillo no utilizada. Algunos micropocillos se atrapar burbujas de aire, aunque esto se puede reducir mediante la adición de líquido a un lado, y permitiendo que se propague a través de la superficie, en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Vuelva a colocar la tapa.
   2. Mientras que el vapor de etanol debe impregnar rápidamente cualquier burbuja, si hay un gran número puede ser conveniente para eliminarlos. Centrifugar durante 2 min a 2.000 x g. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad.
   3. El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos.
   4. Incubar durante 5 minutos con la tapa en a temperatura ambiente.
   5. Aspirar el etanol. Placa ahora se puede lavar con agua estéril o PBS para su uso inmediato, o se seca al aire para el almacenamiento.
2. Con el fin de asegurar que las células no interactúan con la superficie de micropocillos, se puede preparar usando un agente tensioactivo. En general, esaconsejable realizar este paso inicialmente, y posteriormente comparar esferoides generados con y sin tensioactivos micropocillos recubiertos.
   1. Añadir 0,5 ml de solución de lavado a cada pocillo. Algunos micropocillos se atrapar burbujas de aire, aunque esto se puede reducir mediante la adición de líquido a un lado, y permitiendo que se propague a través de la superficie, en lugar de dejarlo caer verticalmente sobre la superficie. Vuelva a colocar la tapa.
   2. Centrifugar durante 2 min a 2000 xg para eliminar las burbujas. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad.
   3. El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos.
   4. Se incuba durante al menos treinta minutos con la tapa puesta, a temperatura ambiente, o durante la noche a 4 ° C. Las placas pueden ser almacenados a cuatro grados con la solución de tensioactivo en los pocillos hasta que se necesite si está sellado adecuadamente para evitar que se sequen.
   5. Lavar la placa con agua estéril o PBS inmediatamente antes de su uso. No permita que las placasa secarse después del revestimiento.

2. Preparación de células

NOTA: Los detalles de la preparación celular variarán algo con el tipo específico de célula en estudio. Sin embargo, hemos observado estas condiciones para ser eficaz con una amplia gama de células, incluidas las líneas discutidas aquí, así como las células madre embrionarias humanas y murinas (ESC), células madre pluripotentes inducidas humanas (IPSC), fibroblastos, endodermo primitivo putativo, y células del estroma. Otros grupos han utilizado este sistema con éxito para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo la condrogénesis de células madre mesenquimales ^9, generación normalizada de los precursores neuronales a partir de células madre pluripotentes ^10, análisis toxicológicos en hepatocitos ¹¹ y la evaluación de la regeneración de la médula espinal en salamandras ^12. El protocolo específico para trabajar con células HT29 se muestra aquí.

1. Comience con un frasco T75 de células HT29, se cultivaron en DMEM+ 10% de FBS
2. Aspirar medio de crecimiento del frasco, y añadir 3 ml de tripsina.
3. Se incuban las células durante 5 min a 37 ° C.
4. Detener la digestión de tripsina mediante la adición de 3 ml de medio de crecimiento. Tomar una alícuota para el recuento de células y transferir el resto en un tubo de centrífuga de 15 ml.
5. Centrifugar durante 5 min a 200 x g.
6. Mientras que la centrifugación está en curso, contar las células.
7. Tripsina Aspirar / mezcla de medio y reemplazar con medio de crecimiento fresco, volumen determinado por la densidad celular obligatorio calculado anteriormente.
8. (OPCIONAL) Pase la suspensión de células a través de un colador para eliminar los grumos. NOTA: las condiciones de cosecha celular varían un poco entre líneas. Si un protocolo de disociación para, por ejemplo pasar las células de interés está disponible, que se debe utilizar como punto de partida. Con las líneas celulares sensibles uso de tripsina puede resultar en la muerte celular excesiva. En estos casos hemos observado buenos resultados usando TrypLE como dissociati alternativaen reactivo ^8. Si las células se vuelven agrupada durante la disociación y pierden viabilidad, la adición de DNasa a la solución de enzima puede resolver este. Reducir los tiempos de disociación y el empleo de un paso de trituración para romper los agregados celulares también puede aumentar la viabilidad.

3. Formación esferoide

NOTA: Los esferoides pueden generarse en una variedad de formulaciones de medio, sin embargo los ensayos iniciales deben llevarse a cabo usando el medio en el que las células se cultivaron, para distinguir consecuencias de la transición a un sistema de cultivo de 3 dimensiones de las consecuencias de los cambios en la composición del medio.

1. Añadir 0,4 ml de medio de crecimiento a cada pocillo.
2. Centrifugar durante 2 min a 2000 xg para eliminar las burbujas. Tenga en cuenta que es importante para asegurar que el rotor se equilibra correctamente a esta velocidad antes de la centrifugación.
3. El uso de un microscopio invertido bajo aumento, verificar las burbujas se han eliminado de los micropocillos.
4. Añadir 0,4 mlsuspensión de células a la densidad requerida (calculada anteriormente). Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo, sin la introducción de burbujas de aire en los micropocillos. Es importante asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente por todo el pozo, con el fin de obtener esferoides consistentes.
5. Centrifugar durante 5 min a 200 x g. Si la placa no se hace a nivel de auto durante la centrifugación, las corrientes de convección Puede ocurrir que en la distribución desigual de las células a través de las cúpulas. Por lo tanto, la placa debe ser equilibrado internamente, así como en contra de la otra placa, de manera que el peso se distribuye uniformemente a ambos lados de la placa de soporte.

NOTA: Si no se observa evidencia de la distribución desigual de células, puede ser necesaria la aplicación de una pequeña cantidad de la lubricación de los puntos de giro en el soporte de la placa - consultar con el fabricante de la centrífuga para obtener instrucciones.

NOTA: Una vez que las células han sido centrifugada en los micropocillos, que son razonablemente resistenciatante del lavado a fondo de los movimientos menores de la placa. Movimientos bruscos que resultan en chapoteo del medio deben ser evitados, pero la transferencia de la placa de centrífuga al microscopio o una incubadora no deberían resultar en el desplazamiento celular significativa.

6. Usando un microscopio invertido, compruebe que las células se han agrupado dentro de los pocillos, y que se distribuyen de forma homogénea en el pozo.
7. Incubar toda la noche a 37 ° C.
8. Usando un microscopio invertido, observar el proceso de la formación de esferoides. Algunas líneas de células se forman esferoides compactos dentro de las 24 horas, otros pueden tardar más tiempo. La progresión de clúster a agregarse en las células HT29 se muestra en la Figura 2.
9. Recuperar esferoides de los micropocillos y traslado al cultivo en suspensión por chorro suavemente con una pipeta. Alternativamente, mantener esferoides in situ con reemplazo de medio ⁸ - la duración depende de su tamaño inicial y la tasa de crecimiento, que defINE el tiempo hasta que se superan los micropocillos en el que se formaron.
   1. Para reemplazar medio sin perder esferoides, medio aspirado en el borde del pozo utilizando una pipeta Pasteur. Lentamente la punta hacia abajo hasta que comience a dibujar líquido del menisco, y siga el menisco hacia abajo a medida que cae. A continuación, añadir medio fresco contra la pared del pozo en el mismo lugar. Unos pocos esferoides pueden perderse, sin embargo si el medio siempre se aspiró y se reemplazó en la misma posición, este número seguirá siendo pequeña en comparación con los grandes números en el pozo.

Resultados

Esferoides de múltiples líneas tumorales de orígenes anatómicos diferentes pueden ser generados fácilmente y se extrajeron en cultivo en suspensión. Figura 3 ilustra el control de tamaño consistente obtener a través de este método, con poblaciones esferoide muy uniforme en cada condición. Borrar las diferencias entre la línea de comportamiento también son visibles, con células de cáncer de colon HT29 y células de cáncer de esófago TE6 forman esferoides densamente empaquetadas con límites bien definidos, mientras que las células de cáncer de próstata LNCaP dieron lugar a esferoides menos coherentes con límites irregulares (véase la discusión de las posibles razones ). Las fuerzas internas más fuertes en los agregados más coherentes también dio lugar a colapso a una forma más simétrica incluso mientras que aún en los micropocillos en el que se formaron, mientras que los agregados LNCaP, en particular en el tamaño más grande, conservan visiblemente la geometría piramidal cuadrada de la micropocillos. La relación entre el número de células de entrada y las fís iCal tamaño del esferoide resultante dependerá de un número de variables. Volúmenes teóricos basados ​​en el producto del volumen por célula y el número de células empleadas pueden ser reducidos por la pérdida de células, que a su vez pueden incluir la pérdida de células durante la fase de suspensión de una sola célula, así como la pérdida de excesivamente pequeños agregados debido a insuficiente número de vecinos y de excesivamente grandes agregados ocasionadas por el transporte limitaciones y necrosis en el núcleo. El tamaño también se verá influenciada por cualquier proliferación que pueden ocurrir durante el proceso de agregación. Como estos parámetros variarán de línea celular a línea celular, si se desean esferoides de dimensiones físicas específicas el número correcto de células para introducir debe determinarse experimentalmente. Como una primera aproximación, se espera que el diámetro del esferoide a aumentar con la raíz cúbica del número de células incorporadas - por ejemplo, un aumento de 8 veces en el número de células debería dar como resultado una duplicación del diámetro esferoidal.

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Figura 1. Esquema de la producción de esferoide. El sistema de micropocillos se compone de una serie de micropocillos-piramidal cuadrados estrechamente empaquetados (625 por cm ² para la μ m de tamaño de 400), en el cual las células pueden ser centrifugadas. Las células se unen por las paredes laterales inclinadas, y el tamaño del esferoide resultante se controla mediante la variación de la densidad de la suspensión celular empleada.

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Figura 2. Asamblea de células agrupadas en esferoides. Esferoides se forma a partir de setecientos HT29 células cada uno. Inmediatamente después de la centrifugación (A), las células se agrupan libremente en la parte inferior de cada micropocillo. Tenga en cuenta que los grupos se compensan de manera uniforme hacia la parte inferior derecha en este caso. Esto es aceptable siempre y tamaños de clúster permanecen consistentes a través de la matriz. Si las diferencias de tamaño importante grupo son vistos desde un lado de la matriz a la otra, ver nota en el paso 3.5. Después de la incubación durante 24 h (B), las fuerzas de adhesión intercelulares han causado las agrupaciones a agregarse y formar esferoides coherentes, que puede entonces ser extraído (C).

r /> Figura 3. Spheroids generados en placas de micropocillos. Esferoides se formaron a partir de setecientos (A, C, E) o mil quinientos (B, F, D) las células de cáncer de colon HT29 (A, B), las células de cáncer de próstata LNCaP (C, D) o las células del cáncer de esófago TE6 (E, F). Tenga en cuenta la consistencia de esferoides dentro de una preparación, y también la variación entre las líneas celulares - en particular, los agregados sueltos LNCaP como en comparación con el HT29 lleno más densamente y células TE6. La barra de escala representa 200 micras.

	Formato de micropocillos
	AggreWell 400	AggreWell 40EX	AggreWell 800
Ancho de micropocillos (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm )	400	400	800
Micropocillos por cm 2	625	625	156.25
Micropocillos por pocillo	1200	4700	300
Células mínimos por micropocillos *	N / A	N / A	2000
Células máximos por micropocillos *	2000	2000	10000
Células por pocillo mínimos *	N / A	N / A	6 x 10 5
Máximo células por pocillo *	2.4 x 10 6	9.4 x 10 6	3 x 10 6
1.1.1 - volumen de etanol al 70% (ml)	0.5	2.0	0.5
1.2.1 - El enjuague volumen de solución (ml)	0.5	2.0	0.5
3.2 - El volumen de precarga media (ml)	0.4	1.6	0.4
3.5 - El volumen de carga de la célula (ml)	0.4	1.6	0.4
* Los números de células por micropocillo son sólo una aproximación ya que este valor puede variar con el tamaño de las células específicas empleadas, y debe ser determinada empíricamente

Tabla 1. AggreWell opciones y modificaciones del protocolo.

Discusión

Hemos establecido un sistema por el cual un gran número de esferoides uniformes pueden ser generados a partir de múltiples líneas celulares de diferentes fuentes. Aún tenemos que encontrar una línea de células adherentes que no forma esferoides en estas condiciones. Hemos observado anteriormente la pérdida de células en las poblaciones propensas a anoikis ^5,8, sin embargo hasta la fecha esta cuestión no se ha planteado con líneas tumorales. El sistema es escalable de forma arbitraria con área de superficie, con un comportamiento consistente a través de micropocillos en 24 pocillos y formato de 6 pocillos, así como biorreactores prototipo que contienen 50.000 micropocillos cada uno actualmente en fase de desarrollo.

En caso de esferoide asimetría ser una preocupación, el tiempo de incubación en el paso 4.8 se puede aumentar a dos o tres días. Los esferoides también se pueden incubar durante un período después de la extracción de los micropocillos para aumentar la simetría, sin embargo en este caso debe tenerse cuidado de mantener densidades de cultivo suficientemente baja, como esferoides en contacto uno con el otro wiLL menudo fusionar en estructuras más grandes. Por esta razón, hemos mantenido previamente culturas dentro de los micropocillos en la que se formaron los agregados, con la limitación principal es el tamaño del esferoide. Esto a su vez es una función tanto de la tasa de crecimiento y el tamaño inicial de ^8, y si se ha previsto la cultura extendido dentro de la placa de micropocillos, esto se debe considerar de antemano. Opciones para prevenir el crecimiento excesivo, si se producen, son ya sea a partir de esferoides pequeños, o el empleo de las cúpulas más grandes de la placa AggreWell 800.

En caso de esferoides dejar de aumentar de manera coherente con el tiempo, una causa potencial puede ser la muerte celular. Particularmente en agregados más grandes de las células metabólicamente muy activos, limitaciones de transporte de masa en la entrega de oxígeno y nutrientes esenciales puede resultar en un núcleo necrótico ² - por lo tanto un esferoide no cohesivo puede ser simplemente una consecuencia de la muerte celular excesiva. Alternativamente, las mediciones de la cohesión mecánicasión de esferoides se han utilizado para evaluar las fuerzas de unión intercelulares, en relación con el potencial metastásico de una línea celular dada ^13. Sería interesante investigar la relación entre la forma esferoide y el potencial metastásico, tal vez utilizando parámetros morfométricos tales como redondez y el perímetro de relación de área.

Además de investigar las propiedades mecánicas y morfométricos de esferoides, el montaje en el sistema de micropocillos permite la producción a gran escala de esferoides mixta de composición, que consiste en combinaciones de múltiples tipos de células y / o biomateriales ^6,7. Las interacciones de las células tumorales con otros tipos de células son importantes para modelar más de cerca el comportamiento de los tumores in vivo ^14, por lo que puede ser de interés para generar esferoides de células tumorales en combinación con los fibroblastos y las células endoteliales, por ejemplo. Las micropartículas de diversos biomateriales también se pueden incorporar, y pueden afectar SPHpropiedades eroid tanto directamente a través de sus interacciones con las células ^7,15, y también como depósitos para la liberación controlada de factores de crecimiento y citoquinas en el interior del esferoide ^16.

Si hay alguna duda sobre la esterilidad, por ejemplo, cuando se trabaja con una placa de micro en el que previamente se han utilizado algunos pozos, que pueden haber pasado algún tiempo en una incubadora como parte de un experimento anterior, los pozos pueden esterilizarse con etanol al 70% en el agua.

Una vez esferoides se han formado, que también pueden ser separadas de las células no incorporadas residuales haciendo pasar la suspensión a través de un filtro de células. Las células individuales pasarán a través, mientras que se mantendrán los esferoides. Si el esferoide es sospechoso de derramamiento de células potencialmente metastásicos en el transcurso de la cultura, puede ser deseable llevar a cabo este procedimiento varias veces - inicialmente para eliminar las células no incorporadas, y posteriormente para aislar purified poblaciones de las células desprendidas de los esferoides.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AggreWell 400 plate	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Rinsing Solution	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 µm)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Inverted microscope	VWR / Motic	CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP