La production de grands nombres de tumeurs Sphéroïdes Taille contrôlée à l'aide de micro puits Plaques

Résumé

Nous introduisons un protocole pour la génération d'un grand nombre (des milliers à des centaines de milliers) de taille et d'sphéroïdes uniformes de composition contrôlée tumorales, en utilisant commerce microplaques.

Résumé

sphéroïdes de tumeur sont de plus en plus reconnu comme un important modèle in vitro du comportement des cellules tumorales dans les trois dimensions. Plus physiologiquement pertinente de cultures adhérentes feuilles classiques, ils récapitulent plus précisément la complexité et les interactions présentes dans les tumeurs réels. Afin de tirer parti de ce modèle pour mieux évaluer la biologie des tumeurs, ou de l'efficacité de nouveaux agents thérapeutiques, il est nécessaire d'être capable de générer de manière reproductible des sphéroïdes, d'une manière contrôlée et en grand nombre.

Le système se compose d'un AggreWell matrice à haute densité de micro-puits en forme de pyramide, dans laquelle une suspension de cellules uniques est centrifugée. Les nombres de cellules regrouper au fond de chaque puits, et le nombre et la proportion des types cellulaires distincts impliqués dépend seulement des propriétés de la suspension introduite par l'expérimentateur. Ainsi, nous sommes capables de générer des sphéroïdes de tumeur de taille arbitraire et la composition avecà avoir à modifier la technologie de plate-forme sous-jacente. Les centaines de micropuits par centimètre carré de surface de culture à son tour veiller à ce que les niveaux de production très élevés peuvent être atteints via un processus simple, nonlabor-intensive. Nous attendons donc que ce protocole sera largement utile pour les chercheurs dans le domaine de sphéroïde tumeur.

Introduction

Il ya un nombre croissant de preuves que les cellules tumorales se comportent différemment dans trois cultures dimensions que ce qu'ils font lorsqu'ils sont cultivés sur plastique, et que les agents thérapeutiques identifiés sur les plates-formes de culture de tissus classiques peuvent perdre l'efficacité quand la transition vers un système plus physiologiquement pertinents ^1. Il est donc souhaitable d'étudier le comportement des cellules cancéreuses dans ces conditions, à la fois pour mieux comprendre leur biologie sous-jacente, et aussi d'augmenter le taux de transition de nouveaux agents thérapeutiques dans le centre de dépistage à la clinique de succès. Un système de modèle utile avec une longue histoire emploie amas tridimensionnels de cellules de cancer connus comme des sphéroïdes de tumeur ^1,2. Idéalement, les techniques de formation sphéroïde ne permettre la production d'un grand nombre de sphéroïdes uniformes dont la taille et la composition sont contrôlés par l'expérimentateur. Bien goutte suspendue et le bien-plaque approches ^3,4 sont en mesure de répondre à certaines de ces reexigences, le débit est généralement limitée, et la génération d'un grand nombre de sphéroïdes devient une tâche de main-d'œuvre.

Nous avons récemment mis au point un système pour résoudre des défis similaires dans le domaine de la médecine régénérative ^5. Employant agrégation forcée à l'intérieur d'une série de denses puits échelle du micron (voir la figure 1), cette approche permet la génération de sphéroïdes de nombres arbitraires de cellules, y compris des mélanges de plusieurs types de cellules ^6, ainsi que l'incorporation de divers biomatériaux ^7. Sphéroïdes sont formés en grand nombre - des milliers à des centaines de milliers ou plus - et peuvent être extraites immédiatement ou maintenues dans les puits dans lesquels ils ont été formés avec échange de milieu pendant au moins un ⁸ à deux (observation non publiée) semaines. Ce système est donc bien adapté à la génération d'un grand nombre de sphéroïdes et uniforme tumorales reproductibles pour l'évaluation de l'effectiveness de nouveaux agents anti-tumoraux ou des enquêtes biologiques de base.

Protocole

REMARQUE: plaques de microtitration sont disponibles dans différents formats, selon les résultats souhaités. Spécifications ainsi que des directives approximatives pour les nombres minimum et maximum de cellules qui doivent être utilisés avec chaque format sont présentés dans le tableau 1. Les petites cupules s'effilent en pointe, et donc il n'y a pas de limite de taille inférieure, bien que la variabilité entre les sphéroïdes devient plus important dans les petites tailles. Production de routine de sphéroïdes d'une moyenne d'aussi peu que 20 cellules chacune est simple ^8. La plus grande taille de micropuits n'est pas entièrement conique, tente donc de former des sphéroïdes de petits nombres de cellules peut se traduire par de multiples petits sphéroïdes dans chaque micropuits. En raison de légères différences dans les propriétés de surface, la préparation de la solution de tensioactif (étape 1.2) n'est pas une option en utilisant les plateaux AggreWell 400EX.

Ce protocole est basé sur l'utilisation de plaques AggreWell 400 - pour les autres formats inconvénientsult Tableau 1. Le nombre de cellules devant être chargés dans chaque puits est déterminée en multipliant le nombre de micropuits qu'il contient par le nombre de cellules à cluster pour chaque sphéroïde. Par exemple, pour produire des sphéroïdes à partir de 1 000 cellules chacun, chaque puits doit être chargé avec des sphéroïdes (1200 fois 1000 cellules chacune) = 1,2 x 10 ⁶ cellules. La densité cellulaire doit être calculée, étant donné que les cellules sont chargées dans un volume de 0,4 ml. Ainsi, pour l'exemple de sphéroïdes formés à partir de 1.000 cellules chacun, 1,2 x 10 ⁶ cellules dans 0,4 ml se traduit par une densité de 3 x 10 ⁶ cellules par ml.

Une. Micropuits se préparent à recevoir des cellules

1. microplaques sont stériles comme prévu, et ne doivent être retirés de leur emballage dans un environnement stérile, comme une enceinte de biosécurité laminaire d'écoulement. La stérilité doit être maintenue tout au long du protocole. La stérilité doit être compromise, les puits sont restérilisés en utilisant 70% d'éthanol dans de l'eau en utilisant l'étapes facultatives suivantes.
   1. Ajouter 0,5 ml d'éthanol à 70% à chaque puits utilisé. Certains micropuits volonté des bulles d'air de piégeage, bien que cela puisse être réduite en ajoutant un liquide d'un côté, et en lui permettant de se répandre à travers la surface, plutôt que de la laisser tomber verticalement sur la surface. Replacer le couvercle.
   2. Bien que la vapeur d'éthanol devrait rapidement imprégner les bulles, si il ya un grand nombre, il peut être souhaitable de les supprimer. Centrifuger 2 min à 2000 x g. On notera qu'il est important de s'assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse.
   3. L'utilisation d'un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule.
   4. Incuber pendant 5 min avec le couvercle à la température ambiante.
   5. Aspirer l'éthanol. Plaque peut maintenant être lavé avec de l'eau stérile ou PBS pour une utilisation immédiate, ou séché à l'air pour le stockage.
2. Afin d'assurer que les cellules n'interagissent pas avec la surface de micropuits, il peut être préparé en utilisant un agent tensio-actif. En général, il estconseillé d'effectuer cette étape un premier temps, et ensuite comparer sphéroïdes générés avec et sans tensioactifs micropuits revêtus.
   1. Ajouter 0,5 ml de solution de rinçage à chaque puits. Certains micropuits volonté des bulles d'air de piégeage, bien que cela puisse être réduite en ajoutant un liquide d'un côté, et en lui permettant de se répandre à travers la surface, plutôt que de la laisser tomber verticalement sur la surface. Replacer le couvercle.
   2. Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer les bulles. On notera qu'il est important de s'assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse.
   3. L'utilisation d'un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule.
   4. Incuber pendant au moins 30 minutes avec le couvercle à la température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Les plaques peuvent être conservées à quatre degrés avec la solution de tensioactif dans le puits jusqu'à ce que nécessaire si elle est correctement fermé pour éviter le dessèchement.
   5. Laver les plaques avec du PBS ou de l'eau stérile immédiatement avant utilisation. Ne pas laisser les plaquesà sécher après le revêtement.

2. Préparation de cellules

NOTE: Les détails de la préparation de cellules peuvent varier quelque peu avec le type de cellule spécifique à l'étude. Cependant, nous avons observé ces conditions pour être efficace avec une large gamme de cellules, y compris les lignes discutées ici, ainsi que des cellules souches embryonnaires humaines et murines (ESC), les cellules souches pluripotentes humaines induites (iPSC), des fibroblastes, endoderme primitif putatif, et les cellules stromales. D'autres groupes ont utilisé ce système avec succès pour une large gamme d'applications, y compris la chondrogenèse de cellules souches mésenchymateuses ^9, la production standardisée des précurseurs neuraux à partir de cellules souches pluripotentes ^10, analyses toxicologiques dans les hépatocytes ¹¹ et l'évaluation de régénération de la moelle épinière à la salamandre ^12. Le protocole spécifique pour travailler avec les cellules HT29 est montré ici.

1. Commencer avec un flacon T75 de cellules HT29, cultivées dans du DMEM+ 10% de FBS
2. milieu de croissance de Aspirer à partir de flacon, et ajouter 3 ml de trypsine.
3. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C.
4. Arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de croissance. Prélever une partie aliquote pour le comptage des cellules et transférer le reste dans un tube de centrifugeuse de 15 ml.
5. Centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g.
6. Alors que la centrifugation est en cours, compter les cellules.
7. Aspirer la trypsine / mélange de milieu et de le remplacer par du milieu de croissance frais, du volume déterminé par la densité de cellules telle que calculée ci-dessus.
8. (OPTION) Passez la suspension de cellules à travers une passoire pour éliminer toutes les grumeaux. NOTE: Les conditions de récolte cellulaire varient quelque peu entre les lignes. Si un protocole de dissociation, par exemple pour repiquer les cellules d'intérêt sont disponibles, qui doit être utilisé en tant que point de départ. Avec les lignées cellulaires sensibles à l'utilisation de la trypsine peut entraîner une mort cellulaire excessive. Dans ces cas, nous avons observé de bons résultats en utilisant TrypLE comme une solution de rechange dissociatile réactif ^8. Si les cellules deviennent agglomérée au cours de la dissociation et perdent leur viabilité, l'addition de DNase à la solution d'enzyme peut résoudre ce problème. La réduction des temps de dissociation et utilisant une étape de trituration de briser les mottes de cellules peut également accroître la viabilité.

3. Formation sphéroïde

REMARQUE: Les sphéroïdes peuvent être produits dans une variété de formulations de milieu, les essais cependant initiales doivent être effectuées en utilisant le milieu dans lequel les cellules sont mises en culture, de distinguer les conséquences de la transition vers un système de culture en 3 dimensions à partir des conséquences de l'évolution composition de milieu.

1. Ajouter 0,4 ml de milieu de culture dans chaque puits.
2. Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer les bulles. On notera qu'il est important de s'assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse avant la centrifugation.
3. L'utilisation d'un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule.
4. Ajouter 0,4 mlsuspension de cellules à la densité requise (calculée ci-dessus). Mélanger doucement par pipetage de haut en bas, sans introduire de bulles d'air dans les puits. Il est important de veiller à ce que les cellules sont réparties uniformément dans le puits, afin d'obtenir des sphéroïdes conformes.
5. Centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g. Si la plaque n'est pas auto-niveau pendant la centrifugation, les courants de convection qui peuvent survenir suite à la distribution inégale des cellules dans les puits. Par conséquent, la plaque doit être équilibrée en interne, ainsi que contre l'autre plaque, de sorte que le poids est réparti uniformément sur les deux faces du support de plaque.

NOTE: Si la preuve de la distribution inégale des cellules est vu, il peut être nécessaire d'appliquer une petite quantité de lubrifiant pour les points de pivot sur le support de plaque - consulter le fabricant de centrifugeuse pour obtenir des instructions.

NOTE: Une fois que les cellules ont été centrifugés dans les puits, ils sont raisonnablement résistanceTant de lavage de mouvements mineurs de la plaque. Mouvements brusques qui se traduisent par le ballottement du milieu doivent être évités, mais le transfert de la plaque de la centrifugeuse de microscope ou incubateur ne devraient pas entraîner le déplacement cellulaire significative.

6. En utilisant un microscope inversé, de vérifier que les cellules sont groupées dans les micropuits, et qu'elles sont réparties de façon uniforme à travers le puits.
7. Incuber pendant une nuit à 37 ° C.
8. En utilisant un microscope inversé, d'observer le processus de formation sphéroïde. Certaines lignées de cellules formeront sphéroïdes compacts dans les 24 heures, d'autres peuvent prendre plus de temps. La progression de la grappe à s'agréger dans des cellules HT29 est représenté sur la figure 2.
9. Récupérer à partir de sphéroïdes les micropuits et les transférer à une culture en suspension en les projeter doucement avec une pipette. Sinon, maintenir sphéroïdes in situ avec remplacement du milieu ⁸ - la durée dépend de leur taille initiale et le taux de croissance, qui define le temps jusqu'à ce qu'ils grandissent les puits dans lesquels ils ont été formés.
   1. Pour remplacer le milieu sans perdre sphéroïdes, moyen d'aspiration au niveau du bord du puits à l'aide d'une pipette de Pasteur. Ramenez lentement la pointe vers le bas jusqu'à ce qu'il commence à aspirer le liquide du ménisque, et suivre le ménisque glisser vers le bas. Puis ajouter du milieu frais contre la paroi du puits à la même place. Quelques sphéroïdes peuvent être perdus, mais si le milieu est toujours aspiré et remplacé dans la même position, ce nombre restera faible en comparaison avec les grands nombres dans le puits.

Résultats

Sphéroïdes à partir de lignées de tumeurs d'origines différentes anatomiques peuvent facilement être générés et extraits dans une culture en suspension. Figure 3 illustre le contrôle de la taille uniforme pouvant être obtenu par ce procédé, avec des populations de sphéroïdes très uniformes dans chaque condition. Des différences claires entre les lignes de comportement sont également visibles, avec des cellules du côlon cancer du HT29 et les cellules de cancer de l'œsophage TE6 formant sphéroïdes denses avec des frontières bien définies, tandis que les cellules cancéreuses LNCaP de la prostate ont donné lieu à des sphéroïdes moins cohérentes avec des limites irrégulières (voir discussion pour des raisons possibles ). Les forces internes fortes dans les agrégats plus cohérentes ont également entraîné l'effondrement d'une forme plus symétrique même tout en restant dans les puits dans lesquels ils ont été formés, alors que les agrégats de LNCaP, en particulier à la plus grande taille, conservent visiblement la géométrie carrée pyramidale de l' micropuits. La relation entre le nombre de cellules d'entrée et les phys taille ical du sphéroïde résultant dépendra d'un certain nombre de variables. Volumes théoriques basés sur le produit du volume par cellule et le nombre de cellules employées peuvent être réduits par la perte de cellules, ce qui à son tour peut comprendre une perte de cellules pendant l'étape de suspension d'une seule cellule, ainsi que la perte de trop petits agrégats du fait de nombre insuffisant de voisins, et de trop grands agrégats dues au transport limitations et nécrose dans le noyau. Taille sera également influencée par toute prolifération qui peuvent se produire pendant le processus d'agrégation. Etant donné que ces paramètres peuvent varier d'une lignée cellulaire de la lignée cellulaire, si sphéroïdes de dimensions physiques spécifiques sont souhaitées le nombre correct de cellules à introduire doit être déterminée expérimentalement. En première approximation, on s'attend diamètre sphéroïde à augmenter avec la racine cubique du nombre de cellules intégrées - par exemple une augmentation de 8 fois du nombre de cellules devrait aboutir à un doublement de diamètre sphéroïde.

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Figure 1. Schéma de production sphéroïde. Système de micropuits se compose d'un réseau de micropuits serrées de carré pyramidal (625 par cm ² pour les 400 μ m taille), dans laquelle les cellules peuvent être centrifugées. Les cellules sont réunis par des parois latérales en pente, et la taille de la sphéroïde résultant est contrôlée en faisant varier la densité de la suspension cellulaire utilisée.

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Figure 2. Ensemble de cellules regroupées en sphéroïdes. Sphéroïdes ont été formés à partir de sept cents HT29 cellules chacune. Immédiatement après centrifugation (A), les cellules sont regroupées de façon lâche dans le fond de chaque puits. Notez que les grappes sont uniformément décalés vers le bas à droite dans ce cas. Ceci est acceptable à condition tailles de cluster restent cohérents à travers le réseau. Si les différences de taille de cluster significatif sont vus d'un côté du tableau à l'autre, voir la note à l'étape 3.5. Après une incubation de 24 heures (B), les forces d'adhésion intercellulaires ont causé les grappes de regrouper et former des sphéroïdes cohérentes, qui peuvent ensuite être extraites (C).

r /> Figure 3. Sphéroïdes générés dans des plaques de microtitration. Sphéroïdes ont été formés à partir de sept cents (A, C, E) ou un mille cinq cent (B, D, F) des cellules du côlon d'un cancer du HT29 (A, B), des cellules de cancer de la prostate LNCaP (C, D) ou des cellules de cancer de l'œsophage TE6 (E, F). Notez la cohérence des sphéroïdes à l'intérieur d'une préparation, ainsi que la variation entre les lignées cellulaires - en particulier les granulats LNCaP lâches par rapport à la HT29 plus dense et TE6 cellules. La barre d'échelle représente 200 um.

	Le format micropuits
	AggreWell 400	AggreWell 40EX	AggreWell 800
largeur de Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm )	400	400	800
Micropuits par cm 2	625	625	156.25
Micropuits par puits	1200	4700	300
Cellules minimum par micropuits *	N / A	N / A	2000
Cellules maximum par micropuits *	2000	2000	10000
Cellules minimum par puits *	N / A	N / A	6 x 10 5
Cellules maximum par puits *	2.4 x 10 6	9,4 x 10 6	3 x 10 6
1.1.1 - le volume d'éthanol à 70% (ml)	0,5	2.0	0.5
1.2.1 - Rinçage volume de solution (ml)	0,5	2.0	0,5
3.2 - volume de précharge moyen (ml)	0,4	1.6	0,4
3.5 - le volume cellulaire de chargement (ml)	0,4	1.6	0,4
* Le nombre de cellules par micropuits ne sont qu'une approximation que cette valeur varie en fonction de la taille des cellules spécifiques employées, et doit être déterminée empiriquement

Tableau 1. AggreWell options et modifications de protocole.

Discussion

Nous avons mis en place un système dans lequel un grand nombre de sphéroïdes uniformes peuvent être générés à partir de plusieurs lignées cellulaires provenant de sources différentes. Nous n'avons pas encore de rencontrer une ligne de cellules adhérentes qui ne fait pas sphéroïdes dans ces conditions. Nous avons déjà observé une perte de cellules dans des populations exposées à anoïkis ^5,8, mais à ce jour cette question ne s'est pas posée de lignées tumorales. Le système est évolutif arbitrairement avec la surface, avec un comportement cohérent entre micropuits dans 24 puits et le format de 6 puits, ainsi que des bioréacteurs prototypes contenant 50.000 micropuits chaque actuellement en cours de développement.

Si sphéroïde asymétrie être une préoccupation, le temps d'incubation dans l'étape 4.8 peut être augmentée à deux ou trois jours. Sphéroïdes peuvent également être mises en incubation pendant une période après l'extraction à partir des micropuits pour augmenter la symétrie, mais dans ce cas il faut veiller à maintenir la densité de culture suffisamment basse, comme des sphéroïdes en contact avec une autre will fusionner souvent dans des structures plus grandes. Pour cette raison, nous avons déjà entretenu cultures dans les puits dans lequel les agrégats ont été formés, avec la limitation principale étant la taille de l'ellipsoïde. Cela est une fonction à la fois le taux de croissance et la taille initiale ^8, et si la culture étendue dans le microplaque est prévu, cela devrait être considéré à l'avance. Options pour prévenir la prolifération, il devrait se produire, notamment, soit à partir de petits sphéroïdes, ou en employant les grands micropuits de la plaque AggreWell 800.

Si sphéroïdes ne pas augmenter en cohérence au fil du temps, une cause possible peut être la mort de la cellule. Notamment dans les grandes agrégats de cellules métaboliquement très actives, les limitations de transport de masse sur l'apport d'oxygène et de nutriments essentiels peut entraîner un noyau nécrotique ² - ainsi un sphéroïde non cohésif peut être simplement une conséquence de la mort cellulaire excessive. Sinon, les mesures de la cohésion mécaniquesion de sphéroïdes ont été utilisés pour évaluer les forces de liaison intercellulaires, en relation avec le potentiel métastatique d'une lignée cellulaire donnée ^13. Il serait intéressant d'étudier la relation entre la forme sphéroïde et le potentiel métastatique, peut-être en utilisant des paramètres morphométriques comme la rondeur et le périmètre de rapport de surface.

En plus d'enquêter sur les propriétés mécaniques et morphométriques de sphéroïdes, montage dans le système de micro-puits permet la production à grande échelle de sphéroïdes mixtes composition, consistant en des combinaisons de types et / ou de biomatériaux ^6,7 cellulaires multiples. Les interactions des cellules tumorales avec d'autres types de cellules sont importantes pour modéliser plus étroitement le comportement des tumeurs in vivo ^14, donc il peut être intéressant de générer des sphéroïdes à partir de cellules tumorales en combinaison avec des fibroblastes et des cellules endotheliales, par exemple. Microparticules de divers biomatériaux peuvent également être incorporés, et peuvent affecter SPHeroid propriétés à la fois directement par le biais de leurs interactions avec les cellules, ^7,15 et également en tant que réservoirs pour la libération contrôlée de facteurs de croissance et des cytokines dans l'intérieur de l'ellipsoïde ^16.

Si il n'y a aucun souci sur la stérilité, par exemple lorsque vous travaillez avec une microplaque dans laquelle certains puits ont déjà été utilisés, qui peuvent avoir passé un certain temps dans un incubateur dans le cadre d'une expérience précédente, les puits peuvent être restérilisés avec 70% d'éthanol dans de l'eau.

Une fois que les sphéroïdes ont été formées, elles peuvent aussi être séparées des cellules non constituées résiduelles en faisant passer la suspension sur un tamis cellulaire. Les cellules individuelles vont passer à travers, tandis que les sphéroïdes seront conservés. Si le sphéroïde est soupçonné d'excrétion des cellules potentiellement métastatiques au cours de la culture, il peut être souhaitable d'effectuer cette procédure plusieurs fois - d'abord pour éliminer les cellules individuelles, puis à isoler purified populations de cellules dégagés par les sphéroïdes.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AggreWell 400 plate	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Rinsing Solution	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 µm)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Inverted microscope	VWR / Motic	CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP