Produção de grande número de controladas pelo tamanho Spheroids tumorais usando placas de micropoços

Resumo

Nós introduzimos um protocolo para a geração de um grande número (milhares a centenas de milhares) de tamanho-e esferóides uniformes tumor controlado por composição, usando placas de micropoços disponíveis no mercado.

Resumo

Esferóides de tumor são cada vez mais reconhecido como uma importante modelo in vitro para o comportamento de células de tumor em três dimensões. Mais fisiologicamente relevante do que as culturas convencionais aderente folhas, eles recapitular com mais precisão a complexidade e as interações presentes em tumores reais. A fim de utilizar este modelo para avaliar melhor a biologia do tumor, ou a eficácia de novos agentes terapêuticos, é necessário ser capaz de gerar esferóides de forma reprodutível, de uma maneira controlada e em números significativos.

O sistema AggreWell consiste de uma matriz de alta densidade de micropoços em forma de pirâmide, em que uma suspensão de células isoladas é centrifugado. Os números de células de agrupamento, na parte inferior de cada micropoço, e o número e proporção de diferentes tipos de células envolvidas dependem apenas das propriedades da suspensão introduzida pelo experimentador. Assim, somos capazes de gerar esferóides tumor de tamanho e composição arbitrária coma necessidade de modificar a tecnologia de plataforma subjacente. As centenas de micropoços por centímetro quadrado de superfície da cultura, por sua vez garantir que os níveis de produção extremamente elevados podem ser alcançados através de um processo intensivo de nonlabor simples. Esperamos, portanto, que este protocolo será de grande utilidade para pesquisadores da área esferóide tumor.

Introdução

Existe um crescente corpo de evidências de que as células tumorais se comportam de forma diferente em três culturas tridimensionais do que quando cultivadas em plástico, e que os agentes terapêuticos identificados em plataformas de cultura de tecidos convencionais podem perder eficácia quando a transição para um sistema mais fisiologicamente relevantes ^1. É desejável, portanto, para estudar o comportamento de células cancerosas sob estas condições, ambos os a perceber melhor a sua biologia subjacente, e também para aumentar a taxa de sucesso de transição de novos agentes terapêuticos a partir da instalação de rastreio para a clínica. Um sistema de modelo de utilidade, com uma longa história emprega aglomerados tridimensionais das células cancerosas conhecidas como esferóides tumorais ^1,2. Idealmente, as técnicas para formação de esferóide iria permitir a produção de grandes números de esferóides uniformes, cuja dimensão e composição são controladas pelo experimentador. Enquanto pendurado soltar e bem-plate aproxima ^3,4 são capazes de cumprir algumas dessas resitos, o rendimento é geralmente limitado, e geração de um grande número de esferóides se torna uma tarefa trabalhosa.

Recentemente, desenvolveu um sistema para resolver desafios semelhantes no campo da medicina regenerativa ^5. Empregando agregação forçada dentro de uma série de poços em escala mícron densamente compactados (ver Figura 1), esta abordagem permite a produção de esferóides de números arbitrários de células, incluindo misturas de vários tipos de células ^6, bem como a incorporação de vários biomateriais ^7. Esferóides são formados em grande número - milhares de centenas de milhares ou mais - e pode ser extraído imediatamente ou mantidas nos micropoços em que foram formados com troca de meio por pelo menos um ⁸ a dois (observação não publicada) semanas. Este sistema é, portanto, bem adequado para a geração de um grande número de uniforme e esferóides tumorais reprodutíveis para a avaliação da effectiveness de novos agentes antitumorais ou investigações biológicas básicas.

Protocolo

NOTA: placas de micropoços estão disponíveis em diferentes formatos, dependendo dos resultados desejados. Especificações assim como linhas aproximados para os números mínimos e máximos de células que devem ser utilizados com cada formato são mostrados na Tabela 1. Os micropoços menores diminuir para uma ponta afiada, e, portanto, não há limite de tamanho menor, embora a variabilidade entre esferóides se torna mais significativo em tamanhos menores. Produção de rotina de esferóides de uma média de menos de 20 células de cada um é simples ^8. Quanto maior o tamanho de micropoços não é totalmente cónica, por conseguinte, as tentativas para formar esferóides de pequenos números de células pode resultar em múltiplos esferóides menores em cada micropoço. Devido a pequenas diferenças nas propriedades da superfície, a preparação com a solução de surfactante (passo 1.2) não é opcional quando se utiliza placas AggreWell 400EX.

Este protocolo baseia-se na utilização de AggreWell 400 placas - por outros formatos contrasult Tabela 1. O número de células a serem carregados em cada poço é determinada multiplicando o número de micropoços que contém pelo número de células para ser agrupados para cada esferóide. Por exemplo, para gerar esferóides de 1000 células cada, cada poço tem de ser carregada com 1200 (esferóides vezes cada 1.000 células) = 1,2 x 10 ⁶ células. A densidade celular deve ser calculada tendo em conta que as células serão carregados em um volume de 0,4 ml. Assim, para o exemplo de esferóides formados a partir de 1000 células cada um, 1,2 x 10 ⁶ células em 0,4 ml traduz para uma densidade de 3 x 10 ⁶ culas por ml.

1. Preparar micropoços para recebimento Células

1. Microplacas são estéreis, como previsto, e só deve ser retirado da sua embalagem em um ambiente estéril, como uma cabine de segurança biológica de fluxo laminar. A esterilidade deve ser mantida durante todo o protocolo. Caso a esterilidade ser comprometida, os poços são novamente esterilizado usando etanol a 70% em água, utilizando oseguindo os passos opcionais.
   1. Adicionar 0,5 ml de etanol a 70% a cada poço não utilizado. Alguns micropoços bolhas de ar armadilha, embora este possa ser reduzido pela adição de líquido de um lado, e permitindo que ele se espalhe ao longo da superfície, em vez de deixá-la cair verticalmente sobre a superfície. Substituir tampa.
   2. Embora o vapor de etanol deve permear rapidamente quaisquer bolhas, se houver um grande número pode ser desejável removê-los. Centrifugar durante 2 minutos a 2.000 x g. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade.
   3. Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades.
   4. Incubar durante 5 minutos com a tampa colocada à temperatura ambiente.
   5. Aspirar etanol. Placa pode agora ser lavada com água ou PBS estéril para utilização imediata, ou ar seco para o armazenamento.
2. A fim de assegurar que as células não interagem com a superfície do micropoço, que pode ser preparado usando um surfactante. Em geral, éaconselhável realizar esta etapa, inicialmente, e posteriormente comparar esferóides gerados com e sem micropoços revestida de surfactante.
   1. Adicionar 0,5 ml de solução de enxaguamento para cada poço. Alguns micropoços bolhas de ar armadilha, embora este possa ser reduzido pela adição de líquido de um lado, e permitindo que ele se espalhe ao longo da superfície, em vez de deixá-la cair verticalmente sobre a superfície. Substituir tampa.
   2. Centrifugar durante 2 minutos a 2000 xg para remover bolhas. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade.
   3. Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades.
   4. Incubar durante pelo menos trinta minutos, com a tampa sobre a temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 ° C. As placas podem ser armazenadas em quatro graus, com a solução de agente tensioactivo nos poços até ser necessário, se devidamente selados para evitar a secagem.
   5. Lavar a placa com água estéril ou com PBS imediatamente antes de usar. Não permita que as placaspara secar após o revestimento.

2. Preparando Células

NOTA: Os detalhes da preparação de células irá variar um pouco com o tipo específico de célula a ser estudada. No entanto, temos observado essas condições para ser eficaz com uma ampla variedade de células, incluindo as linhas discutidos aqui, assim como as células-tronco embrionárias humanas e de ratinho (ESC), células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (IPSC), fibroblastos, endoderme primitiva putativo, e células estromais. Outros grupos têm utilizado este sistema com sucesso para uma ampla gama de aplicações, incluindo condrogênese a partir de células-tronco mesenquimais ^9, a geração de precursores neurais padronizado a partir de células-tronco pluripotentes ^10, as análises toxicológicas em hepatócitos ¹¹ e avaliação da regeneração da medula espinhal em salamandras ^12. O protocolo específico para trabalhar com células HT29 é mostrado aqui.

1. Comece com um frasco T75 de células HT29, cultivadas em DMEM+ 10% de FBS
2. Aspirar o meio de crescimento do balão, e adicionar 3 ml de tripsina.
3. Incubar as células durante 5 min a 37 ° C.
4. Parar a digestão de tripsina por adição de 3 ml de meio de crescimento. Tomar uma aliquota para contagem de células e transferir o restante para um tubo de centrífuga de 15 ml.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g.
6. Enquanto a centrifugação está em andamento, a contagem das células.
7. Aspirar tripsina / mistura de meio e substituir com meio de crescimento fresco, o volume determinado pela densidade celular necessária como calculado acima.
8. (OPCIONAL) Passe a suspensão de células através de um filtro para remover quaisquer aglomerados. NOTA: as condições de colheita de células irá variar um pouco entre linhas. Se um protocolo de dissociação por exemplo passagem das células de interesse está disponível, que deve ser usada como um ponto de partida. Com linhas de células sensíveis a utilização de tripsina pode resultar em morte celular excessiva. Nestes casos temos observado bons resultados usando TrypLE como uma alternativa dissociatiem ⁸ de reagente. Se as células tornam-se agregada durante dissociação e perder a viabilidade, a adição de DNAse para a solução de enzima pode resolver este problema. A redução dos tempos de dissociação e empregando uma etapa de trituração para quebrar aglomerados de células também pode aumentar a viabilidade.

3. Formação esferóide

NOTA: esferóides podem ser gerados numa grande variedade de formulações de meios, no entanto, os ensaios iniciais deve ser efectuada utilizando o meio em que as células foram cultivadas, para distinguir as consequências da transição para um sistema de cultura de 3-dimensional a partir de consequências de alterar a composição do meio.

1. Adicionar 0,4 ml de meio de crescimento em cada poço.
2. Centrifugar durante 2 minutos a 2000 xg para remover bolhas. Note-se que é importante assegurar que o rotor está adequadamente em relação a esta velocidade antes da centrifugação.
3. Usando uma baixa ampliação microscópio invertido, verificar bolhas foram removidos das cavidades.
4. Adicionar 0,4 mlsuspensão de células, a uma densidade requerida (calculado acima). Misture suavemente pipetando cima e para baixo, sem a introdução de bolhas de ar nas cavidades. É importante assegurar que as células são distribuídos uniformemente ao longo do poço, a fim de obter esferóides consistentes.
5. Centrifugar durante 5 minutos a 200 x g. Se a placa não auto-nível, durante a centrifugação, as correntes de convecção que podem surgir em resultado de distribuição desigual de células entre os micropoços. Portanto, a chapa deve ser equilibrado internamente, bem como contra a outra placa, de modo que o peso é distribuído de forma uniforme para ambos os lados da placa transportadora.

NOTA: Se a evidência da distribuição desigual de células é visto, pode ser necessário aplicar uma pequena quantidade de lubrificação para os pontos de articulação no suporte da placa - consulte o fabricante centrífuga para obter instruções.

NOTA: Uma vez que as células foram centrifugadas em micropoços, eles são razoavelmente resistante para lavagem de movimentos da placa de menores. Movimentos bruscos que resultem em chapinha do meio devem ser evitados, mas a transferência da placa de centrífuga para microscópio ou incubadora não deve resultar em deslocamento celular significativa.

6. Utilizando um microscópio invertido, verificar que as células foram agrupadas dentro dos micropoços, e que estão distribuídos uniformemente ao longo do poço.
7. Incubar durante a noite a 37 ° C.
8. Utilizando um microscópio invertido, observar o processo de formação de esferóides. Algumas linhas de células irão formar esferóides compactos dentro de 24 horas, outros podem demorar mais tempo. A progressão do aglomerado para agregar em células HT29 é mostrado na Figura 2.
9. Recuperar esferóides de micropoços e transferir para cultura de suspensão por gentilmente jorrando-los com uma pipeta. Como alternativa, manter esferóides in situ com a substituição média ⁸ - a duração depende do seu tamanho inicial e taxa de crescimento, que define o tempo até que eles superam os micropoços em que foram formados.
   1. Para substituir o meio, sem a perda de esferóides, meio aspirado na extremidade do poço com uma pipeta de Pasteur. Lentamente traga a ponta para baixo até que comece a desenhar o líquido do menisco, e siga o menisco para baixo como ele cai. Em seguida, adicionar meio fresco, contra a parede do poço, no mesmo local. Algumas esferóides podem ser perdido, no entanto se o meio é aspirado e substituído sempre na mesma posição, este permanecerá número pequeno em comparação com o grande número de poço.

Resultados

Esferóides de várias linhas tumorais de origens anatómicas diferentes pode facilmente ser gerada e extraiu-se em cultura em suspensão. Figura 3 ilustra o controlo de tamanho consistente obtidas através deste método, com populações de esferóides altamente uniformes sob cada condição. Limpar as diferenças inter-linha de comportamento também são visíveis, com células de câncer de cólon HT29 e células cancerosas do esôfago TE6 formando esferóides densamente com fronteiras bem definidas, enquanto as células de câncer de próstata LNCaP deu origem a esferóides menos coerentes com limites irregulares (ver discussão para possíveis razões ). As forças internas mais fortes nos agregados mais coerentes também resultou em colapso para uma forma mais simétrica, mesmo enquanto ainda nos micropoços em que foram formados, enquanto que os agregados LNCaP, particularmente no tamanho maior, visivelmente reter a geometria quadrado-piramidal do micropoços. A relação entre o número de células de entrada e os phys ical tamanho do esferóide resultante irá depender de um número de variáveis. Volumes teóricos baseados no produto do volume de cada célula e o número de células utilizadas pode ser reduzida pela perda de células, o que por sua vez podem incluir perda de células durante a fase de suspensão de células individuais, bem como a perda de demasiado pequenos agregados devido Números insuficientes de vizinhos e de excessivamente grandes agregados devido a limitações de transporte e necrose no núcleo. Tamanho também será influenciada por qualquer proliferação que pode ocorrer durante o processo de agregação. À medida que estes parâmetros irão variar de linha celular para linha celular, se esferóides de dimensões físicas específicas são desejados do número correcto de células para introduzir deve ser determinada experimentalmente. Como uma primeira aproximação, diâmetro esferóide deverá aumentar com a raiz cúbica do número de células incorporadas - por exemplo, um aumento de 8-vezes no número de células deverá resultar na duplicação de diâmetro esferóide.

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Figura 1. Esquema de produção esferóide. O sistema consiste de micropoços de uma matriz de quadrados micropoços-piramidal embaladas apertadamente (625 por cm ² para a 400 μ m de tamanho), em que as células podem ser centrifugadas. As células são reunidas pelas paredes laterais inclinadas, e do tamanho do esferóide resultante é controlada pela variação da densidade da suspensão celular empregue.

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Figura 2. Assembléia de células agrupadas em esferóides. Spheroids foram formados a partir de setecentos HT29 células cada. Imediatamente após a centrifugação (A), as células são fracamente aglomeradas no fundo de cada micropoço. Note-se que os aglomerados estão uniformemente deslocamento para a direita inferior, neste caso. Isto é aceitável, desde tamanhos de cluster permanecem consistentes em toda a matriz. Se as diferenças de tamanho significativo conjunto são vistos de um lado da matriz para o outro, ver a Nota no passo 3.5. Após incubação durante 24 horas (B), as forças de adesão intercelular causaram os aglomerados para agregar e formar esferóides coerentes, que podem então ser extraídos (C).

r /> Figura 3. Esferóides gerados em placas de microcavidades. Esferóides foram formados a partir de setecentos (A, C, E) ou mil e quinhentos (B, D, F), as células de cancro do cólon HT29 (A, B), células de cancro da próstata LNCaP (C, D) ou TE6 células cancerosas do esôfago (E, F). Note-se a consistência de esferóides no interior de uma preparação, bem como a variação entre as linhas de células, em particular - os agregados LNCaP soltas em comparação com o HT29 mais densamente compactados e células TE6. A barra de escala representa 200 fim.

	Formato Microwell
	AggreWell 400	AggreWell 40EX	AggreWell 800
Largura Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm )	400	400	800
Micropoços por cm2	625	625	156,25
Micropoços por poço	1200	4700	300
Células mínimos por micropoços *	N / D	N / D	2000
Células máximas por micropoços *	2000	2000	10.000
Células mínimos por bem *	N / D	N / D	6 x 10 5
Células máximas por bem *	2,4 x 10 6	9,4 x 10 6	3 x 10 6
1.1.1 - 70% do volume de etanol (ml)	0,5	2.0	0.5
1.2.1 - Lavar volume de solução (ml)	0,5	2.0	0,5
3.2 - O volume de pré-carga Médio (ml)	0,4	1.6	0,4
3.5 - O volume de carga celular (ml)	0,4	1.6	0,4
* Os números de células por micropoço são somente uma aproximação, como este valor pode variar com o tamanho das células específicas empregues, e devem ser determinadas empiricamente

Tabela 1. AggreWell opções e modificações do protocolo.

Discussão

Nós estabelecemos um sistema em que um grande número de esferóides uniformes podem ser gerados a partir de múltiplas linhagens de células de diferentes fontes. Temos ainda encontrar uma linha de células aderentes que não formam esferóides sob estas condições. Nós já observamos perda de células em populações sujeitas a anoikis ^5,8, no entanto até o momento esta questão não surgiu com linhagens tumorais. O sistema é escalonável arbitrariamente com a área de superfície, com o comportamento consistente em micropoços de 24 poços e formato de 6 poços, bem como bioreactores protótipo contendo 50.000 micropoços cada actualmente em desenvolvimento.

Deve esferóides assimetria ser uma preocupação, o tempo de incubação no passo 4.8 pode ser aumentada para dois ou três dias. Esferóides também pode ser incubada por um período de, após extracção a partir dos micropoços, para aumentar a simetria, no entanto, neste caso, deve ser tomado cuidado para manter as densidades de cultura suficientemente baixo, como esferóides em contacto um com o outro will muitas vezes se fundem em estruturas maiores. Por este motivo, já anteriormente mantidas culturas dentro dos micropoços em que foram formados os agregados, com a principal limitação é o tamanho do esferóide. Este por sua vez é uma função tanto da taxa de crescimento e o tamanho inicial ^8, e se a cultura alargada dentro da microplaca está prevista, esta deve ser considerada com antecedência. Opções para evitar crescimento excessivo, se ocorrer, incluir ou começando com esferóides menores, ou empregando os micropoços maiores da placa AggreWell 800.

Deve esferóides não conseguem aumentar a coerência ao longo do tempo, uma causa potencial pode ser a morte da célula. Particularmente em grandes agregados de células altamente metabolicamente ativas, as limitações de transporte de massa sobre o fornecimento de oxigênio e nutrientes essenciais pode resultar em um núcleo necrótico ² - portanto, um esferóide não coeso pode ser simplesmente uma conseqüência da morte excessiva de células. Alternativamente, medições da coesão mecânicação de esferóides foram usadas para avaliar a forças de ligação intercelular, em relação com o potencial metastático de uma dada linha de células ^13. Seria interessante investigar a relação entre a forma esferóide e potencial metastático, talvez usando parâmetros morfométricos como arredondamento e perímetro para razão de área.

Além de investigar as propriedades mecânicas e morfométricas de esferóides, a montagem do sistema de micropoços permite a produção em larga escala de esferóides mista de composição, que consiste em combinações de vários tipos e / ou de biomateriais ^6,7 celulares. As interacções de células tumorais com outros tipos de células é importante para modelar mais de perto o comportamento de tumores in vivo ^14, por isso, pode ser de interesse para gerar esferóides de células tumorais em combinação com os fibroblastos e células endoteliais, por exemplo. As micropartículas de vários biomateriais também pode ser incorporado, e pode afectar a esfPropriedades eroid tanto directamente, através das suas interacções com células ^7,15, e também como reservatórios para a libertação controlada de factores de crescimento e citocinas para o interior do esferóide ^16.

Se houver qualquer preocupação com a esterilidade, por exemplo quando se trabalha com uma microplaca em que alguns poços já foram usados, que podem ter passado algum tempo em uma incubadora, como parte de um experimento anterior, os poços podem ser reesterilizado com etanol 70% na água.

Uma vez que os esferóides foram formadas, elas podem também ser separadas das células não incorporados residuais por passagem da suspensão ao longo de um filtro de células. As células individuais vai passar, enquanto os esferóides será retida. Se o esferóide é suspeito de derramamento de células potencialmente metastático ao longo do curso da cultura, pode ser desejável para realizar este procedimento várias vezes - inicialmente para remover as células não incorporados, e subsequentemente para isolar purified populações das células fora dado por esferóides.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AggreWell 400 plate	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Rinsing Solution	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 µm)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Inverted microscope	VWR / Motic	CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP