Móvil en vivo de imágenes de Alphaherpes Virus Transporte anterógrada y Propagación

Resumen

Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.

Resumen

Los avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia de células vivas, así como la construcción de cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes han permitido a la visualización en tiempo real del transporte y la propagación de la infección por el virus alphaherpes de las neuronas. La utilidad de las nuevas proteínas de fusión fluorescentes a la membrana viral, tegumento, y cápsidas, en conjunción con imágenes de células vivas, identificado conjuntos de partículas virales transportados dentro de los axones. Herramientas similares se han empleado con éxito para el análisis de la célula-célula repartidas de partículas virales para cuantificar el número y la diversidad de los viriones de transmisión entre las células. Es importante destacar que las técnicas de imágenes de células vivas del transporte y la propagación anterógrada producen una gran cantidad de información, incluyendo velocidades de las partículas de transporte, la distribución de las partículas, y los análisis temporales de la localización de la proteína. Junto a las técnicas genéticas virales clásicos, estas metodologías han proporcionado una visión críticaen importantes cuestiones mecánicas. En este artículo se describe en detalle los métodos de imagen que se desarrollaron para responder a las preguntas básicas de transporte de virus alphaherpes y propagación.

Introducción

La infección del sistema nervioso periférico (SNP) por alphaherpes virus tales como el virus del herpes simple (HSV) -1, -2, y el virus de la pseudorrabia (PRV) implica varios pasos complejos y altamente regulado durante todo el ciclo de vida viral. Transporte dentro de las neuronas del SNP es fundamental durante los acontecimientos de la infección viral primaria y posterior propagación inter-host. Los mecanismos moleculares que modulan dos componentes del ciclo de vida viral, el transporte dirigido de conjuntos virales de distancia desde los cuerpos celulares dentro de los axones (transporte anterógrado) y la transmisión posterior de los viriones a las células susceptibles (propagación anterógrada) son importantes para la comprensión del herpesvirus patogénesis.

El transporte y la salida de las partículas virales en las neuronas depende de montaje de un ^1,2 virión infeccioso maduro. Ensayos previamente fijados, incluyendo inmunofluorescencia (IF) y microscopía electrónica (EM), se utilizaron para estudiar el estado de montaje de partículas y protinteracciones ein relacionados con el transporte y la propagación del virión ^3-6. Sin embargo, la naturaleza dinámica de transporte de viriones y artefactos experimentales introducidas por fijación química confunde la interpretación de imágenes fijas ^7,8. Recientemente, un número de proteínas de fusión viral-fluorescentes se han descrito para el VHS y PRV que tienen impactos insignificantes en la función de proteínas. Proteína Fluorescente Verde (GFP) y las proteínas fluorescentes rojas (mCherry o mRFP) fluoróforos a menudo se combina para permitir formación de imágenes de dos de los tres componentes estructurales de un virión maduro: cápside, tegumento, y glicoproteína ^9-11. Imágenes de células vivas de transporte anterógrado con doble etiquetado virus visualiza el estado de ensamblaje de las partículas virales durante el transporte. Fluoróforo similares expresando cepas virales se utilizan para visualizar el número y la diversidad de los genomas virales siguientes propagación ^12,13. Las propiedades de las proteínas fluorescentes (revisado en ^14,15) afectan en gran medidala capacidad de visualizar conjuntos virales o celulares. Las propiedades intrínsecas de la proteína fluorescente, incluyendo la auto-interacciones y estabilidad, deben tenerse en cuenta al diseñar y probar nuevas fusiones de proteínas para la preservación de la funcionalidad de tipo salvaje.

En conjunción con fusiones de proteínas fluorescentes, dos bien caracterizados en sistemas de cultivo celular in vitro se emplean para la formación de imágenes en vivo de células de la infección por virus del herpes: disociado ¹⁶ y compartimentada ¹⁷ (Figura 1A) neuronas de los ganglios cervicales superiores de rata (SCG). En ambos sistemas, embrionario SCG se diseccionan, disociado de los cuerpos celulares individuales, y se sembraron en el cultivo in vitro ^18. Las neuronas SCG son parte del sistema nervioso autónomo y pueden ser fácilmente cultivadas y diferenciadas por el factor de crecimiento neuronal (NGF) en una madura estado polarizado ex vivo. Neuronas SCG disociadas forman una extensa red de axones que permite fo la visualización de partículas virales que sean sometidos a transporte anterógrado ^6. Culturas SCG en compartimientos proporcionan aislamiento de fluidos del cuerpo de las células neuronales (compartimento S) y terminales de axones distales (compartimiento N) ^19. Una serie de protocolos detallados para la construcción y el uso de las neuronas compartimentada con ²⁰ originales o modificadas Campenot cámaras ¹⁷ se han publicado con anterioridad. Aislamiento neumático permite la infección selectiva de los cuerpos de las células neuronales y la detección de viriones progenie después del transporte a terminales de axones aislados. Plating células epiteliales a través de los terminales antes de la infección proporciona células receptoras para la propagación de la infección viral.

Hay muchos elementos esenciales importantes para toda la experimentación imágenes de células vivas, pero los más relevantes para nuestros protocolos son: la adquisición automatizada de imagen, la iluminación fluorescente, la velocidad de formación de imágenes, y el control del medio ambiente. Para todos los experimentos de imagen, utilizamosun,, microscopio de epifluorescencia iluminación automatizado invertida (Figura 1B). El microscopio se basa en la base de Nikon Eclipse Ti y emplea una serie de sistemas motorizados controlados por el ordenador para reconfigurar rápidamente el microscopio durante la adquisición de imágenes automatizado. Para la iluminación de fluorescencia, se utiliza un amplio espectro lámpara de arco de mercurio que puede ser atenuado con filtros de densidad neutra a lo largo de la trayectoria de iluminación. Filtros de excitación limitan el espectro de la iluminación fluorescente y cuando se combina con espejos dicroicos múltiples pasadas y filtros de emisión de fluorescencia visualizar compuestos fluorescentes específicas. Los filtros de excitación y emisión se montan en ruedas independientes, cambio rápido de filtro para permitir una rápida adquisición secuencial de diferentes canales fluorescentes. La velocidad de adquisición de la imagen se ve reforzada con una cámara EM-CCD sensible y rápido, útil para la detección de señales de baja intensidad y corta imagen tiempos de lectura. Control ambiental de la microscOpe se consigue con una tapa etapa se calienta incubadora y un calentador de lente de objetivo de mantener las muestras a temperaturas elevadas mientras se pasa un ambiente humidificado y CO ₂ enriquecido en la incubadora. El microscopio se mantiene en una habitación oscura con una temperatura ambiente mantenida cerca de 25 ° C y la luz fuera minimizada con cortinas en todas las ventanas. Los protocolos siguientes describen el uso de este sistema para el transporte anterógrado y ensayos de propagación.

Una serie de alternativas existen para el control de las variables de imágenes de células vivas. El control de la configuración de microscopía se puede realizar manualmente o por medio de sistemas automatizados que dependen de software propietario. Iluminación de fluorescencia se puede lograr con fuentes de láser de halógeno, o LED. La velocidad de formación de imágenes es modificado por la velocidad de conmutación de filtro y el tiempo para visualizar la señal con el sistema de detección emparejado. El control ambiental se puede lograr con hardware especializado en la millasetapa copio, recinto de la totalidad o parte del microscopio en una caja calentado y humidificado, o mediante la elevación de la temperatura de la habitación donde se llevará a cabo la microscopía. Cada una de estas alternativas tiene ventajas y desventajas relacionadas con el coste y el rendimiento.

En el protocolo posterior, que detalle el uso de imágenes de células vivas para estudiar el transporte rápido anterógrada y la propagación de los virus alphaherpes anterógrada a través de la utilización de cepas virales recombinantes. Imágenes de células vivas en tiempo real visualiza la cápside, tegumento, y / o glicoproteína co-localización de estructuras dinámicas que experimentan transporte dentro de los axones ^11. Imágenes timelapse noche de cultivos neuronales compartimentadas visualiza axonal salida del virión y la infección de células susceptibles ^12. Los protocolos que aquí se presentan se han optimizado para su uso con el sistema de imagen en particular, sino que se presenta en términos generales en relación con los cuatro elementos de imágenes de células vivas. En la discusión quevoluntad más detalle algunos de la optimización que es necesario para la experimentación con éxito.

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Protocolo

Sección 1 - Condiciones de Control Ambiental para microscopía de fluorescencia en vivo de células

1. 30 min antes de cualquier experimento de imágenes conectar y empieza a calentarse el microscopio etapa superior incubadora.
   1. Encienda el microscopio, las fuentes de luz transmitida y epifluorescencia y controles de hardware automatizado. Abra el software de control de microscopio, los elementos de NIS, para conectar con el microscopio y empiece a enfriarse la cámara EM-CCD.
   2. Coloque la lente más caliente al objetivo correspondiente (60X o 100X de inmersión en aceite) Nota:. Seleccione lente objetivo según el tipo de experimento. El contraste de interferencia diferencial 100X (CID) es mejor para el seguimiento de conjuntos de virión transporte anterógrado mientras que la fase de objetivo 60X es adecuado para visualizar propagación anterógrada. Bajo aumento, objetivos de inmersión no petroleras no requieren una lente más caliente, ya que no entran en contacto directo con la muestra.
   3. Conecte la etapa superior incubadora en la platina motorizada de mi copio. Asegurar la inserción adecuada que mantenga la muestra está en su lugar. Conecte la línea de aire húmedo desde el control de la incubadora al puerto de entrada de la etapa superior incubadora.
   4. Encienda la incubadora y la lente de controles más cálidos y ajustar la configuración de temperatura a las condiciones previamente verificados específicos para el objetivo y la muestra que se está fotografiado (véase el debate).
   5. Abra la válvula de control del 5% de CO _2/95% del depósito atmosférico para dar CO ₂ del aire complementado a la etapa superior incubadora. La velocidad de flujo debe estar entre 60 y 80 ml de gas por minuto. Mayor velocidad se traducirá en una amplia muestra de deshidratación a pesar de la cámara de humidificación.
2. Añadir el aceite de lente objetivo y colocar inmediatamente la cultura que serán fotografiadas a la etapa superior incubadora.
3. Permitir el equilibrio de la temperatura en el cultivo durante un mínimo de 10 min. Se prefiere una hora, especialmente para formación de imágenes durante la noche se describe en la Sección 3.

ve_title "> Sección 2 - imagen en tiempo real de anterógrada Virion Protocolo de transporte Eventos

1. Seis a ocho horas antes de la imagen, infectar un plato de 35 mm cubreobjetos-parte inferior de maduros, las neuronas SCG disociadas con 1 x 10 ⁶ unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012a ^11. Si va a probar más de un virus, off-set inoculaciones por 30-60 minutos para permitir la formación de imágenes de muestras secuenciales en similares tiempos después de la infección.
2. Inserte plato a la etapa superior incubadora durante un mínimo de 10 minutos antes de ejecutar cualquier experimento. Mientras que la temperatura se equilibre, el plano focal está cambiando y va a afectar negativamente los experimentos de imagen.
3. Con luz transmitida y el ocular del microscopio, encontrar un cuerpo celular neuronal que tiene una extensión axonal claramente aislados. También puede utilizar la iluminación fluorescente adecuado para encontrar una célula que expresa deteccióncantidades de mesa de proteínas fluorescentes. Es importante limitar la exposición de la muestra a la iluminación fluorescente, en este paso y pasos subsiguientes, debido a daño celular inducido por la luz y blanqueo de proteínas fluorescentes.
4. Atenúa la iluminación de fluorescencia para reducir la intensidad de la luz de excitación a la que están expuestas las células. Involucrar a la luz atenuando densidad neutra (ND) filtros de la trayectoria de la luz de iluminación de fluorescencia. Para las películas que duran más de 1 min, un mínimo de ND4 deben ser usados ​​para prevenir foto-blanqueo de proteínas fluorescentes y extensa foto-daño de los axones. Estructuras altamente fluorescentes normalmente se pueden visualizar con un ND8 filtro en su lugar.
5. Utilizando el software de microscopio (Figura 2 y Suplementario Movie 1A), cambiar la trayectoria de la luz a la cámara EM-CCD.
6. Determinar tiempos de imagen óptima y las condiciones para cada canal fluorescente.
   1. Inicie una ventana de la imagen en vivo mediante el botón "Play".
   2. Determine los ajustes de exposición de cámara óptimos para cada proteína fluorescente. No exceder 300 ms por canal como aberraciones dinámicas sobre los rápidos estructuras virión movimiento ocurrirá. Utilizar la ganancia EM de la cámara a un ajuste de 300 (fabricante sugirió ganancia máxima), para reducir al mínimo el tiempo de exposición y mejorar la detección de señales débiles. Tiempos de exposición correctos deben producir una imagen con una baja intensidad de fondo y de señales de alta específicos.
7. Después de la determinación de riesgos y la búsqueda de una región bien definida de axón, el software debe ser configurado para realizar la adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo de la muestra para evitar el blanqueo.
   1. En el software de elementos NIS, seleccione el 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú "Aplicaciones" del menú desplegable.
   2. En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora que determinará la frecuencia de adquisición de imágenes. Establezca el intervalo de "Sin demora" y la duración a 5 min. Thsoftware e adquirirá entonces cuadros de imagen a la mayor frecuencia posible duración de 5 min.
   3. Seleccione la pestaña "Lambda", que permite la selección de las configuraciones de hardware predeterminados utilizados para la adquisición de imágenes fluorescente múltiple. Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable para seleccionar una configuración de hardware apropiada. Repita el procedimiento para todas las proteínas fluorescentes que se va a examinar.
   4. Asegúrese de que las pestañas de "posiciones XY", "Z-series" y "agrandar" son de-seleccionados.
   5. Encima de las pestañas, seleccione la casilla "Guardar en archivo" para guardar automáticamente las imágenes en el disco duro durante la adquisición. Configurar la ubicación y el nombre de archivo del archivo de salida experimento. A medida que se realizan experimentos secuenciales, el software añadirá un número secuencial al final del nombre de archivo designado.
   6. Una vez que todas las fichas han sido seleccionados. Iniciar el experimento haciendo clic en el botón "Run-Now".
   7. Optimizar la velocidad de adquisición de imágenes a través de los ajustes de exposición y imagtamaño e. Uso de una pequeña región de la zona de imagen-a menudo capaces de acelerar las velocidades de adquisición de marco. Definir la zona de interés con la función ROI en NIS-Elements, seleccionar un área de entre 25% y 50% del área total de la imagen. Por otra parte, los tiempos de exposición más cortos aumentarán las tasas de adquisición de marco, pero disminuye la calidad de la señal (véase el debate).

Sección 3 - Noche time-lapse de anterógrada Spread Eventos

1. Cuatro horas antes de la imagen, infectar un cultivo neuronal compartimentada construida en un 35 mm μ-plato. Inocular los cuerpos celulares neuronales con 1 x 10 ⁶ unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012b ^12.
2. Coloque suavemente placa de cultivo en la etapa superior incubadora. Asegúrese de que la posición del objetivo se establece en el lado del plato. Lentamente el objetivo en el enfoque, garantición del objetivo no empuja hacia arriba dentro de la muestra. Una vez que el campo de enfoque ha sido identificado, mueva lentamente el objetivo en el centro del plato, cerca de la barrera interna demarcación de la parte interna del compartimiento de axón. Durante el movimiento, asegurar que se mantiene la profundidad de foco y evitar empujando hacia arriba en la muestra. La desviación de la superficie de plástico por el objetivo dañará los axones y el plástico.
3. Añadir aproximadamente 2 ml de agua tibia (~ 37 ° C) solución salina tamponada con fosfato a la placa de cultivo fuera del anillo de teflón. Esta rodea la cultura neuronal con un anillo de PBS para reducir al mínimo la deshidratación de la muestra y proporcionar aislamiento térmico.
4. Deje que la temperatura se equilibre durante un mínimo de 1 hora antes de iniciar la adquisición de imágenes automatizado (3.8). Pasos 3.5 a través de 3.7 se pueden configurar durante este tiempo.
5. Restringir la intensidad de la iluminación al nivel más bajo posible mediante la participación de todos los filtros de densidad neutra. Esto permitirá la adquisición de imágenes frecuentes over períodos de tiempo largos sin excesivo foto-daño. La reducción de la iluminación se traducirá en una señal baja, que requieran exposiciones largas (véase el debate).
6. Utilice los ajustes históricos de exposición o antes de montaje experimental generar un plato en paralelo de las células epiteliales infectadas que expresan las proteínas fluorescentes de destino para establecer los ajustes de exposición como se describe en la Sección 2.5.
7. Después de ajustar la exposición para los canales necesarios, es el momento de configurar el software de adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo para limitar muestra de blanqueo.
   1. En el software de elementos (Figura 2 y la película suplementario 2), seleccione la 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú "Aplicaciones" down menú para abrir la ventana de adquisición ND.
   2. En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora. Establezca el intervalo de "5 minutos". Ajuste de la duración de 20 horas. El campo de bucles se calcula automáticamente para el número de repeticiones, el program va a realizar.
   3. Seleccione la pestaña "Lambda". Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable, seleccione la configuración lambda apropiado para contraste de fase. Repita el procedimiento para las posiciones siguientes, la selección de las configuraciones adecuadas para cada proteína fluorescente a explorar.
   4. Seleccione la pestaña "Imagen grande", que determina los parámetros de varias imágenes que se combinan en un solo campo de visión más amplio. Un área de buen tamaño se compone de 5 x 2 imágenes utilizando un 7% de superposición costura. Esto permitirá que el número máximo de células por posición en ser fotografiado sin afectar la frecuencia de adquisición de la imagen. Además, desactive la casilla de verificación de "Shutter Cerrar activo durante el movimiento Stage". Esta opción mejora la velocidad de adquisición por parte de no cerrar persianas entre imágenes.
   5. Seleccione la pestaña "XY posiciones", para identificar múltiples posiciones que serán secuencialmente fotografiadas en paralelo durante el curso de la película durante la noche. Seleccione las posiciones que definen la po centroint para cada gran área de la imagen. Seleccionar 6-8 posiciones de la imagen en la muestra. Un buen área de la imagen tendrá pequeños grupos de células en estrecha aposición a los axones claramente definidos. Las células no deben ser apilados en la parte superior de cada otra y axón agrupación debería reducirse al mínimo. El punto de enfoque es el núcleo de la célula. Coloque el objetivo de tal manera que una envoltura nuclear se ve claramente definido para la mayoría de las células.
   6. Asegúrese de que la pestaña de "Z-series" no está seleccionada.
   7. Configurar la función de guardado automático como se describe en la Sección 2.6.5.
   8. Prueba de la exposición y la posición haciendo clic "1 bucle de tiempo". Evaluar las imágenes resultantes para la iluminación de luz transmitida, el enfoque y encuadre. Si el foco se ha desplazado, restablezca el enfoque para cada posición en la pestaña XY. Espere 10 minutos y repita este paso hasta que el enfoque es estable.
   9. Después de todos los ajustes se han verificado y probado, iniciar el experimento automático haciendo clic en el botón "Ejecutar ahora".

Sección 4 - Procesamiento de Imágenes y Exportación

Exportación de datos

1. Los conjuntos de datos obtenidos durante la exploración de células vivas de eventos de transporte o propagación deben ser exportados desde el software de elementos NIS en tipos de archivo más utilizados para su posterior uso en presentaciones y publicaciones (Supplemental Movie 3). Para exportar películas abren la prima nd2 archivo adecuado. Elementos de NIS y seleccione la vista "split-componente" para visualizar los canales fluorescentes deseados. Reproducir el archivo a una velocidad adecuada, a 5 fotogramas por segundo es un buen punto de partida para la visualización de transporte rápido.
2. Incluir una indicación de la hora de representar a un reloj en tiempo real durante la reproducción de películas. Haga clic derecho sobre la imagen y seleccionar Añadir ND-información. Un contador digital aparecerá en la esquina superior izquierda.
   1. Edite el sello de tiempo para mostrar la información. Haga clic derecho sobre la barra y seleccione Editar-ND información. En la siguiente ventana emergente, edite el texto para reflejar la imaginaciónng parámetros que son importantes. Editar fuente, el color y el tamaño para mayor claridad.
3. Vaya al menú "Editar" y encontrar "Crear vista instantánea" o pulse la tecla "x". Este comando abre la ventana "visión instantánea". Seleccione "Aplicar a todos los fotogramas" para generar un 8 bits, RGB, archivo listo para exportar que contiene los canales fluorescentes de toda la película.
4. Guardar como un archivo. Avi para la compatibilidad multiplataforma. Ajuste la velocidad de reproducción en 200 milisegundos por cuadro. Los archivos. Avi generados por elementos NIS se pueden comprimir más con otro software de conversión en el tipo de archivo deseado.

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Resultados

Transporte anterógrado

La aplicación de este protocolo para las infecciones de las culturas SCG disociadas con PRV 348, una cepa recombinante PRV expresando GFP-US9 y proteínas de fusión de membrana gM-mCherry, ha facilitado la visualización del transporte anterógrado de viriones (Figura 3 y complementario Movie 4). La incorporación de estas proteínas de fusión en partículas víricas en los resultados de su detección en el transporte de puntos lagrim...

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Discusión

El objetivo de imágenes de células vivas es la observación de los procesos biológicos que ocurren sin una alteración significativa en el acto de la observación. Este objetivo se logra mediante la optimización de tres variables: el control del medio ambiente, la velocidad de formación de imágenes, y la iluminación de fluorescencia. Estas variables interdependientes deben ser equilibradas para lograr condiciones de la imagen viables. Los protocolos presentados utilizan condiciones específicas para producir los ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom culture dish	MatTek Corporation; Ashland, MA	P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish	Ibidi USA LLC, Verona, WI	81156
Microscope body	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage	Prior Scientific; Rockland, MA	H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels	Prior Scientific	HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source	Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada	X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets	Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD camera	Andor Technology USA; South Windsor, CT	iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator	Live Cell Instruments; Seoul, South Korea	TC-L-10
Objective lens heater	Bioptecs; Butler, PA	150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software	Nikon Instruments Inc.; Melville, NY	NIS Elements