Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Özet

Alphaherpes virüs enfeksiyonlarının Canlı hücre görüntüleme yönelik ulaşım ve hücreler arası yayılma dinamik olayların analizi sağlar. Burada, birincil nöronların enfeksiyon sırasında viral meclislerinin görselleştirme kolaylaştırmak için floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar kullanmak yöntemleri sunuyoruz.

Özet

Canlı hücre floresan mikroskopi teknikleri, hem de floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar yapımında gelişmeler taşıma ve nöron alphaherpes virüs enfeksiyonunun yayılmasını gerçek zamanlı görsel sağladı. Canlı hücre görüntüleme ile birlikte viral membran, zar ve capsids için yeni floresan füzyon proteinlerin programı, akson içinde ulaşım geçiren viral partikül meclisleri tespit. Benzer araçları başarıyla hücreler arasında iletilen virionlann sayısı ve çeşitliliği ölçmek için viral parçacıkların yayılması, hücre-hücre analizi için kullanılmıştır. Önemlisi, anterograd ulaşım ve yayılma canlı hücre görüntüleme teknikleri parçacık taşıma hızları, parçacıkların dağılımları, ve protein yerelleştirme zamansal analizleri de dahil olmak üzere bilgi hazinesi üretmek. Klasik viral genetik teknikleri yanı sıra, bu yöntem kritik bilgiler sağladıönemli mekanik soruları. Bu yazıda ayrıntılı olarak alphaherpes virüs taşıma ve yayılmasının temel sorulara cevap için geliştirilmiştir görüntüleme yöntemleri açıklar.

Giriş

Alphaherpes herpes simpleks virüsü gibi virüsler (HSV) -1, -2, ve pseudorabies virüs periferik sinir sistemi (PNS) enfeksiyon (PRV) viral yaşam döngüsü boyunca çeşitli karmaşık ve oldukça düzenli bir adımdan oluşur. PNS nöronlar içinde Ulaştırma primer viral enfeksiyon ve sonraki arası ana yayılma hem de olaylar sırasında önemlidir. Viral yaşam döngüsü iki bileşeni modüle moleküler mekanizmalar; uzak akson (ileriye taşıma) ve duyarlı hücreleri (ileriye yayılması) için virionlar sonraki iletim içinde hücre organlarından viral meclislerin yönettiği taşıma anlayışı herpes patogenezinde için önemlidir.

Nöronlarda viral parçacıkların taşıma ve çıkış olgun bir bulaşıcı virion ^1,2 montajı bağlıdır. Immünofloresan (eğer varsa) ve elektron mikroskopisi (EM) dahil olmak üzere, daha önceden belirlenmiş deneyleri, parçacık montaj durumu ve prot incelemek için kullanılmıştırein etkileşimleri virion ulaşım ve yayılması ^3-6 ile ilişkilidir. Ancak kimyasal sabitleme tarafından tanıtıldı taşıma virionların ve deneysel eserler dinamik yapısı sabit görüntülerin ^7,8 yorumlanması eleştirilmiştir. Son zamanlarda, viral floresan füzyon proteinleri bir dizi protein fonksiyonu üzerinde ihmal edilebilir etkilere sahip HSV ve PRV için tarif edilmiştir. Kapsid, zar ve glikoprotein ^9-11: Yeşil floresan proteini (GFP) ve Kırmızı floresan proteinleri (mCherry veya MRFP) fluorophores genellikle olgun bir virionun üç yapısal bileşenlerinin iki görüntüleme sağlamak için eşleştirilmiş. Çift etiketli virüs kullanarak ileriye taşıma hücre görüntüleme Canlı taşıma sırasında viral parçacıkların montaj durumunu görüntüler. Viral suşlar ifade Benzer florofor sayısı ve yayılma ^12,13 aşağıdaki viral genomların çeşitliliği görselleştirmek için kullanılır. Floresan proteinleri özellikleri ^(14,15 gözden) büyük ölçüde etkileyebilirviral veya cep meclisleri görselleştirmek için yeteneği. Yabani tip işlevselliği korunması için yeni bir protein füzyonları, tasarımı ve test kendi kendine etkileşimleri ve kararlılığı dahil floresan protein içsel özellikleri, dikkate alınmalıdır.

Floresan proteini füzyon, iki in vitro hücre kültürü sistemlerinde iyi karakterize ile birlikte herpes virüsü enfeksiyonu canlı hücre görüntüleme için kullanılır: ayrışmış ¹⁶ ve ¹⁷ (Şekil 1A) sıçan üstün servikal ganglion (SCG) nöronlar bölümlere. Her iki sistemde de, embriyonik SCG en tek hücre gövdeleri için ayrışmış, disseke edilir ve in vitro kültür ¹⁸ için kaplama. SCG nöronlar otonom sinir sisteminin bir parçasıdır ve kolayca olgun bir polarize devlet ex vivo olarak kültür ve nöronal büyüme faktörü (NGF) ile ayırt edilebilir. Ayrışmış SCG nöronlar f sağlayan akson uzun bir ağ oluşturmakya da anterograd ulaşım ⁶ geçmesi gibi viral parçacıkların görselleştirme. Bölümlere SCG kültürler nöronal hücre gövdesi (S bölmesi) ve distal akson Termini (N bölmesi) ¹⁹ akışkan izolasyonu sağlar. Orijinal ²⁰ veya modifiye Campenot odaları ¹⁷ ile bölümlere nöronların yapımı ve kullanımı için ayrıntılı protokoller bir dizi daha önce yayınlanmıştır. Akışkan izolasyon nöronal hücre gövdeleri ve izole akson Termini ulaşım sonra döl virionlar tespit seçici enfeksiyonu için izin verir. Enfeksiyon öncesi termini üzerinde epitel hücreleri kaplama viral enfeksiyonun yayılması için alıcı hücreler içerir.

Orada tüm canlı hücre görüntüleme deney için önemli birçok temel unsurlardır, ama bizim protokoller için en uygun olan: otomatik görüntü elde etme, floresan aydınlatma, görüntüleme hızı ve çevre kontrolü. Tüm görüntüleme deneyleri için, kullandığımızters, otomatik, Epifloresans aydınlatma mikroskobu (Şekil 1B). Mikroskop Nikon Eclipse Ti tabanı etrafında inşa ve hızlı bir şekilde yeniden otomatik görüntü alımı sırasında mikroskop için bilgisayar kontrollü motorlu sistemleri bir dizi istihdam etmektedir. Floresan aydınlatma için, aydınlatma yol boyunca nötral yoğunluk filtreleri ile zayıflatılmış olabilir geniş spektrumlu cıva ark lambası kullanın. Tahrik olma filtreleri floresan aydınlatma spektrum sınırlamak ve çok geçişli çift renkli aynalar ve floresan emisyon filtreleri özel floresan bileşikler görselleştirmek ile eşleştirilmiş. Uyarma ve emisyon filtreleri farklı floresan kanalların hızlı sıralı satın sağlamak için bağımsız, hızlı geçiş filtresi tekerlekler monte edilmiştir. Görüntü elde etme hızını daha düşük yoğunluklu sinyal ve kısa görüntü kez okundu tespiti için yararlı bir hassas ve hızlı EM-CCD kamera, ile geliştirilmiştir. Microsc üzerinde çevresel kontrolyerdir kuluçka ısıtılmış bir aşamada üst ve nemlendirilmiş bir _CO2 ile zenginleştirilmiş bir atmosfer inkübatör içine geçirilir ise yüksek ısılarda örnekleri korumak için bir objektif lens ısıtıcı ile elde edilir. Mikroskop yakın 25 kadar muhafaza ortam sıcaklığı ile karanlık bir odada tutulur ° C ve tüm pencereler karartma perdeleri ile minimize dış ışık. Aşağıdaki protokoller ileriye taşıma ve yayılması deneyleri için bu sistemin kullanımını tarif eder.

Alternatif bir dizi canlı hücre görüntüleme değişkenleri kontrol etmek için var. Mikroskopi ayarları kontrol elle ya da özel bir yazılım bağımlı otomatik sistemleri ile yapılabilir. Floresan aydınlatma, halojen, LED veya lazer kaynağı ile elde edilebilir. Görüntüleme hızı filtre anahtarlama hızını ve eşleştirilmiş algılama sistemi ile sinyal görselleştirmek için zaman değiştirilir. Çevre kontrolü mi üzerindeki özel donanım ile elde edilebilircroscope sahne, tamamını veya bir ısıtmalı ve nemlendirilmiş kutusuna mikroskop bir parçası, ya da mikroskop yapılacaktır oda sıcaklığı yükseltmek yoluyla bir muhafaza. Bu alternatiflerin her biri maliyet ve performans ile ilgili avantajları ve dezavantajları vardır.

Sonraki protokol, detay rekombinant viral suşlar aracılığıyla hızlı ileriye taşıma ve alphaherpes virüslerin ileriye yayılmasını incelemek için canlı hücre görüntüleme kullanımı. Gerçek zamanlı canlı hücre görüntüleme kapsid, zar ve / veya akson ¹¹ içinde ulaşım geçiren dinamik yapılara glikoprotein co-lokalizasyon görüntüler. Bölümlere nöronal kültürlerin bir gecede timelapse görüntüleme duyarlı hücrelerin ¹² aksonal virionu çıkış ve enfeksiyon görüntüler. Burada sunulan protokolleri bizim özellikle görüntüleme sistemi ile kullanım için optimize edilmiş, ancak canlı hücre görüntüleme dört elementin göre geniş anlamda sunulmuştur. TartışmasındaDaha fazla ayrıntı deney başarılı için gerekli olan optimizasyon bazı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bölüm 1 - Canlı hücre Floresan Mikroskopi için Çevresel Kontrol Koşulları

1. Herhangi bir görüntüleme deney öncesinde 30 dakika bağlanmak ve mikroskop sahne üst inkübatör ısınma başlar.
   1. Mikroskop, iletilen ve epifluorescent ışık kaynakları ve otomatik donanım kontrolleri açın. Mikroskop bağlanmak ve EM-CCD kamera soğutma başlamak için mikroskop kontrol yazılımı, NIS Elemanları, açın.
   2. . Lens uygun objektif (ya 60X veya 100X immersiyon yağı) için sıcak Not takın: deney türüne göre objektif lens seçin. 60X faz amacı ileriye yayılması görselleştirmek için uygundur ise 100X diferansiyel girişim kontrast (DIC) ileriye taşıma virion meclislerinin takibi için en iyisidir. Bu örnek ile doğrudan temas yok gibi düşük büyütme, petrol dışı daldırma hedefleri bir lens sıcak gerektirmez.
   3. Mi ve motorlu sahneye aşamasında üst inkübatör takın croscope. Örnek yerde tutacaktır uygun eklemek emin olun. Inkübatör kontrolünden sahne üst inkübatör üzerindeki giriş portuna nemlendirilmiş hava hattı takın.
   4. Inkübatör ve lens sıcak kontrolleri açın ve (tartışma) görüntülü olan objektif ve örnek için özel önceden doğrulanmış koşullarına sıcaklık ayarları.
   5. % 5 CO ₂ / üst inkübatör sahneye CO ₂ ilave hava sağlamak için% 95 atmosferik tankı üzerindeki kontrol vanasını açın. Akış hızı dakikada gaz 60 ila 80 ml olmalıdır. Daha hızlı oranları nemlendirme odası rağmen geniş örnek dehidratasyon neden olacaktır.
2. Objektif lens için lens yağ ekleyin ve hemen sahne üst inkübatör içine yansıması olan kültür yerleştirin.
3. 10 dakika içinde en az kültür sıcaklığının dengeleme izin verir. Bir saat, özellikle Bölüm 3'te açıklanan gece görüntüleme için, tercih edilir.

ve_title "> Bölüm 2 - İleriye Virion ulaşım etkinlik Protokol Gerçek zamanlı Görüntüleme

1. Altı ile sekiz saat önce görüntüleme, Taylor ve de tarif edilen yöntem kullanılarak ilgi konusu virüs 1 x 10 ⁶ plak oluşturan birim olgun, ayrışmış SCG nöron, bir 35 mm lamel alt çanak (örneğin virüsler için Tablo 1) hastalık ark. 2012A ^11. 30-60 dakika tarafından birden fazla virüs, off-set aşılar test benzer zamanlarda, enfeksiyondan sıralı örneklerin görüntüleme sağlamak için eğer.
2. Herhangi bir deney çalıştırmadan önce 10 dakika en az sahne üst inkübatör içine çanak yerleştirin. Sıcaklık equilibrates ise, odak düzlemi kayıyor ve olumsuz herhangi bir görüntüleme deneyleri etkileyecektir.
3. Iletilen ışık ve mikroskop mercek kullanarak, açık bir şekilde izole akson uzantısı olan bir nöronal hücre gövdesi bulabilirsiniz. Alternatif olarak, algılama ifade eden bir hücre bulmak için uygun floresan aydınlatma kullanınfloresan proteinleri tablosu miktarda. Çünkü ışığın neden olduğu hücresel hasar ve floresan proteinleri beyazlatma, bu adım ve daha sonraki aşamalarda, floresan aydınlatma için bir örnek maruz kalmasını sınırlamak için önemlidir.
4. Hücrelerin maruz kaldığı uyarma ışık yoğunluğunu azaltmak için floresan aydınlatma zayıflatır. Nötr Yoğunluk (ND) floresan aydınlatma ışık yolu filtre hafifletici ışık meşgul. Uzun 1 dakika, ND4 en az uzun süren film floresan proteinleri fotoğraf beyazlatma ve akson foto-hasarı geniş önlemek için kullanılmalıdır için. Yüksek floresan yapıları genellikle yerde bir ND8 filtresi ile görüntülenebilir.
5. Mikroskop yazılım (Şekil 2 ve Ek Film 1A) kullanarak, EM-CCD kamera için ışık yolu açın.
6. Her floresan kanal için en iyi görüntüleme süreleri ve koşulları belirler.
   1. "Play" düğmesini kullanarak bir canlı görüntü penceresi başlatın.
   2. Her floresan protein için en uygun kamera pozlama ayarları belirleyin. Hızlı hareket eden virion yapıların devinişsel sapmaları olarak kanal başına 300 milisaniye aşmayın meydana gelecektir. (Üretici maksimum kazanç önerilen), maruz kalma süresi en aza indirmek ve loş sinyallerin tespiti geliştirmek için 300 bir ayara kameranın EM kazanç yararlanın. Doğru pozlama süreleri düşük arka plan yoğunluğu ve yüksek özgül sinyalleri bir görüntü elde edilmelidir.
7. Pozlama ayarı ve akson bir iyi tanımlanmış bir bölge bulduktan sonra, yazılım otomatik görüntü elde etme gerçekleştirmek için yapılandırılmalıdır. Ağartma örnek önlemek için canlı görüntüleme penceresi durdurun.
   1. NIS Elements yazılımı olarak, 6D seçin - Define / menü aşağı "Uygulamalar" açılan Deney uygulamasını çalıştırın.
   2. ND satın alma penceresinde, görüntü elde etme sıklığını belirleyecek Zaman sekmesini tıklatın. "Hayır Gecikme" ve süresi 5 dk için Aralığı ayarlayın. The yazılımı daha sonra 5 dakika süresi için mümkün olan en yüksek frekansta görüntü kareleri kazanacaklardır.
   3. Birden fazla floresan görüntü elde etmek için kullanılan önceden belirlenmiş donanım yapılandırmaları seçimi sağlar "Lambda" sekmesini seçin. Ilk kutusunu tıklatın ve menü aşağı sonraki açılan uygun bir donanım yapılandırması seçin. Yansıması için, flüoresan protein için tekrarlayın.
   4. "XY Pozisyonlar", "Z-serisi" ve "büyük resim" için sekmeleri de-seçilmiş olduğundan emin olun.
   5. Sekmeler üzerinde, işaretli kutusu otomatik olarak satın alma sırasında sabit diske görüntüleri kaydetmek için "Save to File" seçeneğini seçin. Deney çıktı dosyasının konumunu ve dosya adını yapılandırın. Sıralı deneyler olduğundan, yazılım belirlenen dosya adının sonunda bir sıra numarası ekler.
   6. Bir kez tüm sekmeleri seçilmiştir. "Run-Now" butonuna tıklayarak deneme başlatın.
   7. Pozlama ayarları ile görüntü elde etme oranı optimize ve image boyutu. Görüntü mümkün alan küçük bir bölge kullanarak genellikle kare elde etme oranları hızlandırır. % 25 ve toplam görüntü alanının% 50 arasında bir alan seçerek, NIS-Elements ROI aracını kullanarak İlgi Bölge tanımlayın. Alternatif olarak, daha kısa pozlama süreleri kare elde etme oranlarını artırmak, ama (tartışma) sinyal kalitesini düşürür olacaktır.

Bölüm 3 - İleriye spread Olayların Gecelik Time-lapse Görüntüleme

1. Görüntüleme önce dört saat, bir 35 mm μ-Bulaşık üzerine inşa edilmiş bir bölümlere nöronal kültür bulaştırmak. Taylor ve ark tarif edilen yöntem kullanılarak (örneğin virüsler için Tablo 1) ilgi konusu virüs 1 x 10 ⁶ plak oluşturan birim nöronal hücre gövdeleri inoküle. 2012b ^12.
2. Yavaşça sahne üst inkübatör içine kültür çanak yerleştirin. Nesnel yerini yemeğin tarafına ayarlandığından emin olun. Yavaş yavaş odak, ensur içine objektif getirmekamaç ing örnek içine itmek değildir. Odak alanı tespit edildikten sonra, yavaş yavaş akson bölmesinin iç tarafında demarking iç bariyer yakın, çanak merkezi haline amacı taşıyın. Hareket sırasında, odak derinliği korunmasını sağlamak ve örnek içine iterek kaçının. Amacı ile plastik yüzey sapma akson ve plastik zarar verir.
3. Sıcak (~ 37 ° C) fosfat Teflon ring dışında kültür çanak tamponlu tuzlu. Yaklaşık 2 ml Bu örnek, dehidratasyon en aza indirmek ve ısı yalıtımı sağlamak için PBS bir halka ile nöronal kültür çevreler.
4. Sıcaklığı otomatik görüntü elde etme (3.8) başlatmadan önce 1 saat en az gelmesini sağlayınız. 3.7 adımları 3.5 Bu süre içinde yapılandırılabilir.
5. Tüm nötral yoğunluk filtreleri yaparak mümkün olan en düşük seviyeye aydınlatma yoğunluğunu kısıtlayın. Bu sık sık görüntü elde etme ove sağlayacakfotoğraf-zarar aşırı olmadan r uzun süreler. Aydınlatma azaltılması uzun pozlama (tartışma) gerektiren, düşük sinyal neden olur.
6. Tarihsel pozlama ayarları veya set-up Bölüm 2.5 'te açıklandığı gibi hedef floresan proteinleri pozlama ayarlarını yapmak için ifade enfekte epitel hücrelerinin paralel bir tabak oluşturmak deneysel önce kullanın.
7. Gerekli kanallar için pozlama ayarı sonra, otomatik görüntü elde etmek için yazılım yapılandırma zamanıdır. Ağartma örnek sınırlamak için canlı görüntüleme penceresi durdurun.
   1. Elements yazılımı (Şekil 2 ve tamamlayıcı film 2) olarak, 6D seçin - ND Toplama pencere açmak için aşağı "Uygulamalar" açılır menüsünden Deney uygulama tanımlayın / çalıştırın.
   2. ND Toplama penceresinde, Zaman sekmesini tıklatın. "5 dakika" için Aralığı ayarlayın. 20 saat için süre ayarlayın. Döngüler alanı otomatik olarak progra tekrar sayısı için hesaplanırm gerçekleştirir.
   3. "Lambda" sekmesini seçin. Ilk kutusunu tıklatın ve menü aşağı sonraki açılan Faz kontrast için uygun lambda yapılandırma seçin. Görüntülü her floresan protein için uygun konfigürasyonları seçerek, sonraki pozisyonlar için tekrarlayın.
   4. Bir görüş tek bir büyük alana birleştirilmek üzere birden fazla görüntü parametrelerini belirleyen "Büyük Resim" sekmesini seçin. İyi bir büyüklükte alan 7% dikiş üst üste kullanarak 5 x 2 görüntü oluşur. Bu görüntü elde etme sıklığını etkilemeden yansıması için pozisyon başına hücre sayısı için izin verir. Ayrıca, "Sahne hareketi sırasında Kapat Active Shutter" için onay kutusunu kaldırın. Bu seçenek görüntüler arasında kepenkleri kapatarak değil tarafından satın hızını artırır.
   5. , "XY Pozisyonlar" sekmesini seçin sırayla gecede filmin sırasında paralel olarak yansıması olacaktır birden fazla pozisyon belirlemek için. Merkezi po tanımlamak pozisyonları seçinher büyük resim aralıkları için int. Örnek 6-8 görüntü pozisyonları seçin. İyi bir görüntü alanı açıkça tanımlanmış akson yakın apozisyon hücrelerin küçük kümeler olacak. Hücreler en aza indirilmelidir birbirleriyle ve akson donatılacak üstüne yığılmış olmamalıdır. Odak noktası hücrenin çekirdeğini oluşturur. , Açık bir şekilde tanımlanmış çekirdek zarı hücrelerin çoğunluğu için görülür ki bu amaç yerleştirin.
   6. "Z-serisi" sekmesi seçili olduğundan emin olun.
   7. Yukarıda Bölüm 2.6.5 açıklandığı gibi otomatik kaydetme özelliği yapılandırın.
   8. "1 kez döngü" tıklayarak pozlama ve pozisyon ayarları test edin. Iletilen ışık aydınlatma, odak ve çerçeveleme için çıkan görüntüler değerlendirin. Yoğunlaştırdığını ise, XY sekmesi altında her pozisyon için odak sıfırlayın. 10 dakika bekleyin ve odak istikrarlı kadar bu adımı tekrarlayın.
   9. Tüm ayarları doğrulanmış ve test edildikten sonra, "Şimdi Çalıştır" butonuna tıklayarak otomatik deneme başlatmak.

Bölüm 4 - Görüntü İşleme ve İhracat

Data Export

1. Taşıma veya yaymak olayların canlı hücre görüntüleme sırasında elde edilen veri setleri sunumlar ve yayınlar (Ek Film 3) daha sonra kullanmak için sık kullanılan dosya türlerini içine NIS Elements yazılımı ihraç edilmelidir. NIS Elements film uygun ham. ND2 dosyasını açın ihracat ve istenen floresan kanalları görselleştirmek için "bölünmüş bileşeni" görünümü seçin. Oynatma uygun bir hızda dosya; saniyede 5 kare hızlı ulaşım görselleştirme için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır.
2. Film oynatma sırasında gerçek zamanlı saat temsil etmek için bir zaman damgası ekleyin. Resmin üzerine sağ tıklayın ve, ND-bilgiler kat. Dijital sayaç sol üst köşesinde görünür.
   1. Bilgileri görüntülemek için zaman damgası düzenleyin. Sağ tezgahın üzerine tıklayın ve Edit ND-bilgileri seçin. Sonraki açılan pencerede, Hü yansıtmak için metni düzenlemekönemlidir ng parametreleri. Netlik için düzenleme yazı tipi, renk ve boyut.
3. "Düzenle" menüsüne gidin ve "görünümü anlık oluşturma" ya da "x" tuşuna basın bulabilirsiniz. Bu komut "görünümü anlık" penceresi açılır. Seçin bir 8-bit, RGB, tüm filmden floresan kanalları içeren ihracata hazır dosyası oluşturmak için "Tüm çerçeveler için geçerlidir".
4. Çapraz platform uyumluluğu için bir. Avi dosyası olarak kaydedin. Kare başına 200 msn de oynatma hızını ayarlayın. NIS Elemanları tarafından oluşturulan. Avi dosyaları sonra daha fazla istediğiniz dosya türünü içine diğer dönüştürme yazılımı ile sıkıştırılmış olabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Anterograd Taşıma

PRV 348 ile ayrışmış SCG kültürlerin enfeksiyonlara Bu protokolün uygulama, GFP-US9 ve gM-mCherry membran füzyon proteinleri ifade eden bir rekombinant PRV gerginlik, virionlar anterograd taşıma (Şekil 3 ve Ek Film 4) ve görselleştirme kolaylaştırmıştır. Puncta taşıma kendi algılama viral parçacıkların sonuçları ve söz konusu görüntüleme koşulları bu füzyon proteinlerin Ortaklığın filtre geçiş sırasınd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu gözlem eylemi ile önemli değişiklik olmadan ortaya gibi canlı hücre görüntüleme amacı biyolojik süreçleri izlemektedir. Çevre kontrolü, görüntüleme hızı ve floresan aydınlatma: Bu amaç, üç değişken optimize ederek elde edilir. Bu arası bağımlı değişkenler uygun görüntüleme koşulları elde etmek için dengeli olmalıdır. Sunulan protokol temsili sonuçlar üretmek için özel koşullar kullanmaktadır. Biz kısaca sunulan özel yöntemler ayrıntılarına geçmeden önce çevresel k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom culture dish	MatTek Corporation; Ashland, MA	P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish	Ibidi USA LLC, Verona, WI	81156
Microscope body	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage	Prior Scientific; Rockland, MA	H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels	Prior Scientific	HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source	Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada	X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets	Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD camera	Andor Technology USA; South Windsor, CT	iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator	Live Cell Instruments; Seoul, South Korea	TC-L-10
Objective lens heater	Bioptecs; Butler, PA	150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software	Nikon Instruments Inc.; Melville, NY	NIS Elements