De células vivas de Alphaherpes Vírus Transporte anterógrada e Spread

Resumo

Imagem de infecções por vírus alphaherpes células vivas permite a análise dos eventos dinâmicos de transporte e dirigido propagação intercelular. Apresentamos aqui as metodologias que utilizam estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes para facilitar a visualização dos conjuntos virais durante a infecção de neurónios primários.

Resumo

Os avanços nas técnicas de microscopia de fluorescência de células vivas, bem como a construção de estirpes de vírus recombinantes que expressam proteínas de fusão fluorescentes permitiram a visualização em tempo real de transporte e de propagação da infecção pelo vírus da alphaherpes de neurónios. A utilidade de novas proteínas de fusão fluorescentes a membrana viral, tegumento, cãpsides e, em conjunto com a imagem de células vivas, identificados conjuntos de partículas virais submetidos transporte dentro axónios. Ferramentas similares têm sido empregados com sucesso para a análise de célula-célula espalhados de partículas virais para quantificar o número ea diversidade de virions transmitidos entre as células. É importante ressaltar que as técnicas de imagens de células vivas de transporte anterógrado e propagação produzir uma riqueza de informações, incluindo velocidades de partículas de transporte, distribuição de partículas e análises temporais de localização de proteínas. Ao lado de técnicas genéticas virais clássicos, estas metodologias têm proporcionado uma visão críticaem questões importantes mecanicistas. Neste artigo vamos descrever em detalhes os métodos de imagem que foram desenvolvidos para responder a perguntas básicas de transporte de vírus alphaherpes e se espalhar.

Introdução

A infecção do sistema nervoso periférico (SNP) por alphaherpes vírus tais como o vírus herpes simplex (HSV) -1, -2, e vírus da pseudo-raiva (PRV), envolve vários passos intrincados e altamente regulada durante o ciclo de vida viral. Transporte no interior dos neurônios PNS é fundamental durante os eventos de ambas infecção viral primária e posterior disseminação inter-host. Os mecanismos moleculares que modulam dois componentes do ciclo de vida viral, transporte dirigido de conjuntos virais longe de corpos celulares dentro dos axônios (transporte anterógrado) e subsequente transmissão de partículas virais em células suscetíveis (propagação anterógrada) são importantes para a compreensão herpesvírus patogênese.

O transporte e saída de partículas virais nos neurônios depende de montagem de um maduro ^1,2 virion infeccioso. Ensaios anteriormente fixos, incluindo imunofluorescência (IF) e microscopia eletrônica (ME), foram usados ​​para estudar o estado de montagem da partícula e protinterações ein associados ao transporte virion e propagação ^3-6. No entanto, a natureza dinâmica do transporte de partículas virais e artefatos experimentais introduzidas pela fixação química confundiu a interpretação de imagens fixas ^7,8. Recentemente, uma série de proteínas de fusão vírica fluorescentes têm sido descritos para o HSV e PRV, que tem impactos insignificantes sobre a função da proteína. Proteína Fluorescente Verde (GFP) e proteínas fluorescentes vermelhas (mCherry ou MRFP) fluoróforos são muitas vezes combinadas para permitir imagiologia de dois dos três componentes estruturais de um virião maduro: cápside, tegumento e glicoproteína ^9-11. Ao vivo imagens de células de transporte anterógrado usando vírus de dupla-rotulados visualiza o estado de montagem de partículas virais durante o transporte. Fluoróforo similares expressando estirpes virais são utilizados para visualizar o número e diversidade de genomas virais seguintes propagação ^12,13. As propriedades das proteínas fluorescentes (revisto em ^14,15) ser de grande impactoa capacidade de visualizar conjuntos virais ou celulares. As propriedades intrínsecas da proteína fluorescente, incluindo a auto-interações e estabilidade, devem ser considerados ao projetar e testar novas fusões de proteínas para a preservação da funcionalidade do tipo selvagem.

Em conjugação com proteínas de fusão fluorescentes, dois bem caracterizadas em sistemas de cultura de células in vitro são utilizados para imagiologia de células vivas de infecção pelo vírus do herpes: dissociado ¹⁶ e compartimentada ¹⁷ (Figura 1A), os gânglios do rato (SCG) neurónios cervicais superiores. Em ambos os sistemas, embrionário do SCG são dissecados, dissociadas de corpos de células individuais, e banhado por cultivo in vitro ^18. Neurónios SCG são parte do sistema nervoso autonômico e podem ser facilmente cultivadas e diferenciadas por factor de crescimento neuronal (NGF) para um estado maduro polarizada ex vivo. SCG neurônios dissociados formar uma extensa rede de axônios que permite que fou a visualização de partículas virais como se submetem anterógrada transporte ^6. Culturas SCG compartimentadas fornecer isolamento de fluidos do corpo celular neuronal (compartimento S) e terminais dos axônios distais (compartimento N) ^19. Um certo número de protocolos detalhados para a construção e a utilização de neurónios em compartimentos utilizando original é ^{de 20} ou ¹⁷ modificado Campenot câmaras foram publicados previamente. Isolamento fluídico permite a infecção seletiva de corpos celulares neuronais e detecção do vírus da progênie após o transporte de terminais axônio isoladas. Cultivar células epiteliais ao longo dos terminais antes da infecção proporciona células receptoras para a propagação de uma infecção viral.

Há muitos elementos essenciais importantes para toda experimentação imagens de células vivas, mas o mais relevante para os nossos protocolos são: aquisição automatizada de imagem, iluminação fluorescente, a velocidade de processamento de imagens e controle ambiental. Para todos os experimentos com imagens, usamosinvertido, automatizado, iluminação microscópio de epifluorescência (Figura 1B). O microscópio é construído em torno da Nikon Eclipse Ti base e emprega um número de computadores sistemas motorizados controlados para reconfigurar rapidamente o microscópio durante a aquisição de imagem automatizado. Para a iluminação de fluorescência, usamos um amplo espectro da lâmpada de arco de mercúrio que podem ser atenuados com filtros de densidade neutra ao longo do percurso de iluminação. Filtros de excitação limitar o espectro de iluminação fluorescente e, quando combinados com espelhos dicróicos de multi-pass e filtros de emissão de fluorescência visualizar compostos fluorescentes específicos. Os filtros de excitação e de emissão são montados em rodas, rápido filtro de comutação independentes que permitam a aquisição sequencial rápida de canais diferentes fluorescentes. A velocidade de aquisição de imagem é reforçada com uma câmera EM-CCD sensível e rápido, útil para a detecção de sinais de baixa intensidade e curta imagem leia vezes. O controle ambiental no microscope é conseguido com uma fase superior aquecida incubadora e um aquecedor de lente objectiva para manter as amostras a temperaturas elevadas, enquanto a ₂ atmosfera humidificada e enriquecida em CO é passada para dentro da incubadora. O microscópio é mantido em uma sala escura, com temperatura ambiente mantida próxima a 25 ° C e luz fora minimizado com cortinas blackout em todas as janelas. Os protocolos seguintes descrevem a utilização deste sistema para o transporte de forma anterógrada e ensaios de propagação.

Um certo número de alternativas existem para controlar as variáveis ​​de imagem de células vivas. O controlo das definições de microscopia pode ser efectuada manualmente ou através de sistemas automatizados dependentes software proprietário. Fluorescência de iluminação pode ser conseguida com halogéneo, as fontes de laser ou diodo emissor de luz. A velocidade de imagem é modificado a partir da velocidade de comutação do filtro e do tempo para visualizar o sinal com o sistema de detecção associado. Controlo ambiental pode ser alcançada com equipamento especializado na mifase croscope, cerco de todo ou parte do microscópio numa caixa aquecida e humidificada, ou por elevação da temperatura da sala onde a microscopia será executada. Cada uma dessas alternativas tem vantagens e desvantagens associadas ao custo e desempenho.

No protocolo subsequente, que detalhe a utilização de imagem de células vivas para estudar anterógrado rápido transporte e propagação anterógrada alphaherpes de vírus através da utilização de estirpes virais recombinantes. Imagens de células vivas em tempo real visualiza capsídeo, tegumento e / ou glicoproteína co-localização em estruturas dinâmicas submetidos transporte dentro dos axônios ^11. Imagem timelapse durante a noite de culturas neuronais compartimentadas visualiza saída virion axonal e infecção de células susceptíveis ^12. Os protocolos aqui apresentados foram otimizados para uso com nosso sistema de imagem particular, mas são apresentados em termos gerais relativas aos quatro elementos de imagens de células vivas. Na discussão queserá mais detalhadamente alguns dos otimização que é necessária para a experimentação bem sucedida.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Seção 1 - Condições de Controle Ambiental para microscopia de fluorescência de células ao vivo

1. 30 min antes de cada experiência de imagem conectar e começar o aquecimento do estágio de microscópio de topo incubadora.
   1. Ligue o microscópio, as fontes de luz transmitida e epifluorescência e controles de hardware automatizados. Abra o software de controle de microscópio, NIS Elements, para conectar-se ao microscópio e começar a arrefecer a câmera EM-CCD.
   2. Anexar Lens mais quente para objetivo apropriado (60X ou imersão em óleo 100X) Nota:. Selecione lente objetiva baseada no tipo de experimento. O 100X contraste de interferência diferencial (DIC) é o melhor para o rastreamento de conjuntos virion transporte anterógrados enquanto o objetivo fase de 60X é adequado para visualizar propagação anterógrada. Menor ampliação, os objetivos de imersão não-petrolíferos não necessitam de uma lente mais quentes como eles não fazem contato direto com a amostra.
   3. Anexar fase top incubadora para o palco motorizado de mi croscope. Garantir a inserção adequada que irá realizar a amostra está em vigor. Coloque a linha de ar humidificado a partir do controlo da incubadora para a porta de entrada na fase superior da incubadora.
   4. Ligue incubadora e lente controles mais quentes e ajustar as configurações de temperatura para condições previamente verificados específicas para o objetivo e amostra a ser trabalhada (ver discussão).
   5. Abra a válvula de controle sobre a 5% CO _2/95% tanque atmosférico para fornecer ar complementada CO ₂ para o estágio superior incubadora. O caudal deve ser entre 60 e 80 mL de gás por minuto. Taxas mais rápidas irá resultar em extensa desidratação da amostra, apesar de a câmara de umidificação.
2. Adicione o óleo de lente para lente objetiva e coloque imediatamente a cultura que vai ser trabalhada na fase de topo incubadora.
3. Permitir o equilíbrio da temperatura da cultura para um mínimo de 10 min. Uma hora é a preferida, especialmente durante a noite para imagiologia descrito na Seção 3.

ve_title "> Seção 2 - imagens em tempo real de Virion Transport Protocol Eventos Anterógrada

1. Seis a oito horas antes da imagiologia, infectar uma lamela mm de fundo do prato maduros, neurónios SCG dissociadas com 1 x 10 ⁶ unidades formadoras de placa do vírus de interesse 35 (Ver Quadro 1, por exemplo, vírus), utilizando o método descrito em Taylor et ai. 2012a ^11. Se testar mais de um vírus, off-set inoculações por 30-60 min para permitir a imagem de amostras seqüenciais em horários semelhantes após a infecção.
2. Insira prato em fase top incubadora por um período mínimo de 10 min antes de executar qualquer experimento. Enquanto a temperatura se equilibra, o plano focal está mudando e vai impactar negativamente os experimentos com imagens.
3. Usando a luz transmitida e da ocular do microscópio, encontrar um corpo celular neuronal que tem uma extensão axonal claramente isolado. Como alternativa, use a iluminação fluorescente apropriado para encontrar uma célula que expressa detecvalores da tabela de proteínas fluorescentes. É importante para limitar a exposição da amostra a iluminação fluorescente, neste passo e nos passos subsequentes, devido a dano celular induzido por luz e branqueamento de proteínas fluorescentes.
4. Atenuar iluminação de fluorescência para reduzir a intensidade da luz de excitação para a qual as células são expostas. Envolver luz atenuando densidade neutra (ND) filtros no caminho de luz de iluminação de fluorescência. Para filmes com duração superior a 1 min, de um mínimo de ND4 deve ser usado para evitar foto-branqueamento de proteínas fluorescentes e grande foto-dano dos axónios. Estruturas altamente fluorescentes geralmente pode ser visualizado com um ND8 filtro no lugar.
5. Usando o software do microscópio (Figura 2 e uma carta do filme 1A), exibir o percurso da luz para o EM-câmara CCD.
6. Determinar tempos e condições óptimas de imagem para cada canal fluorescente.
   1. Inicie uma janela de imagem ao vivo usando o botão "Play".
   2. Determinar as configurações de exposição da câmera ideal para cada proteína fluorescente. Não exceder 300 ms por canal como aberrações dinâmicas de virion estruturas em movimento rápido irá ocorrer. Utilize o ganho EM da câmara para um ajuste de 300 (fabricante sugeriu ganho máximo), para minimizar o tempo de exposição e aumentar a detecção de sinais escuros. Tempos de exposição correta deve produzir uma imagem com baixa intensidade de fundo e sinais específicos elevados.
7. Depois de definir posições e encontrar uma região bem definida de axónios, o software deve ser configurado para realizar a aquisição da imagem automatizado. Impedir que a janela de imagens ao vivo para impedir o branqueamento da amostra.
   1. No software NIS Elements, selecione o 6D - Definir / Executar aplicativo Experiência do "Aplicativos" no menu suspenso.
   2. Na janela de aquisição da ND, clique na guia Tempo que irá determinar a freqüência de aquisição de imagem. Definir o intervalo para "nenhum atraso" ea duração de 5 min. Thsoftware e, em seguida, adquirir quadros de imagem com a maior freqüência possível, com duração de 5 min.
   3. Selecione a aba "Lambda", que permite a seleção das configurações de hardware pré-definidos utilizados para aquisição de imagem fluorescente múltipla. Clique na primeira caixa e na queda subsequente menu para selecionar uma configuração de hardware apropriado. Repita o procedimento para todas as proteínas fluorescentes a ser trabalhada.
   4. Verifique se as guias para "Posições XY", "Z-série" e "Imagem Large" é de-selecionado.
   5. Acima das guias, selecione a opção "Save to File" para salvar automaticamente as imagens para o disco rígido durante a aquisição. Configurar o local eo nome do arquivo de saída do experimento. Tal como são realizados experimentos sequenciais, o software adiciona um número sequencial no final do nome do ficheiro designado.
   6. Uma vez que todas as abas foram selecionados. Iniciar o experimento, clicando no botão "Run-Now".
   7. Otimizar a taxa de aquisição de imagens através de configurações de exposição e imagtamanho e. Usando uma pequena região da área de imagem, capaz, muitas vezes, acelerar as taxas de aquisição de quadros. Definir a região de interesse utilizando a ferramenta da ROI NIS-Elements, seleccionando uma área entre 25% e 50% da área total da imagem. Alternativamente, os tempos de exposição mais curtos vai aumentar as taxas de aquisição de quadros, mas diminui a qualidade do sinal (ver discussão).

Seção 3 - Overnight Time-lapso de anterógrada Espalhe Eventos

1. Quatro horas antes da imagem, infectar uma cultura neuronal compartimentada construído em um 35 milímetros μ-Dish. Inocular os corpos celulares neuronais com 1 x 10 ⁶ unidades formadoras de placa do vírus de interesse (ver Tabela 1, por exemplo, vírus), utilizando o método descrito em Taylor et ai. 2012b ^12.
2. Delicadamente, coloque prato de cultura para o estágio superior incubadora. Assegurar a posição do objectivo é definido para o lado do prato. Lentamente traga o objetivo em foco, assegurandoção o objetivo não empurrar para dentro da amostra. Uma vez que o campo de foco tem sido identificado, o objectivo de mover lentamente para o centro do prato, perto da barreira interna demarking o lado interno do compartimento de axónios. Durante o movimento, assegurar a profundidade do foco é mantido e evitar que empurra para cima na amostra. Deflexão da superfície de plástico por objetivo danificar os axônios e plástico.
3. Adicionar cerca de 2 ml de água morna (~ 37 ° C), salino tamponado com fosfato ao prato de cultura fora do anel de teflon. Isto envolve a cultura neuronal com um anel de PBS para minimizar a desidratação da amostra e proporcionar o isolamento térmico.
4. Permitir que a temperatura atinja o equilíbrio durante um mínimo de 1 hora antes de se iniciar a aquisição de imagem automatizado (3.8). Passos 3,5 através de 3.7 pode ser configurado durante este tempo.
5. Restringir a intensidade da iluminação ao nível mais baixo possível, envolvendo todos os filtros de densidade neutra. Isso permitirá que a aquisição da imagem freqüente over longos períodos de tempo sem excessiva foto-dano. Reduzir a iluminação irá resultar em sinal baixo, exigindo exposições mais longas (ver discussão).
6. Use as configurações de exposição históricos ou anteriores experimental set-up gerar um prato paralelo de células epiteliais infectadas expressar as proteínas fluorescentes alvo para estabelecer as configurações de exposição como descrito na Seção 2.5.
7. Depois de definir a exposição para os canais necessários, é hora de configurar o software para aquisição de imagem automatizado. Impedir que a janela de imagem ao vivo para limitar amostra de branqueamento.
   1. Em software Elements (Figura 2 e filme suplementar 2), selecione a 6D - Definir / Executar aplicativo Experiência do "Aplicativos" no menu suspenso para abrir a janela de aquisição da ND.
   2. Na janela Acquisition ND, clique na guia Hora. Definir o intervalo para "5 min". Defina a duração de 20 horas. O campo lacetes será automaticamente calculado para o número de repetições do program irá executar.
   3. Selecione a aba "Lambda". Clique na primeira caixa e na queda subsequente menu selecione a configuração lambda apropriado para contraste de fase. Repita o procedimento para as posições posteriores, selecionando as configurações apropriadas para cada proteína fluorescente a ser trabalhada.
   4. Selecione a opção "Imagem Grande" guia, que determina os parâmetros de múltiplas imagens sejam combinadas em um único campo de visão maior. A área de bom tamanho é composto por 5 x 2 imagens usando um 7% de sobreposição de costura. Isto irá permitir que o número máximo de células por posição a ser visualizados sem afetar a frequência de aquisição de imagem. Além disso, desmarque a caixa de seleção "Shutter Fechar atividade durante o movimento Stage". Esta opção aumenta a velocidade de aquisição, por não fechar persianas entre imagens.
   5. Seleccione o separador "XY Posições", para identificar múltiplas posições que será sequencialmente fotografada em paralelo durante o decorrer do filme durante a noite. Seleccione posições que definem o centro de point para cada área de imagem grande. Seleccione 6-8 posições da imagem da amostra. A área boa imagem terão pequenos aglomerados de células em estreita aposição de axônios claramente definidos. As células não devem ser empilhados em cima uns dos outros e axónio agregação deve ser minimizada. O ponto de focagem é o núcleo da célula. Posicionar o objectivo de tal modo que um envelope nuclear é visto claramente definida, para a maioria das células.
   6. Verifique se o separador "Z-series" está desmarcada.
   7. Configurar o recurso de auto-save, como descrito acima na Seção 2.6.5.
   8. Testar a exposição e configurações de posição, clicando em "um laço do tempo". Avaliar as imagens resultantes para iluminação transmitida luz, foco e enquadramento. Se o foco mudou, reinicie o foco para cada posição na aba XY. Espere 10 minutos e repita essa etapa até que o foco é estável.
   9. Após todos os ajustes foram verificados e testados, iniciar o experimento automatizado, clicando no botão "Run Now".

Seção 4 - Processamento de Imagem e Exportação

Data Export

1. Conjuntos de dados obtidos durante a imagem ao vivo de células de eventos de transporte ou propagação devem ser exportados a partir do software NIS Elements em tipos de arquivo comumente usados ​​para posterior utilização em apresentações e publicações (Supplemental Filme 3). Para exportar filmes nd2 abrir o arquivo apropriado cru. No NIS Elements e selecione o ponto de vista "componente split" para visualizar os canais fluorescentes desejados. Reproduzir o arquivo em uma velocidade adequada; 5 quadros por segundo é um bom ponto de partida para a visualização de-transporte rápido.
2. Inclua um timestamp para representar um relógio em tempo real durante a reprodução do filme. Botão direito do mouse sobre a imagem e selecione, Adicionar ND-informação. Um contador digital irá aparecer no canto superior esquerdo.
   1. Edite o carimbo de tempo para exibir informações. Botão direito do mouse em cima do balcão e selecione Editar ND-informação. No subseqüente janela pop-up, edite o texto para refletir a imaginaçãong parâmetros que são importantes. Editar fonte, cor e tamanho para maior clareza.
3. Vá para o menu "Editar" e encontrar "Criar visão instantânea" ou pressione a tecla "x". Este comando abre a janela "visão instantânea". Selecione "aplicam-se a todos os frames" para gerar um 8-bit, RGB, arquivo de exportação-pronto contendo os canais fluorescentes de todo o filme.
4. Salvar como um arquivo. Avi para compatibilidade cross-platform. Defina a taxa de reprodução em 200 milissegundos por quadro. Os arquivos. Avi gerados pelo NIS Elements pode ser ainda mais comprimida com outro software de conversão para o tipo de arquivo desejado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Transporte anterógrada

A aplicação deste protocolo a infecções de culturas dissociadas SCG com PRV 348, uma estirpe de PRV recombinante expressando GFP-US9 e proteínas de fusão de GM-mCherry membrana, facilitou a visualização do transporte anterógrada de viriões (Figura 3 e 4 do filme suplementar). A incorporação destas proteínas de fusão resulta em partículas virais em transportar a sua detecção em pontos lacrimais e das condições de imagem...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O objetivo de imagens de células vivas é observar processos biológicos como eles ocorrem sem alteração significativa pelo ato de observação. Este objetivo é alcançado por meio da otimização de três variáveis: o controle ambiental, a velocidade de processamento de imagens e iluminação de fluorescência. Estas variáveis ​​inter-dependentes deve ser equilibrada para alcançar condições de imagem viáveis. Os protocolos apresentados utilizam condições específicas para produzir os resultados represen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom culture dish	MatTek Corporation; Ashland, MA	P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish	Ibidi USA LLC, Verona, WI	81156
Microscope body	Nikon Instruments Inc.	Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage	Prior Scientific; Rockland, MA	H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels	Prior Scientific	HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source	Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada	X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets	Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT	89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD camera	Andor Technology USA; South Windsor, CT	iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator	Live Cell Instruments; Seoul, South Korea	TC-L-10
Objective lens heater	Bioptecs; Butler, PA	150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software	Nikon Instruments Inc.; Melville, NY	NIS Elements