JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Изображений живых клеток инфекций alphaherpes вируса позволяет анализ динамики событий направленного транспорта и межклеточного распространения. Здесь мы представляем методики, которые используют рекомбинантные вирусные штаммы, экспрессирующие флуоресцентных белков слияния для облегчения визуализации сборки вирусной инфекции во время первичных нейронов.

Аннотация

Прогресс в живой клетке флуоресценции микроскопии, а также конструирование рекомбинантных вирусных штаммов, экспрессирующих флуоресцентные белки слияния позволили визуализации в реальном времени транспортировки и распространение вирусной инфекции alphaherpes нейронов. Полезность новых флуоресцентных слитых белков вирусной мембраны, оболочки, и капсид, в сочетании с изображений живых клеток, которые были определены сборки вирусной частицы проходят транспорта в пределах аксонов. Похожие инструменты были успешно использованы для анализа межклеточных распространения вирусных частиц для количественной оценки количества и разнообразия вирионов передается между клетками. Важно отметить, что методы изображений живых клеток антероградной транспорта и распространением производят огромное количество информации, включая перенос частиц скоростей, распределение частиц, и временной анализ локализации белков. Наряду с классическими методами вирусного генетического, эти методологии обеспечили критические идеив важные механистической вопросы. В этой статье мы подробно описать методы визуализации, которые были разработаны, чтобы ответить на основные вопросы alphaherpes транспорта вирусов и распространения.

Введение

Инфекция периферической нервной системы (ПНС) на alphaherpes вирусов, таких как вирус простого герпеса (ВПГ) -1, -2, и вирус псевдобешенства (PRV) включает в себя несколько сложных и строго регулируется шаги в течение жизненного цикла вируса. Транспортировка в нейроны ПНС имеет решающее значение во время событий первичной вирусной инфекции и последующего между хозяином распространения. Молекулярных механизмов, которые регулируют два компонента жизненного цикла вируса, направленного транспорта вирусной сборки от клеточных тел в аксоны (антероградной транспорта) и последующей передачи вирионов в чувствительные клетки (антероградной распространению) имеют важное значение для понимания патогенеза вируса герпеса.

Транспорта и выход вирусных частиц в нейронах зависит от сборки зрелых инфекционных 1,2 вириона. Ранее фиксированная анализов, в том числе иммунофлюоресценции (ИФ) и электронной микроскопии (ЭМ), были использованы для изучения состояния частиц сборки и протЭйн-взаимодействий, связанных с транспортом и распространении вириона 3-6. Однако динамичный характер транспортировки вирионов и экспериментальные артефакты введен химической фиксации посрамлены интерпретации неподвижных изображений в 7,8. В последнее время количество вирусных-флуоресцентных слитых белков были описаны для HSV и PRV, которые имеют незначительное воздействие на функцию белка. Зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (mCherry или MRFP) флуорофоров часто в паре, чтобы позволить отображение двух из трех структурных компонентов зрелых вирионов: капсид, оболочки и гликопротеин 9-11. Живых изображений сотовый антероградной транспорта с использованием двойного меченых вирусов визуализирует состояние сборки вирусных частиц во время транспортировки. Похожие флуорофором выразив вирусные штаммы используются для визуализации число и разнообразие вирусных геномов после распространения 12,13. Свойств флуоресцентных белков (см. обзор в 14,15) в значительной степени влияютвозможность визуализации вирусными или клеточными сборок. Внутренние свойства флуоресцентного белка, в том числе самостоятельно взаимодействий и стабильности, следует учитывать при разработке и тестировании нового белка слияния для сохранения дикого типа функциональности.

В сочетании с флуоресцентным белком слияния, два хорошо известных в системах пробирке культуру клеток используют для изображений живых клеток герпетической инфекции: диссоциированными 16 и разобщенным 17 (рис. 1А) крысы верхний шейный ганглий (SCG) нейронов. В обеих системах, эмбриональные SCG являются рассеченные, диссоциирован на одну клетку тела, и высевают для культивирования в пробирке 18. SCG нейронов являются частью вегетативной нервной системы и могут быть легко культивировать и дифференцированы по нейронной фактора роста (NGF) в зрелую поляризованного естественных условиях бывшего государства. Диссоциированных нейронов SCG образуют разветвленную сеть аксонов, который позволяет Fили визуализации вирусные частицы, поскольку они подвергаются антероградной транспорта 6. Разобщенным SCG культур обеспечивают гидравлической изоляции нейронов клетки тела (S ящиком) и дистальных концах аксона (N ящиком) 19. Ряд подробных протоколов для построения и использования обособленных нейронов с использованием оригинальных 20 или модифицированный Campenot камер 17 были опубликованы ранее. Гидравлической изоляции обеспечивает селективное инфекции тела нейронов и обнаружение вирионы потомства после транспортировки к изолированным концах аксона. Покрытие эпителиальных клеток над Термини до инфицирования обеспечивает клетки-реципиента для распространения вирусной инфекции.

Есть много важных элементов, важных для всех живых изображений экспериментов клетки, но наиболее актуальными для нашей протоколы: автоматизированный сбор изображений, флуоресцентное освещение, скорость визуализации и экологического контроля. Для всех изображений экспериментов, мы используемперевернутый, автоматизированные, эпифлуоресцентной микроскопом освещения (рис. 1В). Микроскоп построена вокруг Nikon Затмение Ti базы и использует ряд контролируемых компьютером моторизованных систем быстро перенастроить микроскопом во время автоматизированного захвата изображений. Для флуоресцентной подсветкой, мы используем широкий спектр ртутных ламп, которые могут быть ослаблены с фильтры нейтральной плотности вдоль освещения пути. Возбуждение фильтры ограничивают спектр флуоресцентного освещения и когда в паре с многоходовой дихроичных зеркал и флуоресцентных фильтров выбросов визуализировать конкретные флуоресцентные соединения. Возбуждения и излучения фильтры установлены в независимое, быстрое переключение фильтра колеса для быстрого последовательного приобретения различных флуоресцентных каналов. Скорость получения изображения еще более усиливается с чувствительной и быстрой EM-CCD камеры, полезны для обнаружения сигналов низкой интенсивности и малой изображение время чтения. Экологический контроль на MicroscОПЕ достигается со сценой верхней нагревается инкубатора и объективной линзы нагреватель для поддержания образцов при повышенных температурах при влажной и CO 2 атмосфере, обогащенной передается в инкубаторе. Микроскоп хранится в затемненной комнате с температурой окружающей среды поддерживается около 25 ° C и внешнего освещения минимизированы плотные шторы на всех окнах. Следующие протоколы описывают использование этой системы для антероградной транспорта и распространение анализов.

Число альтернатив существуют для контроля за переменными изображений живых клеток. Контролем микроскопа настройки может быть выполнена вручную или с помощью автоматических систем зависит от собственного программного обеспечения. Флуоресценция освещения может быть достигнута галогеном, светодиод или лазерных источников. Скорость визуализации модифицируют скорость переключения фильтра и время вывода сигнала с парными системы обнаружения. Экологический контроль может быть достигнут с специализированное оборудование на Мимикроскопе этапе, закрытый со всех или части микроскопа в подогретый и увлажненный ящика, или путем повышения температуры в помещении, где микроскопии будет выполнена. Каждый из этих вариантов имеет свои преимущества и недостатки, связанные с затратами и производительностью.

В последующем протоколе, мы подробно использование изображений живых клеток для изучения быстрого антероградной транспорта и антероградной alphaherpes распространение вирусов с использованием рекомбинантных вирусных штаммов. В режиме реального времени изображений живых клеток визуализирует капсида, оболочки, и / или гликопротеина совместной локализации на динамических структурах проходят аксоны транспорта в пределах 11. Ночевка интервальная съемка изображений из обособленных нейронов культур визуализирует аксональное выхода вирионов и заражение восприимчивых клетках 12. Протоколы, представленные здесь, были оптимизированы для использования с нашей конкретной системы визуализации, но представлены в широком смысле по отношению к четырем элементам изображений живых клеток. В ходе обсуждения мыбудет более подробно некоторые оптимизации, которые необходимы для успешного экспериментирования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Раздел 1 - Условия окружающей среды управления для живых клеток флуоресцентной микроскопии

  1. За 30 мин до любого изображения эксперимента подключить и начать потепление столике микроскопа верхней инкубатора.
    1. Включите микроскоп проходящего и epifluorescent источников света, и автоматизированное управление оборудованием. Открытое программное обеспечение управления микроскопом, NIS Elements, для подключения к микроскопу и начинают охлаждение EM-CCD камерой.
    2. Прикрепите объектив теплее соответствующих целей (либо 60X или 100X иммерсионное масло). Примечание: Выбор объектива основана на эксперименте типа. 100X дифференциального интерференционного контраста (DIC) является лучшим для отслеживания транспортировки антероградной сборки вирионов в то время как цель 60X фаза подходит для визуализации антероградной распространения. Меньшем увеличении, ненефтяной целей погружения не потребуется объектив теплее, поскольку они не прямой контакт с образцом.
    3. Прикрепите верхнюю ступень инкубатора на моторизованных этапе миль микроскопе. Обеспечить надлежащее вставку, который будет содержать образец находится в месте. Прикрепить увлажненный воздух из линии управления инкубатора на входной порт на сцене верхней инкубатора.
    4. Включите инкубатор и объектива теплее управления и отрегулируйте температуру настройки ранее проверены условия, характерные для объективного и изображаемого образца (см. обсуждение).
    5. Откройте клапан на 5% CO 2/95% атмосферных бак обеспечить CO 2 дополнен воздуха на сцене верхней инкубатора. Скорость потока должна быть в пределах от 60 до 80 мл газа в минуту. Ускорение темпов приведет к обширным обезвоживание образца, несмотря на увлажнение камеры.
  2. Добавить линзы нефтепродуктов на объектив и сразу же поместить культуру, которая будет изображена в стадию Топ инкубатора.
  3. Разрешить уравновешивания температуры в культуре в течение как минимум 10 мин. Один час является предпочтительным, особенно на ночь визуализации описаны в разделе 3.
ve_title "> Раздел 2 - в режиме реального времени изображений Антероградный транспортного протокола Вирион События

  1. Шесть-восемь часов до обработки изображений, заражают 35 мм покровным дном тарелки зрелого, диссоциированных нейронов SCG 1 × 10 6 бляшкообразующих единиц вируса интереса (см. Таблицу 1, например, вирусов) по методу, описанному в Тейлор и др. др.. 2012a 11. Если тестирование более одного вируса, смещенной прививки на 30-60 мин, чтобы обеспечить визуализацию последовательных образцах при аналогичный после инфекции раза.
  2. Вставьте блюдо в стадию Топ инкубаторе в течение как минимум 10 минут перед запуском любой эксперимент. В то время как температура в равновесие, фокальной плоскости сдвига и окажет негативное воздействие на любые изображения экспериментов.
  3. Использование проходящем свете и окуляр микроскопа, найти клетку тела нейронов, которая имеет четко изолированы аксональное расширение. Вместо этого можно использовать соответствующие флуоресценции освещения найти клетки, экспрессирующие обнаруженияТаблица количества флуоресцентных белков. Важно, чтобы ограничить воздействие на образец флуоресцентного освещения, на этом этапе и последующих шагах, из-за света индуцированной повреждением клеток и отбеливания флуоресцентные белки.
  4. Ослабление флуоресценции освещения для снижения интенсивности возбуждающего света, к которому клетки подвергаются. Engage ослабления света нейтральной плотности (ND) фильтры в пути света флуоресценции освещения. Для фильмов продолжительностью более 1 мин, минимум ND4 должна быть использована для предотвращения фото-отбеливание флуоресцентных белков и обширная фото-повреждение аксонов. Высоко флуоресцентные структуры как правило, может быть визуализированы с ND8 фильтр на место.
  5. Использование программного обеспечения микроскопа (рис. 2 и дополнительные Фильм 1А), переключение света путь к EM-CCD камерой.
  6. Определить оптимальные сроки обработки изображений и условия для каждого флуоресцентного канала.
    1. Инициировать окно реального изображения, используя кнопку "Играть".
    2. Определить оптимальные параметры экспозиции камеры для каждого флуоресцентного белка. Не превышать 300 мс на канал в качестве двигательного аберраций быстро движущихся структур вириона произойдет. Использование усиления ЭМ камеру к установке 300 (рекомендованная производителем максимальное усиление), для минимизации воздействия времени и улучшения обнаружения тусклых сигналов. Правильное время экспонирования должно получить изображение с низкой интенсивностью фон и высокие специфические сигналы.
  7. После установки экспозиции и найти хорошо определенной области аксона, программное обеспечение должно быть сконфигурированы для выполнения автоматизированного захвата изображений. Остановить окна живых изображений, чтобы предотвратить образца отбеливания.
    1. В программное обеспечение NIS Elements, выберите 6D - определение / Выполнить эксперимент приложения из "Приложения" выпадающего меню.
    2. В окне приобретения Н.Д., перейдите на вкладку Время которое определит частоту получения изображений. Установить интервал "Без задержки" и продолжительностью до 5 мин. Thэлектронной обеспечение будет приобрести изображение фиксируется максимальной частоты для продолжительностью 5 мин.
    3. Выбор "Lambda" на вкладке, который дает возможность выбора заданной аппаратной конфигурации, используемые для нескольких флуоресцентных захвата изображений. Нажмите на первом боксе и в последующем выпадающее меню, чтобы выбрать подходящую конфигурацию оборудования. Повторите для всех флуоресцентных белков для включения в образ.
    4. Убедитесь, вкладки для "Позиции XY", "Z-серии» и «Большие изображения" не выбраны.
    5. Над вкладками, выберите флажок "Сохранить в файл", чтобы автоматически сохранять изображения на жесткий диск во время сбора. Настройте расположение и имя файла выходного файла эксперимента. В последовательном Эксперименты выполнены, программное обеспечение будет добавить порядковый номер в конце назначенного файла.
    6. После того как все вкладки были выбраны. Начать эксперимент, нажав кнопку "Run-сейчас".
    7. Оптимизации скорости получения изображений через настройки экспозиции и мнимойРазмер E. С помощью небольшой области изображения-области будет в состоянии позволить сократить время частота кадров приобретения. Определить области интереса помощи функции ROI в NIS-Elements, выбрав район между 25% и 50% от общей площади изображения. Кроме того, сокращение времени экспозиции увеличится частота кадров приобретения, но снижает качество сигнала (см. обсуждение).

Раздел 3 - Ночь Покадровый Визуализация антероградной События Spread

  1. Четыре часа до изображений, заразить разобщенным нейронов культуры построена на 35 мм μ-Блюдо. Инокулируйте тела нейронов с 1 × 10 6 бляшкообразующих единиц вируса интереса (см. Таблицу 1, например, вирусов) по методу, описанному в Taylor и соавт. 2012b 12.
  2. Аккуратно культуры блюдо в стадию Топ инкубатора. Убедитесь, что положение цели установлен на стороне тарелки. Медленно довести цель в фокус, обеспечеING цель не толкает вверх в образце. После того как фокусировка поле было определено, медленно перемещать цель в центр чашки, около внутреннего барьер демаркации внутренней стороне аксон отсека. Во время движения, обеспечения глубины фокуса поддерживается и не подталкивать вверх в образце. Прогиб пластиковой поверхности объективной приведет к повреждению аксонов и пластика.
  3. Добавить приблизительно 2 мл теплой (~ 37 ° C), забуференный фосфатом физиологический раствор в чашку с культурой снаружи кольца тефлона. Это окружает нейронов культуры с кольцом PBS, чтобы минимизировать образец обезвоживание и обеспечивают теплоизоляцию.
  4. Разрешить температуры для уравновешивания в течение минимум 1 час до начала автоматизированного захвата изображений (3.8). Шаги 3.5 через 3,7 может быть настроен в это время.
  5. Ограничить интенсивность освещения до минимально возможного уровня, привлекая все фильтры нейтральной плотности. Это позволит частые захвата изображений ОвеR длительного периода времени без чрезмерного фото-повреждения. Сокращение освещения приведет к низким отношением сигнал, требующий более длительных экспозиций (см. обсуждение).
  6. Использовать исторические настройками экспозиции или до экспериментальной установки генерировать параллельные блюдо зараженных эпителиальных клеток, экспрессирующих целевые флуоресцентные белки установить параметры экспозиции, как описано в разделе 2.5.
  7. После установки экспозиций для необходимых каналов, настало время для настройки программного обеспечения для автоматизированного захвата изображений. Остановить окна живых изображений ограничить образца отбеливания.
    1. В программных элементов (рис. 2 и дополнительные фильм 2), выберите 6D - определение / Выполнить эксперимент приложения из "Приложения" выпадающего меню, чтобы открыть окно ND Приобретения.
    2. В окне Приобретение Н.Д., перейдите на вкладку Время. Установить интервал "5 мин". Установить срок до 20 часов. Поле петель будут автоматически рассчитаны на количество повторений Prograм будет выполнять.
    3. Выберите "Лямбда" на вкладке. Нажмите на первом боксе и в последующем выпадающем меню выберите соответствующую конфигурацию лямбда для фазового контраста. Повторите эти действия для последующей позиции, выбрав соответствующие конфигурации для каждого флуоресцентного белка для включения в образ.
    4. Выберите "Большие изображения" на вкладке, которая определяет параметры нескольких изображений должны быть объединены в один большой поля зрения. Хорошего размера области состоит из 5 х 2 изображения с помощью 7% перекрытием строчкой. Это позволит обеспечить максимальное число клеток в положение для включения в образ, не влияя на частоту получения изображений. Кроме того, снимите флажок "Закрыть активным затвором во время Сценическое движение». Эта опция повышает скорость приобретения не закрывая ставни между изображениями.
    5. Выбор "XY позиции" вкладку для идентификации нескольких позициях, которые будут последовательно отображается в параллельном ходе ночной фильма. Выбор позиций, которые определяют центр РоINT для каждой большой площади изображения. Выберите 6-8 положение изображения в образце. Хороший район изображение будет иметь небольшие скопления клеток в тесном прикладывание к четко определенной аксонов. Клетки не должны быть сложены друг на друга и аксон комплектации должны быть минимизированы. Точки фокусировки является ядро ​​клетки. Установите цель таким образом, что четко определены ядерной оболочки видно для большинства клеток.
    6. Убедитесь, что "Z-серии" на вкладке снят.
    7. Настройте автоматическое сохранение функции, как описано выше в разделе 2.6.5.
    8. Проверьте экспозицию и положение настройки, нажав "1 петле времени". Оцените полученные изображения для нижней подсветкой свет, фокус, и кадрирования. Если фокус сместился, сбросить фокус для каждой позиции на вкладке XY. Подождите 10 минут и повторите этот шаг, пока фокус не будет стабильным.
    9. После выполнения всех настроек были проверены и испытаны, инициировать автоматизированного эксперимента, нажав кнопку "Запустить сейчас".

Раздел 4 - Обработка изображений и экспорт

Экспорт данных

  1. Наборы данных, полученных в ходе живых клеток изображений транспорта или распространение события должны быть экспортированы из программных элементов в NIS часто используемые типы файлов для последующего использования в презентациях и публикациях (Справочная Фильм 3). Чтобы экспортировать фильмы открыть соответствующий сырой. Nd2 файла в элементах NIS и выберите "Split-компонент" целью визуализировать желаемое флуоресцентных каналов. Воспроизведение файлов с подходящей скоростью; 5 кадров в секунду является хорошей отправной точкой для визуализации быстрого транспорта.
  2. Содержат временную метку, чтобы представить часы реального времени во время воспроизведения видеозаписи. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выбрать, добавить ND-информации. Цифровой счетчик появится в верхнем левом углу.
    1. Редактировать метки времени для отображения информации. Щелкните правой кнопкой мыши на прилавке и выберите Редактировать ND-информации. В последующие всплывающем окне, редактировать текст, отражающий томографаминг параметров, которые важны. Изменить шрифт, цвет и размер для ясности.
  3. Перейти в меню "Правка" и найти "Создать вид снимок" или нажмите клавишу "X" ключ. Эта команда открывает »взгляд снимок" окна. Выбор "применяется ко всем кадрам", чтобы генерировать 8-битных, RGB, экспорт готовый файл, содержащий флуоресцентный каналов из всего фильма.
  4. Сохранить как. AVI файлов для кросс-платформенной совместимости. Установка скорости воспроизведения при 200 мс на кадр. . AVI файлы, порожденные элементами NIS может быть дополнительно сжимается с другим программным обеспечением преобразования в нужный тип файла.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Антероградный транспорта

Применения настоящего Протокола к инфекциям диссоциированных культурах с SCG PRV 348, рекомбинантный штамм PRV выражения GFP-US9 и GM-mCherry белки слияния мембран, способствовал визуализации антероградной транспорта вирионов (рис. 3 и 4 Справоч?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Цель изображений живых клеток наблюдает биологические процессы, как они происходят без существенного изменения актом наблюдения. Эта цель достигается за счет оптимизации трех переменных: экологический контроль, скорость обработки изображений, и флуоресцентной подсветкой. Эти взаим?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

LWE РК и поддерживаются американским Национальным институтом здоровья гранты NS033506 R37-16 и R01 NS060699-03. MPT при поддержке Американского онкологического общества последующей исследовательской стипендии (PF-10-057-01-MPC). Советы и знания д-р Мэтью Лиман и доктор Орен Kobiler сыграли важную роль в проектировании конфигурации микроскопа и методов визуализации живой клетке. Мы также выражаем благодарность Нилу Барлоу и Брайан Т. Каин из Nikon Instruments за техническую помощь в приобретении, установке и производительности микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass bottom culture dishMatTek Corporation; Ashland, MAP35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish Ibidi USA LLC, Verona, WI81156
Microscope body Nikon Instruments Inc.Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stagePrior Scientific; Rockland, MAH117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheelsPrior ScientificHF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario CanadaX-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter setsChroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD cameraAndor Technology USA; South Windsor, CTiXon3 897
Chamlide stage top environmental incubatorLive Cell Instruments; Seoul, South KoreaTC-L-10
Objective lens heaterBioptecs; Butler, PA150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis softwareNikon Instruments Inc.; Melville, NYNIS Elements

Ссылки

  1. Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
  2. Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
  3. Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
  4. Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
  5. Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
  6. Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
  7. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  8. Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
  9. Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
  10. Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
  11. Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
  12. Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
  13. Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  16. Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
  17. Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
  18. Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988(2009).
  19. Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
  20. Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
  21. Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
  22. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466(2001).
  23. Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
  24. Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
  25. Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
  26. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

78epifluorescent

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены