Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

Resumen

Se introduce un biosensor óptico libre de marca para la detección de bacterias rápidos. El biosensor se basa en una Si poroso nanoestructurado, que está diseñado para capturar directamente las células de las bacterias diana sobre su superficie. Utilizamos anticuerpos monoclonales, inmovilizados sobre el transductor porosa, como las sondas de captura. Nuestros estudios demuestran la aplicabilidad de estos biosensores para la detección de concentraciones bacterianas bajas dentro de minutos sin procesamiento de la muestra antes (tales como la lisis celular).

Resumen

Un biosensor óptico libre de etiquetas basado en un nanoestructurado Si poroso está diseñado para la captura rápida y la detección de bacterias de Escherichia coli K12, como un modelo de microorganismo. El biosensor se basa en la unión directa de las células de las bacterias diana sobre su superficie, mientras que no se requiere ningún tratamiento previo (por ejemplo, mediante la lisis celular) de la muestra estudiada. Una película delgada de Si mesoporoso se utiliza como el elemento transductor óptico del biosensor. Bajo iluminación de luz blanca, la capa porosa muestra patrones de franjas de Fabry-Perot bien resueltas en su espectro de reflectividad. La aplicación de una transformada rápida de Fourier (FFT) a los resultados de datos de reflectividad en un solo pico. Los cambios en la intensidad del pico de FFT son monitoreados. Por lo tanto, bacterias diana capturan sobre la superficie del biosensor, a través de interacciones anticuerpo-antígeno, induce cambios mensurables en la intensidad de los picos de FFT, lo que permite una observación "tiempo real" de unión bacterias. NT "> La película mesoporosa de Si, fabricado por un proceso de anodización electroquímica, se conjuga con anticuerpos monoclonales, específicos para las bacterias diana. La inmovilización, actividad inmunológica y especificidad de los anticuerpos son confirmados por experimentos de marcaje fluorescente. Una vez que el biosensor está expuesto a la bacterias diana, las células son capturados directamente sobre la superficie porosa de Si-anticuerpo modificado. Estos eventos de captura específicas resultan en cambios de intensidad en el espectro de interferencia óptica de película delgada del biosensor. Se demuestra que estos biosensores pueden detectar concentraciones de bacterias relativamente bajas (detección límite de 10 ⁴ células / ml) en menos de una hora.

Introducción

Temprana y precisa identificación de bacterias patógenas es extremadamente importante para la alimentación y la seguridad del agua, monitoreo ambiental, y el punto de atención de diagnóstico ^1. Como las técnicas tradicionales de microbiología son lentos, laboriosos, y carecen de la capacidad para detectar microorganismos en "tiempo real" o fuera del entorno de laboratorio, los biosensores están evolucionando para responder a estos desafíos ^2-5.

En los últimos años, Si poroso (PSI) se ha convertido en una plataforma prometedora para el diseño de sensores y biosensores ^6-20. Durante la última década numerosos estudios sobre los sensores y biosensores ópticos basados ​​en la ISP fueron publicados ^21,22. La capa PSi nanoestructurado se fabrica típicamente por grabado electroquímico anódica a partir de un solo cristal de la oblea de Si. Los nanomateriales PSi resultantes exhiben muchas características ventajosas, como la gran superficie y volumen libre, tamaños de poro que se pueden controlar y opti sintonizablepropiedades cal ^10,16. Las propiedades ópticas de la capa PSi, como fotoluminiscencia ^8,11 y la luz blanca a base de reflectancia interferometría ^7,19, están fuertemente influenciadas por las condiciones ambientales. Captura de los huéspedes analitos moléculas / objetivo dentro de los resultados capa porosa en un cambio en el índice de refracción promedio de la película, observado como una modulación en el espectro de fotoluminiscencia o como un cambio de longitud de onda en el espectro de reflectividad ^10.

Aunque la gran innovación en tecnología de biosensor óptico PSi, sólo hay pocos informes sobre plataformas basadas en psi para la detección de bacterias ^{6,8,20,23-29.} Además, la mayoría de estos estudios de prueba de concepto han demostrado "indirecta" de detección de bacterias. Por lo tanto, se requiere la lisis generalmente antes de las células para extraer los fragmentos de proteína / ADN dirigidos, característicos de las bacterias estudiadas ^29. Nuestro enfoque es capturar directamente las bacterias dianacélulas sobre el biosensor psi. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales, que son específicos para las bacterias diana, se inmovilizan sobre la superficie porosa. La unión de células de las bacterias, a través de interacciones anticuerpo-antígeno, sobre la superficie del biosensor inducir cambios en la amplitud (intensidad) de la espectro de reflectividad ^24-26.

En este trabajo, nos informe sobre la construcción de un biosensor basado en PSi óptica y demostrar su aplicación como una plataforma de biosensores sin etiqueta para la detección de Escherichia coli (E. coli) K12 (utilizado como modelo de microorganismos). El monitoreado señal óptica es la luz reflejada desde el nanoestructura PSi debido a Fabry-Perot de interferencia de película delgada (Figura 1A). Los cambios en la luz de amplitud / intensidad se correlacionan a la inmovilización específica de las células de las bacterias diana sobre la superficie del biosensor, lo que permite la rápida detección y cuantificación de las bacterias.

Protocolo

1. Preparación de oxidado poroso de SiO ₂

1. Obleas de Si Etch (de un solo lado pulido en el <100> cara y fuertemente dopado, de tipo p, 0,0008 Ω · cm) en una solución de HF acuoso y etanol absoluto durante 30 seg 03:01 (v / v) a una corriente constante densidad de 385 mA / cm ^2. Tenga en cuenta que la IC es un líquido altamente corrosivo y debe manejarse con sumo cuidado.
2. Enjuague la superficie del Si (psi) película porosa resultante con etanol absoluto varias veces; secar las películas bajo un gas nitrógeno seco.
3. Oxidar las muestras PSi recién grabados-en un horno tubular a 800 º C durante 1 hora en el aire ambiente (colocar la muestra en el horno a temperatura ambiente, caliente el horno a 800 ° C, deje en el horno durante 1 hora, apague la horno y retirar las muestras del horno sólo a temperatura ambiente).

2. Biofuncionalización de PSIO ₂ Andamios

1. Incubar una PSi oxidado (PSiO ₂₎ de la muestra durante 1 hora en mercaptopropil (95% (MPTS) solución de trimetoxisilano-3) (108 mM en tolueno).
2. Enjuague la muestra tratada con silano PSIO ₂ con tolueno, metanol y acetona; seco bajo un gas nitrógeno seco.
3. Incubar la muestra modificada con silano PSIO ₂ durante 30 min en 1 ml de solución de biotina 100 mM de PEO-yodoacetilo.
4. Enjuague la muestra tratada con biotina PSIO ₂ con 0,1 M de tampón fosfato salino (PBS) varias veces.
5. Incubar la muestra modificada biotina-PSIO ₂ durante 30 min en 1 ml de 100 / g solución ml de estreptavidina (SA).
6. Enjuague el PSIO ₂ muestra tratada con SA con solución 0,1 M PBS varias veces.
7. Incubar la modificado-SA PSIO ₂ muestra resultante durante 30 min en 1 ml de 100 mg / ml de E. biotinilado anticuerpo monoclonal coli (Inmunoglobulina G, IgG) o solución con 100 g / ml de IgG biotinilado-conejo (como modelo para un anticuerpo monoclonal).

3. Marcaje fluorescente y microscopía de fluorescencia

1. Incubar las superficies modificadas-IgG con 15 g / ml de fluoresceína (FITC) marcado contra IgG de conejo durante 40 minutos y con 15 g / ml de fluoresceína (FITC) etiquetados de IgG anti-ratón como control.
2. Enjuague las muestras modificadas con solución 0,1 M PBS varias veces.
3. Examine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia.

4. Cultura de las bacterias

1. Cultivar E. bacterias de E. coli K12 en un tubo de 10 ml con 5 ml de medio Luria Bertani (LB) (composición del medio en 1 L de agua desionizada: 5 g de NaCl, 5 g de extracto de levadura, y 10 g de triptona). Se incuban las bacterias agitación durante la noche a 37 ° C.
2. Monitorear la concentración de bacterias mediante la lectura de la densidad óptica (DO) a una longitud de onda de 600 nm. Después de un crecimiento durante la noche en medio LB, leer la OD ₆₀₀ utilizando un espectrofotómetro para determinar la concentración bacteriana. El número de células es gravectly proporcional a las OD ₆₀₀ mediciones (1 OD ₆₀₀ = 10 ⁸ células / ml).

5. Las bacterias de detección

1. Coloque el PSIO modificado-IgG ₂ y ordenada PSIO ₂ (como control) muestras en una celda de flujo de plexiglás a medida. Fijar la celda de flujo para asegurar que la reflectividad de la muestra se mide en el mismo lugar durante todas las mediciones.
2. Incubar las muestras con E. coli K12 suspensión (10 ⁴ células / ml) durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, retirar la suspensión de bacterias mediante el lavado de la célula con 0,85% w / v de solución salina durante 30 min.
3. Monitorear los cambios en los datos de reflectividad de todo el experimento. Todas las mediciones ópticas necesitan ser llevado a cabo en un medio acuoso circundante. Los espectros deben ser recogida utilizando un espectrómetro de CCD y se analizó mediante la aplicación de transformada rápida de Fourier (FFT), como se describió previamente ^25,26.
4. Confirmar la presencia de las bacterias en lasuperficie del biosensor, mediante la observación de las muestras bajo un microscopio de luz en posición vertical inmediatamente después del experimento biosensores.

Resultados

PSi oxidado (PSIO ₂₎ las películas se prepararon como se describe en la sección de texto del protocolo. Figura 1B muestra una alta resolución de micrografía electrónica de barrido de la película PSi resultante después de la oxidación térmica. La capa PSIO ₂ se caracteriza por poros cilíndricos bien definidas con un diámetro en el intervalo de 30-80 nm.

El anticuerpo monoclonal (IgG) se injertan moléculas sobre las superficies PSIO ₂

Discusión

Un inmunosensor óptica-etiqueta libre, basado en un PSIO ₂ nanoestructura (una película delgada de Fabry-Perot) se fabrica, y su aplicabilidad potencial como un biosensor para la detección de bacterias se confirma.

Modificaciones y solución de problemas

Una de las principales preocupaciones cuando se diseña un inmunosensor es la susceptibilidad de los anticuerpos a someterse a cambios de conformación no deseados durante la deposición y el patrón s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	Siltronix Corp.		Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)	Merck	101513
Ethanol absolute	Merck	818760
PBS buffer solution (pH 7.4)			prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v			prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)	Sigma Aldrich Chemicals	175617
PEO-iodoacetyl biotin	Sigma Aldrich Chemicals	B2059
Streptavidin (SA)	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	115-095-003
Biotinylated E. coli antibody	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	1007
E. coli (K-12)			was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion