Détection optique de<em&gt; E. coli</em&gt; Bactérie par mésoporeux Silicon biocapteurs

Résumé

Un biocapteur optique sans étiquette pour la détection de bactéries rapides est introduit. Le biocapteur est basé sur un silicium poreux nanostructuré, qui est conçu pour capter directement les cellules des bactéries cibles sur sa surface. Nous utilisons des anticorps monoclonaux, immobilisés sur le transducteur poreux, comme les sondes de capture. Nos études démontrent l'applicabilité de ces biocapteurs pour la détection de concentrations bactériennes faibles en quelques minutes sans traitement préalable de l'échantillon (telle que la lyse cellulaire).

Résumé

Un biocapteur optique sans étiquette basée sur une nanostructure poreuse de Si est conçu pour la saisie rapide et la détection de bactéries Escherichia coli K12, comme un micro-organisme du modèle. Le biocapteur repose sur la liaison directe des cellules des bactéries cibles sur sa surface, tandis qu'aucun traitement préalable (par exemple par lyse cellulaire) de l'échantillon étudié est nécessaire. Un film mince de Si mésoporeux est utilisé comme élément de capteur optique du biocapteur. Sous éclairage en lumière blanche, la couche poreuse affiche motifs de franges de Fabry-Pérot bien résolus dans le spectre de réflectivité. En appliquant une transformée de Fourier rapide (FFT) pour les résultats des données de réflectivité dans un seul pic. Les variations de l'intensité du pic FFT sont surveillés. Ainsi, les bactéries cibles capturer sur la surface du biocapteur, par des interactions anticorps-antigène, induit des changements mesurables dans l'intensité des pics de la FFT, permettant une observation «en temps réel» de l'attachement de bactéries. nt "> Le film de Si mésoporeux, fabriqué par un procédé d'anodisation électrochimique, est conjugué avec des anticorps monoclonaux, spécifiques de la bactérie cible. L'immobilisation, immunoactivité et la spécificité des anticorps sont confirmées par des expériences de marquage par fluorescence. Une fois que le capteur biologique est exposée à l' bactéries cibles, les cellules sont directement capturés sur la surface de Si poreux anticorps modifié. Ces événements de capture spécifiques entraînent des changements d'intensité dans le film mince spectre du biocapteur optique interférentiel. Nous démontrons que ces biocapteurs peuvent détecter des concentrations relativement faibles de bactéries (détection limite de 10 ⁴ cellules / ml) en moins d'une heure.

Introduction

Précoce et précise l'identification des bactéries pathogènes est extrêmement important pour la sécurité alimentaire et de l'eau, surveillance de l'environnement, et le point-of-care diagnostic ^1. Les techniques traditionnelles de microbiologie sont longues, laborieuses, et n'ont pas la capacité de détecter des micro-organismes en "temps réel" ou à l'extérieur de l'environnement de laboratoire, les biocapteurs évoluent pour répondre à ces défis ^2-5.

Au cours des dernières années, le Si poreux (PSI) a émergé comme une plate-forme prometteuse pour la conception de capteurs et biocapteurs ^6-20. Cours de la dernière décennie, de nombreuses études concernant les capteurs et biocapteurs optiques à base de PSI-ont été publiés ^21,22. La couche nanostructurée PSi est typiquement fabriqué par gravure électrochimique anodique à partir d'un monocristal de Si plaquette. Les nanomatériaux PSi obtenus présentent de nombreuses caractéristiques avantageuses, comme une grande surface et le volume libre, tailles de pores qui peuvent être contrôlés et accordable optipropriétés cal ^10,16. Les propriétés optiques de la couche de PSi, comme photoluminescence ^8,11 et lumière blanche interférométrie à base de réflectance ^7,19, sont fortement influencées par les conditions environnementales. Capture d'analytes voyageurs molécules / cible à l'intérieur des résultats de couches poreuses à une variation de l'indice de réfraction moyen de la pellicule, comme une modulation observée dans le spectre de photoluminescence ou sous forme de décalage de longueur d'onde dans le spectre de réflectivité ^10.

Bien que la grande innovation dans la technologie des biocapteurs optiques PSi, il n'y a que peu de rapports sur les plates-formes à base de PSI-pour la détection de bactéries ^{6,8,20,23-29.} En outre, la plupart de ces études de preuve de concept ont démontré «indirecte» de détection des bactéries. Ainsi, en général, avant la lyse des cellules est nécessaire pour extraire les fragments de protéine / ADN ciblés, caractéristiques de la bactérie étudiée ^29. Notre approche consiste à saisir directement les bactéries ciblescellules sur le biocapteur psi. Par conséquent, les anticorps monoclonaux, qui sont spécifiques à une cible, les bactéries, sont immobilisés sur la surface poreuse. La liaison de cellules de bactéries, par l'intermédiaire d'interactions anticorps-antigène, à la surface du biocapteur induire des changements dans l'amplitude (intensité) du spectre de réflectivité ^{de 24 à 26.}

Dans ce travail, nous rapportons sur la construction d'un biocapteur à base de PSI-optique et de démontrer son application comme les biocapteurs plate-forme sans étiquette pour la détection d'Escherichia coli (E. coli) K12 (utilisées comme un micro-organisme modèle). L'surveillés le signal optique est de la lumière réfléchie à partir de la nanostructure PSi raison de Fabry-Pérot mince film interférence (Figure 1A). Les variations de l'amplitude / intensité de la lumière sont corrélés à l'immobilisation spécifique des cellules des bactéries cibles sur la surface du biocapteur, permettant une détection rapide et une quantification des bactéries.

Protocole

Une. Préparation du oxydé poreux SiO ₂

1. Plaquettes Etch Si (un seul côté brillant sur la <100> visage et fortement dopée, de type p, 0,0008 Ω · cm) dans une solution 3:1 (v / v) de solution aqueuse de HF et d'éthanol absolu pendant 30 secondes à un courant constant densité de 385 mA / cm ^2. S'il vous plaît noter que HF est un liquide très corrosif, et il doit être manipulé avec un soin extrême.
2. Rincer la surface du Si poreux (PSi) film résultant avec de l'éthanol absolu à plusieurs reprises; sécher les films sous un gaz d'azote sec.
3. Oxyder les échantillons PSi fraîchement gravé dans un four tubulaire à 800 ° C pendant 1 h dans l'air ambiant (placer l'échantillon dans le four à la température ambiante, chauffer le four à 800 ° C, laisser dans le four pendant 1 heure, éteignez le la chaudière et retirer les échantillons du four seulement à la température ambiante).

2. Biofonctionnalisation de Psio ₂ échafaudages

1. Incuber un PSi oxydé (PSIO ₂₎ l'échantillon pendant 1 heure dans mercaptopropyl (95% (MPTS) solution de triméthoxysilane-3) (108 mM dans du toluène).
2. Rincer le Psio ₂ échantillon traité au silane avec du toluène, le méthanol et l'acétone; sec sous un gaz d'azote sec.
3. Incuber la Psio ₂ échantillon de silane modifié pendant 30 min dans 1 ml de solution 100 mM PEO-iodoacétyle biotine.
4. Rincer le Psio ₂ Extrait biotine traités avec 0,1 M de tampon phosphate salin (PBS) de solution à plusieurs reprises.
5. Incuber l'échantillon ₂ Psio biotine modifiée pendant 30 min dans 1 ml de pg / ml de streptavidine (SA) solution 100.
6. Rincer le SA-traité Psio ₂ échantillon avec une solution 0,1 M PBS plusieurs fois.
7. Incuber l'échantillon SA-modifié Psio ₂ résultant pendant 30 min dans 1 ml de 100 pg / ml biotinylé E. Anticorps monoclonal coli (immunoglobuline G, IgG) ou avec une solution de 100 ug / ml d'IgG de lapin biotinylé (comme un modèle pour un anticorps monoclonal).

3. Marquage fluorescent et microscopie de fluorescence

1. Incuber les surfaces IgG modifiés avec 15 ug / ml de fluorescéine (FITC) marqué d'anti IgG de lapin pendant 40 min et à 15 ug / ml de fluorescéine (FITC) marqué IgG anti-souris comme témoin.
2. Rincer les échantillons modifiés avec 0,1 M de solution PBS à plusieurs reprises.
3. Examiner les échantillons sous un microscope à fluorescence.

4. Culture de bactéries

1. Cultiver E. bactéries coli K12 dans un tube de 10 ml avec 5 ml de milieu Luria Bertani (LB) (moyenne composition dans 1 litre d'eau désionisée: 5 g de NaCl, 5 g d'extrait de levure et 10 g de tryptone). Incuber les bactéries secouant la nuit à 37 ° C.
2. Surveiller la concentration des bactéries par la lecture de la densité optique (DO) à une longueur d'onde de 600 nm. Après croissance pendant une nuit dans du milieu LB, lire la _DO600 en utilisant un spectrophotomètre pour déterminer la concentration bactérienne. Le nombre de cellules est désastreusecte proportionnelles aux mesures (OD ₆₀₀ DO ₆₀₀ = 1 10 ⁸ cellules / ml).

5. Les bactéries de détection

1. Placez le Psio _IgG-2 modifié et soigné Psio ₂ (comme le contrôle) des échantillons dans une cellule d'écoulement en plexiglas sur mesure. Fixer la cellule d'écoulement pour s'assurer que l'échantillon réflectivité est mesurée au même endroit au cours de toutes les mesures.
2. Incuber les échantillons avec E. coli K12 suspension (10 ⁴ cellules / ml) pendant 30 min à température ambiante. Ensuite, retirer la suspension de bactéries par rinçage de la cellule avec 0,85% p / solution saline v pendant 30 min.
3. Surveiller les changements dans les données de réflectivité dans l'ensemble de l'expérience. Toutes les mesures optiques doivent être effectués dans un milieu aqueux environnant. Spectra devrait être recueilli en utilisant un spectromètre CCD et analysée par application d'une transformée de Fourier rapide (FFT), comme décrit précédemment ^25,26.
4. Confirmer la présence de la bactérie sur lasurface du biocapteur, par l'observation des échantillons sous un microscope optique verticale immédiatement après l'expérience de biocapteurs.

Résultats

PSi oxydée ₍₂₎ Psio films sont préparés comme décrit dans la section du texte protocole. Figure 1B montre une micrographie électronique à balayage à haute résolution de la pellicule de PSi obtenu après oxydation thermique. La couche Psio ₂ est caractérisé par des pores cylindriques bien définis ayant un diamètre dans la gamme de 30 à 80 nm.

L'anticorps monoclonal (IgG) molécules sont greffées sur les Psio _deux surfaces à ...

Discussion

Un immunocapteur optique sans étiquette, sur la base d'un Psio ₂ nanostructure (un film mince de Fabry-Pérot) est fabriqué, et son application potentielle comme un biocapteur pour la détection de bactéries est confirmée.

Modifications et dépannage

L'une des préoccupations majeures lors de la conception d'un immunocapteur est la sensibilité des anticorps à subir des changements de conformation non souhaitées pendant le dépôt et la ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	Siltronix Corp.		Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)	Merck	101513
Ethanol absolute	Merck	818760
PBS buffer solution (pH 7.4)			prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v			prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)	Sigma Aldrich Chemicals	175617
PEO-iodoacetyl biotin	Sigma Aldrich Chemicals	B2059
Streptavidin (SA)	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	115-095-003
Biotinylated E. coli antibody	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	1007
E. coli (K-12)			was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion