Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

Zusammenfassung

Ein Label-freien optischen Biosensor zur schnellen Nachweis von Bakterien wird eingeführt. Der Biosensor auf einem nanostrukturierten porösen Si, das dazu bestimmt ist, direkt zu erfassen, die Zielbakterien-Zellen auf ihrer Oberfläche basiert. Wir verwenden monoklonale Antikörper, auf die poröse Wandler immobilisiert, wie die Capture-Sonden. Unsere Studien zeigen die Anwendbarkeit dieser Biosensoren zum Nachweis von geringen Bakterienkonzentrationen innerhalb von Minuten, ohne vorherige Probenaufbereitung (beispielsweise Zell-Lyse).

Zusammenfassung

Ein Label-freien optischen Biosensor auf der Basis eines nanostrukturierten porösen Si ist für die schnelle Erfassung und Erkennung von Escherichia coli K12 Bakterien als Modell Mikroorganismus entwickelt. Biosensor beruht auf direkten Bindung der Zielbakterienzellen auf ihrer Oberfläche, während keine Vorbehandlung (z. B. durch Lyse der Zellen) der untersuchten Probe ist erforderlich. Mesoporöse Si-Dünnfilm als die optische Wandlerelement des Biosensors verwendet wird. Unter Beleuchtung mit weißem Licht, zeigt die poröse Schicht gut aufgelöste Fabry-Perot-Streifenmuster in seiner Reflexionsspektrum. Anwenden einer schnellen Fourier-Transformation (FFT), um die Reflexionsdaten ergibt einen einzigen Peak. Änderungen in der Intensität der Peak FFT überwacht. Somit Zielbakterien zu erfassen auf die Biosensor-Oberfläche, durch Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, induziert messbare Veränderungen in der Intensität der FFT-Spitzen, so dass für eine "Echtzeit" Beobachtung von Bakterien Befestigung. nt "> Die mesoporösen Si-Film, durch einen elektrochemischen Anodisierung hergestellt wird, wird mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die Zielbakterien konjugiert. Die Immobilisierung Immunaktivität und Spezifität der Antikörper durch Fluoreszenz-Markierungsexperimente bestätigt. Sobald der Biosensor wird den exponierten Zielbakterien, werden die Zellen direkt auf die Antikörper-modifizierten porösen Si-Oberfläche eingefangen. Diese spezifischen Einfangen Ereignisse führen Intensitätsänderungen in der optischen Dünnfilm-Interferenzspektrum des Biosensors. Wir zeigen, dass diese Biosensoren können relativ niedrige Bakterienkonzentrationen zu erkennen (Erkennungs Grenze von 10 ⁴ Zellen / ml) in weniger als einer Stunde.

Einleitung

Frühe und genaue Identifizierung von pathogenen Bakterien ist für Lebensmittel-und Wassersicherheit, Umweltüberwachung und Point-of-Care-Diagnostik ^ein extrem wichtig. Da die traditionellen Mikrobiologie Techniken sind zeitaufwendig, mühsam und nicht die Fähigkeit, Mikroorganismen in "Echtzeit" oder außerhalb der Laborumgebung zu erfassen, werden Biosensoren entwickelt, um diese Herausforderungen ^5.2 erfüllen.

In den letzten Jahren hat porösen Si (PSi) als vielversprechende Plattform für die Gestaltung von Sensoren und Biosensoren ^6-20 entstanden. Im vergangenen Jahrzehnt zahlreiche Studien über PSi-basierte optische Sensoren und Biosensoren veröffentlicht wurden ^21,22. Die nanostrukturierte Schicht PSi wird typischerweise durch elektrochemische anodische Ätzen aus einem einkristallinen Si-Wafer hergestellt. Die daraus resultierenden PSi Nanomaterialien weisen viele vorteilhafte Eigenschaften, wie große Oberfläche und Freivolumen, Porengrößen, die gesteuert werden kann und abstimmbaren optischaften ^10,16. Die optischen Eigenschaften der Schicht PSi wie Photolumineszenz ^8,11 und Weißlicht-Interferometrie Reflexionsbasis ^7,19, werden stark durch Umweltbedingungen beeinflusst. Erfassung von Gastmolekülen / Zielanalyten in der porösen Schicht zu einer Änderung des mittleren Brechungsindex des Films, als eine Modulation in der Photolumineszenz oder eine Wellenlängenverschiebung des Reflexionsspektrum ¹⁰ beobachtet.

Obwohl die überwiegende Innovation in PSi optischen Biosensor-Technologie, gibt es nur wenige Berichte über PSi-basierte Plattformen für Bakterien Erkennung ^{6,8,20,23-29.} Zudem sind die meisten dieser Proof-of-Concept-Studien "indirekte" Nachweis von Bakterien nachgewiesen. Somit wird im allgemeinen vor der Lyse der Zellen erforderlich ist, um die angestrebten Protein / DNA-Fragmente, die charakteristisch für die untersuchten Bakterien ²⁹ zu extrahieren. Unser Ansatz ist, um direkt erfassen die ZielbakterienZellen auf der PSi Biosensor. Daher werden monoklonale Antikörper, die spezifisch für Zielbakterien sind, auf die poröse Oberfläche immobilisiert ist. Bindung der Bakterienzellen durch Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, auf die Oberfläche des Biosensors induzieren Änderungen in der Amplitude (Intensität) des Reflexionsspektrums ^24-26.

In dieser Arbeit berichten wir über die Konstruktion eines optischen PSi-basierten Biosensor und zeigen ihre Anwendung als markierungsfreien Biosensoren Plattform für den Nachweis von Escherichia coli (E. coli) K12 Bakterien (als Modell verwendeten Mikroorganismus). Die überwachte optische Signal ist das Licht von der PSi Nanostruktur durch Fabry-Perot-Dünnschicht-Interferenz (Abbildung 1A) wider. Änderungen in der Lichtamplitude / Intensität auf spezifische Immobilisierung der Zielbakterienzellen korreliert auf die Biosensor-Oberfläche, was eine schnelle Detektion und Quantifizierung der Bakterien.

Protokoll

1. Herstellung von oxidierten porösen SiO ₂

1. Si-Wafer Etch (einseitig auf der <100>-Gesicht poliert und stark dotierten p-Typ, 0,0008 Ω · cm) in einem 3:1 (v / v) Lösung von wässrigen HF und absolutem Ethanol für 30 Sekunden bei einer konstanten Strom Dichte von 385 mA / cm ^2. Bitte beachten Sie, dass HF ist eine stark ätzende Flüssigkeit, und es sollte mit äußerster Vorsicht behandelt werden.
2. Spülen der Oberfläche des resultierenden porösen Si (PSI)-Films mit absolutem Ethanol mehrere Male, trocknen die Filme unter einer trockenen Stickstoffgas.
3. Oxidieren die frisch geätzten PSi Proben in einem Rohrofen bei 800 ° C für 1 Stunde in der Luft (legen Sie die Probe in den Ofen bei Raumtemperatur zu erwärmen den Ofen auf 800 ° C, lassen im Ofen 1 Stunde, schalten Sie die Ofen und Entfernen der Proben aus dem Ofen nur bei Raumtemperatur).

2. Biofunktionalisierung von PSIO ₂ Gerüste

1. Inkubation eine oxidierte PSi (PSiO ₂₎ Probe für 1 Stunde in mercaptopropyl (Trimethoxysilans-3) 95% (MPTS)-Lösung (108 mM in Toluol).
2. Mit Toluol, Methanol und Aceton gründlich Silan behandelten PSIO ₂ Probe; trocken unter einer trockenen Stickstoffgas.
3. Inkubieren des silanmodifizierten PSIO Probe ₂ für 30 min in 1 ml 100 mM PEO-Iodacetyl Biotin-Lösung.
4. Mit 0,1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mehrfach ausspülen Biotin behandelten PSIO ₂ Probe.
5. Inkubieren der Biotin-modifizierte PSIO ₂ Probe für 30 min in 1 ml von 100 ug / ml Streptavidin (SA)-Lösung.
6. Mit 0,1 M PBS-Lösung mehrmals Spülen Sie die _SA-2 behandelt PSIO Probe.
7. Inkubieren der resultierenden SA-modifizierten PSIO ₂ Probe für 30 min in 1 ml von 100 ug / ml biotinyliertem E. coli-Antikörper (Immunglobulin G, IgG)-Lösung oder mit 100 &mgr; g / ml biotinyliertem Kaninchen-IgG (als ein Modell für einen monoklonalen Antikörper).

3. Fluoreszenzmarkierung und Fluoreszenzmikroskopie

1. Inkubieren der IgG-modifizierten Oberflächen mit 15 ug / ml Fluorescein (FITC)-markierten anti-Kaninchen-IgG für 40 min und mit 15 ug / ml Fluorescein (FITC) markierten anti-Maus-IgG als Kontrolle.
2. Spülen Sie die modifizierten Proben mit 0,1 M PBS-Lösung mehrmals.
3. Untersuchen Sie die Proben unter dem Fluoreszenzmikroskop.

4. Bakterien Kultur

1. Kultivieren Sie E. coli K12-Bakterien in einer 10-ml-Röhrchen mit 5 ml Luria-Bertani (LB)-Medium (Zusammensetzung des Mediums in 1 l deionisiertem Wasser: 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt und 10 g Trypton). Inkubation die Bakterien Schütteln über Nacht bei 37 ° C
2. Überwachung der Bakterienkonzentration durch Lesen der optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 600 nm aufweist. Nach Wachstum über Nacht in LB-Medium, lesen Sie die OD ₆₀₀ mit einem Spektralphotometer, um die Bakterienkonzentration zu bestimmen. Die Anzahl der Zellen ist schrecklichctly proportional zu der OD _{600-Messungen} (1 OD ₆₀₀ = 10 ⁸ Zellen / ml).

5. Bakterien Sensing

1. Legen Sie die IgG-modifizierten PSIO ₂ und ordentlich PSIO ₂ (als Kontrolle) Proben in einem maßgeschneiderten Plexiglas Durchflusszelle. Die Durchflusszelle zu befestigen, um sicherzustellen, daß die Probe das Reflexionsvermögen an der gleichen Stelle während aller Messungen gemessen.
2. Die Proben mit E. inkubieren coli K12-Suspension (10 ⁴ Zellen / ml) für 30 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie dann die Bakteriensuspension durch Spülen der Zelle mit 0,85% w / v Kochsalzlösung für 30 min.
3. Überwachung der Änderungen der Reflexionsgraddaten während des Experiments. Alle optischen Messungen müssen in einer wässrigen Umgebung durchgeführt werden. Spektren sollten mit einer CCD-Spektrometer gesammelt und durch Anlegen schnelle Fourier-Transformation (FFT), wie zuvor beschrieben ^25,26 analysieren.
4. Bestätigen die Anwesenheit der Bakterien auf dieBiosensor-Oberfläche, durch Beobachtung der Proben unter einem Lichtmikroskop aufrecht unmittelbar nach der Biosensor-Experiments.

Ergebnisse

Oxidiert psi (PSIO ₂₎ Filme werden hergestellt, wie in dem Protokoll Text beschrieben. 1B zeigt ein hochauflösendes Rasterelektronenmikroskop-Aufnahme des erhaltenen PSi Film nach der thermischen Oxidation. Die PSIO _2-Schicht wird durch gut definierte zylindrische Poren mit einem Durchmesser im Bereich von 30-80 nm aufweist.

Der monoklonale Antikörper (IgG)-Moleküle werden auf die PSIO _zwei Oberflächen mit Hilfe eines gut etablierten Sila...

Diskussion

Ein Label-freien optischen Immun, basierend auf einem PSIO ₂ Nanostruktur (ein Fabry-Perot-Dünnfilm) hergestellt wird, und seine potentielle Anwendbarkeit als Biosensor für Nachweis von Bakterien wird bestätigt.

Änderungen und Fehlersuche

Eines der Hauptprobleme bei der Entwicklung eines Immun ist die Anfälligkeit von Antikörpern gegen unerwünschte Konformationsänderungen während der Abscheidung und Musterbildung auf dem festen Substrat, das zu e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Si wafer	Siltronix Corp.		Highly-B-doped, p-type, 0.0008 Ω-cm resistivity, <100> oriented
Aqueous HF (48%)	Merck	101513
Ethanol absolute	Merck	818760
PBS buffer solution (pH 7.4)			prepared by dissolving 50 mM Na2HPO4, 17 mM NaH2PO4, and 68 mM NaCl in Milli-Q water (18.2 MΩ)
Saline 0.85% w/v			prepared by dissolving 0.85 g NaCl in 100 ml Milli-Q water (18.2 MΩ)
95% (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTS)	Sigma Aldrich Chemicals	175617
PEO-iodoacetyl biotin	Sigma Aldrich Chemicals	B2059
Streptavidin (SA)	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-000-114
Fluorescein (DTAF)-streptavidin	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	016-010-084
Biotinylated-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	011-060-003
Fluorescently tagged anti-rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	111-095-003
Fluorescently tagged anti-mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	115-095-003
Biotinylated E. coli antibody	Jackson ImmunoResearch Labs Inc.	1007
E. coli (K-12)			was generously supplied by Prof. Sima Yaron, Technion