Procedimientos para la Identificación de priones infecciosos después de pasar por el sistema digestivo de una especie de aves

Resumen

Los carroñeros tienen potencial para trasladar infecciosas priones de encefalopatía espongiforme transmisible en sus heces a las zonas libres de la enfermedad. Nos detalle los métodos utilizados para determinar si priones de scrapie adaptados-ratón permanecen infecciosa después del paso a través del tracto digestivo de cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un consumidor común de animales muertos.

Resumen

Priónica infecciosa (PrP ^Res) material es probablemente la causa de la fatal neurodegenerativa encefalopatía espongiforme transmisible (EET) enfermedades ^1. La transmisión de las EET, como la caquexia crónica (CWD), se presume que es de un animal a ^2,3, así como de fuentes ambientales ^4-6. Los carroñeros y carnívoros tienen potencial para trasladar material de PrP ^Res a través del consumo y la excreción de carroña CWD-contaminada. Trabajos recientes han documentado el paso de material PrP ^Res a través del sistema digestivo de los cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos), un carroñero norteamericano común ^7.

Se describen los procedimientos utilizados para documentar el paso de material PrP ^Res través de cuervos americanos. Cuervos fueron alimentadas por sonda con RML-tembladera cepa adaptada a ratón y sus heces se recogieron 4 h después de alimentación forzada. Crow heces fueron reunidas después y se inyectaron por vía intraperitoneal enC57BL / 6 ratones. Los ratones fueron controlados diariamente hasta que expresaron los signos clínicos de la tembladera de ratón y se sacrificaron a partir de entonces. Ratones asintomáticos fueron monitoreados hasta 365 días después de la inoculación. Se realizó un análisis de Western blot para confirmar el estado de la enfermedad. Los resultados revelaron que los priones infecciosos permanecen después de viajar a través del sistema digestivo de cuervos y están presentes en las heces, causante de la enfermedad en los ratones de prueba.

Introducción

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son enfermedades infecciosas mortales neurodegenerativas que afectan a la vida silvestre, los animales domésticos y los seres humanos. El agente infeccioso de las EET parece ser isoformas mal plegadas o patógenos (PrP ^Res) de proteínas priónicas ^1. Las EET animales incluyen la caquexia crónica (CWD) en el venado bura (Odocoileus hemionus), el venado cola blanca (Odocoileus virginianus), el alce (Cervus elaphus), y el alce (Alces alces), la tembladera en ovinos y caprinos; encefalopatía espongiforme bovina ( EEB) en bovinos domésticos; encefalopatía transmisible del visón en el visón de criadero; encefalopatía espongiforme felina en gatos; exótica encefalopatía espongiforme de ungulados exóticos en zoológico rumia de la familia de los bóvidos, y la encefalopatía espongiforme en los primates no humanos ^8. La enfermedad TSE humano único, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob variante, es raro y pensado para ser adquirida por el consumo de PrP ^Res-contamialimentos ATED ^9. Del mismo modo, la EEB puede infectar a los seres humanos si carne contaminada se consume ^10. De todas las enfermedades EET, la tembladera y la caquexia crónica son los dos únicos con las epidemias y las fuentes de infección autosostenibles se supone que son de un animal a ^2,3,11, así como de fuentes ambientales ^4-6. La investigación sugiere que la mayoría de las EET requieren períodos de incubación prolongados notables de eventos de exposición naturales de materiales PrP ^Res a la manifestación de signos clínicos ^2-4,6,8 y barreras de las especies aparentes minimizar, pero no eliminan la posibilidad de que, la transmisión entre ^12-14 .

Identificar mecanismos para la difusión de la (PrP ^Res) Material prión infeccioso es extremadamente importante para responder a las preguntas acerca de cómo las EET se mueven a través del paisaje. Las investigaciones experimentales han sugerido que los insectos ^15,16, aves de corral y cerdos ^17, y cuervos americanos (Corvus brachyrhynchos) ^7,18 son portadores pasivos o dispersores de material PrP ^Res. La aprobación de material de PrP ^Res a través del sistema digestivo de los cuervos se ha documentado recientemente, lo que demuestra el papel que pueden desempeñar en la dispersión de las EET ^7. Estos resultados hacen que sea posible que los cuervos, un carroñero, podrían encontrar, consumen, y transportan material infeccioso a través de las heces de depósito, a las zonas libres de la enfermedad.

Los procedimientos demostramos aquí se utilizan para documentar el paso de material PrP ^Res a través del sistema de digestión de los cuervos y facilitará en gran medida la aplicación de estos métodos para otro carroñero y modelos específicos de especies de carnívoros en futuras investigaciones relacionadas. En este estudio se utilizaron métodos convencionales para investigar un medio no convencional de la trata de material PrP ^Res, que podría contribuir a la difusión y la carga total de material de PrP ^Res.

Protocolo

Nuestro protocolo es una adaptación de una publicamos previamente ^7. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Departamento de Agricultura de EE.UU. (USDA), Servicio de Inspección de Sanidad Agropecuaria (APHIS), Wildlife Services (WS), Centro Nacional de Investigación de la Vida Silvestre (CNRH) Cuidado de Animales institucional y el uso.

1. Crow gavaging

1. Estimar el tiempo de paso de la "materia cerebral seudo 'a través del tracto digestivo de los cuervos americanos.
   1. Mezclar 5 ml de cocido y revueltos huevo entero con el tinte azul y sonda nasogástrica 1 cuervo usando un 2 en aguja de sonda (Figura 1).
   2. Compruebe cuervo cada 30 minutos hasta que las heces de color azul / verde manchado ya no se excreta.
2. Obtener infectados por RML (cepa Chandler) C57BL / 6 cerebros infectados y enfermos terminales de ratón.
3. Generar un 20% en peso / volumen normal y infectada homogeneizado de cerebro de ratón en un homogeneizador mezclador bala con 1xtampón fosfato salino (PBS) y cuentas de vidrio, luego se centrifuga a 3000 × g durante 1 min para eliminar las partículas más grandes. Eliminar el sobrenadante y diluir con un volumen igual de PBS 1x para generar un 10% en peso / vol, en PBS estéril. Congelación a -80 ° C hasta que se necesite.
4. 17 horas antes de la alimentación forzada a eliminar la comida, pero no el agua, a partir de plumas de gallo.
5. Aleatoriamente asignar cuervos a los grupos de tratamiento y alimentación forzada por vía oral cada cuervo con 5 ml de homogeneizado normal o infectado el cerebro de ratón usando un 2 en aguja de sonda.
6. Transferencia cante a jaulas individuales y recopilar y poner en común todas las heces dentro de cada jaula de 4 h después de la alimentación por sonda (Figura 2).
7. Homogeneizar heces agrupados para cada cuervo en un homogeneizador mezclador bala con perlas de vidrio hasta que se consigue una textura uniforme. * Heces Crow son en su mayoría líquidos y se pueden mezclar fácilmente.
8. Para cada cuervo, diluir 500 l de homogenado fecal en 9,5 ml de 1x PBS para un volumen total de 10 ml.
9. Centrifugar la homogena fecalTE durante 15 minutos a 1400 xg y extraer el sobrenadante.
10. Para reducir al mínimo la amenaza de una infección microbiana secundaria, el tratamiento de sobrenadante con 1 l de 100 unidades / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen, NY) por cada 100 l de homogeneizado a continuación, colocar bajo luz UV a temperatura ambiente durante 20 min para reducir riesgo de contaminación viral y bacteriana. Después de la exposición UV, las muestras se somete a ultrasonidos en un baño de ultrasonidos 3000 Mp en el ajuste 70 durante 30 segundos para romper la membrana de los microbios restantes.

2. Inoculación de ratones

1. Aleatoriamente asignar los ratones a los siguientes grupos de tratamiento (Tabla 1):
   1. Grupo 1 - ratones de tratamiento positivos inoculados por vía intraperitoneal (IP) con 1 ml de homogenado fecal de cuervos alimentado a la fuerza con 5ml infectados cerebros de ratón.
   2. Grupo 2 - Negativo ratones en tratamiento inoculados IP con 1 ml de homogenado fecal de cuervos alimentado a la fuerza con 5ml cerebros normales de ratón.
   3. Diluir infecteD y normal homogeneizado de cerebro de ratón para los Grupos 3 y 4 a 1:100 w / v en PBS 1x.
   4. Grupo 3 - ratones de control positivos inoculados IP con 1 ml de infectada homogeneizado de cerebro de ratón.
   5. Grupo 4 - ratones de control negativo inocularon ip con 1 ml de homogenado normal de cerebro de ratón.

	Grupo de Tratamiento	Número de animales
Grupo 1	Tembladera + Crow heces	100
Grupo 2	Tembladera - Crow heces	25
Grupo 3	Scrapie + ratón Cerebro	10
Grupo 4	Scrapie - Ratón Cerebro	5

. Cuadro 1 Estado de la tembladera de inóculo (+ positivo, negativo -) y el número de animales utilizados ^7.

2. Intraperitoneal inocular ratón:
   1. Ratón Scruff por dorsal piel del cuello con el pulgar y el dedo índice y suavemente gire para exponer la parte ventral.
   2. Eleve extremo posterior del ratón para que la cabeza es ligeramente inferior.
   3. Inserte la aguja 25 G 1 cm a través de la piel, 1 cm lateral de la línea media, y 1-2 cm por delante de la articulación sacroilíaca utilizando una jeringa con aguja de bloqueo.
   4. Inyectar 1 ml inocular lentamente en la cavidad del cuerpo del ratón.

3. Monitoreo Ratón

1. Monitorear los ratones diariamente hasta que expresan los signos clínicos de la tembladera ratón. Los signos clínicos pueden incluir: cifosis, ataxia, cola rígida, falta de aseo, emaciación y letargo.
2. Puntuación ratones para cada uno de los 6 signos clínicos cuando los signos visibles son evidentes, donde 0 = ninguno visible, 1 = moderado, 2 = y severa.
3. La eutanasia a los ratones cuando las puntuaciones diarias totales para cada signo alcanzan ≥ 8 por 1 día, ≥ 6 continua durante 3 días, o 365 días después de la inoculación (dpi).
4. Cerebros cosecha inmediatamente después euthanasia y almacenar a -70 ° C.
5. Para confirmar un diagnóstico de la tembladera, digerir muestras de cerebro con 3 l de un 50 g / ml de solución de proteinasa K (PK) diluidas de la siguiente manera: 3.1. l de PK, 12,5 l de EDTA 500 mM, pH 8, 109.39 l de 1x PBS durante 30 min a 45 ° C, a continuación, inactivar la PK mediante la adición de 8 l de tampón de carga e incubando las muestras a 95 ° C durante 5 min. Cargar las muestras en un gel de SDS-PAGE al 12%, electroforesis y transferencia a membrana Immobilon PVDF y bloque con 5% de leche sin grasa en 0,2% de Tween 20 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, la sonda con Bar224 anticuerpo monoclonal anti-PrP conjugado con peroxidasa de rábano picante, diluida en superbloque, durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague la membrana durante 1 hora con PBS-Tween 20 al 0,2%. Para visualizar, incubar Western blot 5 min con sustrato quimioluminiscente y la imagen de un sistema de documentación de gel G-box.

Resultados

Los procedimientos utilizados demuestran que el sistema digestivo de cuervos no elimina la PrP ^Res. infectividad 4 horas después de la alimentación forzada oral de homogeneizado de cerebro tembladera ^7. Los veinte cuervos que fueron alimentadas por sonda con material de PrP ^Res transmiten posteriormente el material PrP ^Res vía heces a los ratones. Ratones enfermos se identificaron por la manifestación de signos-ratón de tembladera clínicos y la confirmación de la enferm...

Discusión

Se demuestra un procedimiento para documentar el paso de material de PrP ^Res. través del sistema digestivo de cuervos. Se utilizaron los métodos convencionales para determinar si los cuervos tienen la capacidad de trasladar material de PrP ^Res a las áreas geográficas libres de la enfermedad. Otros han evaluado la resistencia de PrP ^Res a rumiantes y roedores ^{19-21 22,23} líquidos digestivos, los cuales no pudieron eliminarlo. Futura aplicación de estas técnicas debe ser ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene