Procedimentos para identificar Infecciosas príons após a passagem através do sistema digestivo de uma espécie de aves

Resumo

Catadores têm potencial para translocam infecciosas transmissíveis prions encefalopatia espongiforme em suas fezes para áreas livres da doença. Nós métodos de detalhes usados ​​para determinar se prions de scrapie mouse adaptados permanecer infeccioso após a passagem que o trato digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), o consumidor comum de animais mortos.

Resumo

Material de príon infeccioso (PrP ^Res) é provável que a causa da fatal, neurodegenerativa Encefalopatia Espongiforme Transmissível (EET) doenças ^1. A transmissão de doenças TSE, tais como a doença debilitante crónica (CWD), presume-se ser de animal para animal ^{de 2,3,} bem como a partir de fontes ambientais ^4-6. Catadores e carnívoros têm potencial para translocação de material PrP ^Res através do consumo e excreção de carniça contaminados com CWD. Trabalhos recentes tem documentado passagem de material PrP ^Res através do sistema digestivo dos corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos), um limpador norte-americano comum ^7.

Nós descrevemos os procedimentos utilizados para documentar a passagem de material PrP ^Res através corvos americanos. Crows foram tratadas por gavage com RML-deformação scrapie adaptado do rato e suas fezes foram coletadas 4 post hr gavage. Fezes galinha foram em seguida reunidas e injectadas por via intraperitoneal emC57BL / 6. Ratos foram monitorados diariamente até que eles manifestaram sinais clínicos de rato scrapie e foram, posteriormente, submetidos à eutanásia. Camundongos assintomáticos foram monitoradas durante 365 dias após a inoculação. Análise de Western blot foi realizada para confirmar o estado da doença. Os resultados revelaram que os príons infecciosos permanecer depois de viajar através do sistema digestivo de corvos e estão presentes nas fezes, causando doença em ratos de teste.

Introdução

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são desordens neurodegenerativas fatais infecciosas que afetam a vida selvagem, os animais domésticos e seres humanos. O agente infeccioso de doenças TSE parece ser isoformas deformadas ou patogênicos (PrP ^Res) de ^uma proteína príon. EET animal incluem doença debilitante crônica (CWD) em veados (Odocoileus hemionus), veados de cauda branca (Odocoileus), alces (Cervus elaphus) e alce (Alces alces); scrapie em ovinos e caprinos; encefalopatia espongiforme bovina ( BSE) em gado doméstico; encefalopatia mink transmissível em mink viveiro; encefalopatia espongiforme felina em gatos; exótico encefalopatia espongiforme ungulados em exótico jardim zoológico rumina da família dos bovídeos, e encefalopatia espongiforme em primatas não humanos ^8. A doença TSE humano único, a doença de Creutzfeldt-Jakob variante, é raro e pensado para ser adquirida através do consumo de PrP ^Res-contaminalimentos ciado ^9. Da mesma forma, a EEB pode infectar os seres humanos se carne contaminada é consumida ^10. De todas as doenças TSE, scrapie e CWD são os dois únicos com epidemias auto-sustentáveis ​​e fontes de infecção se presume ser de animal para animal ^2,3,11, bem como a partir de fontes ambientais ^4-6. A pesquisa sugere que a maioria das doenças TSE exigem períodos de incubação prolongados notáveis ​​de eventos de exposição naturais de PrP ^Res a manifestação de sinais clínicos ^2-4,6,8 e barreiras de espécies aparentes minimizar, mas não eliminar o potencial de, a transmissão entre espécies ^12-14 .

Identificar mecanismos para a propagação do príon infeccioso (PrP ^Res) o material é extremamente importante para responder a perguntas sobre como as doenças TSE mover por toda a paisagem. Estudos experimentais têm sugerido que os insetos ^15,16, aves e suínos ^17, e os corvos-americanos (Corvus brachyrhynchos) ^7,18 são portadores passivos ou dispersores de material PrP ^Res. A passagem de material de PrP ^Res através do sistema digestivo de corvos foi recentemente documentado, demonstrando o papel que podem desempenhar na dispersão de doenças TSE ^7. Estes resultados tornam plausível que corvos, um limpador, poderia encontrar, consumir e transportar o material infeccioso via deposição de fezes, para áreas livres da doença.

Os procedimentos que demonstram aqui foram usados ​​para documentar a passagem de material PrP ^Res através do sistema de digestão de corvos e vai facilitar muito a aplicação destes métodos para outro limpador e modelos específicos de espécies de carnívoros em futuras pesquisas relacionadas. Neste estudo foram utilizados os métodos convencionais para investigar um meio não-convencionais de tráfico de material PrP ^Res, o que poderia contribuir para a disseminação e carga global de material PrP ^Res.

Protocolo

Nosso protocolo foi adaptado de um nós publicado anteriormente ^7. Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA), de animais e plantas Serviço de Inspeção de Saúde (APHIS), Wildlife Services (WS), Centro Nacional de Pesquisa da Vida Selvagem (NWRC) Institutional Animal Care e Use.

1. Corvo Gavaging

1. Estimar o tempo de passagem do 'material cerebral pseudo' através do trato digestivo de corvos americanos.
   1. Misture 5 ml de cozidos e ovos mexidos inteiro com corante azul e gavage um corvo com um 2 em agulha gavage (Figura 1).
   2. Verifique corvo a cada 30 minutos até que azul / fezes verdes com manchas não estão mais sendo excretado.
2. Obter RML (Chandler tensão) infectados C57BL / 6 cérebros não infectados e doentes terminais do mouse.
3. Gerar a 20% peso / volume normal e infectado homogeneizado mouse-cérebro em um homogeneizador de bala liquidificador com 1xsalina tamponada com fosfato (PBS) e esferas de vidro, em seguida, centrifugar a 3.000 g durante 1 min para remover as partículas maiores. Remover o sobrenadante e dilui-se com um volume igual de PBS 1x para gerar a 10% em peso / volume em PBS estéril. Congelar a -80 ° C até ser necessário.
4. 17 horas antes da gavage remover comida, mas não de água, a partir de penas de galinha.
5. Aleatoriamente alocar corvos para os grupos de tratamento e por via oral gavage cada corvo com 5 ml de homogeneizado normal ou infectado cérebro do rato usando um 2 em agulha gavage.
6. Transferência de corvos para gaiolas individuais e coletar e agrupar todas as fezes dentro de cada gaiola para 4 post hr gavage (Figura 2).
7. Homogeneizar fezes reunidas para cada corvo num homogeneizador bala misturador com esferas de vidro, até uma textura uniforme. * Fezes galinha são na maior parte de líquido e pode ser misturado facilmente.
8. Para cada corvo, diluir a 500 ul de homogeneizado fecal em 9,5 ml de 1x PBS para um volume total de 10 ml.
9. Centrifugar a homogena fecalte durante 15 minutos a 1400 xg e extrair o sobrenadante.
10. Para minimizar o risco de uma infecção microbiana secundária, tratar o sobrenadante com 1 ml de 100 unidades / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (Invitrogen, EUA) por cada 100 mL de homogeneizado, em seguida, colocar sob luz UV a temperatura ambiente durante 20 min para reduzir risco de contaminação viral e bacteriana. Após a exposição à radiação UV, as amostras sonicate em 3000 um Mp sonicador em configuração 70 para 30 segundos para romper a membrana de qualquer micróbio restantes.

2. Rato Inoculação

1. Aleatoriamente alocar ratos para os seguintes grupos de tratamento (Tabela 1):
   1. Grupo 1 - camundongos positivos do tratamento inoculado por via intraperitoneal (IP) com 1 ml de homogeneizado fecal de corvos oralmente tratadas por gavage com 5ml de camundongo infectado cérebros.
   2. Grupo 2 - Negativo camundongos inoculados tratamento IP com 1 ml de homogeneizado fecal de corvos oralmente tratadas por gavage com 5ml cérebros de camundongos normais.
   3. Diluir infected e normal homogeneizado cérebro do rato para Grupos 3 e 4 a 1:100 w / v em 1x PBS.
   4. Grupo 3 - murganhos de controlo positivo IP inoculados com 1 ml de homogeneizado de rato infectado-cérebro.
   5. Grupo 4 - Negativo ratinhos de controlo inoculados IP com 1 ml de homogeneizado de cérebro de rato normal-.

	Grupo de Tratamento	Número de animais
Grupo 1	Scrapie + Corvo Fezes	100
Grupo 2	Scrapie - Corvo Fezes	25
Grupo 3	Scrapie + Mouse Cérebro	10
Grupo 4	Scrapie - Rato Cérebro	5

Estatuto Tabela 1 Scrapie de inóculo (+ positivo, negativo -). Eo número de animais utilizados ^7.

2. Intraperitoneal inocular mouse:
   1. Scruff rato por dorsal pele do pescoço com o polegar eo dedo indicador e rode suavemente para expor o lado ventral.
   2. Elevar extremidade posterior do mouse assim que a cabeça é um pouco menor.
   3. Insira 25 G agulha através de um centímetro de pele, um centímetro lateral da linha média, e 1-2 cm anterior à articulação sacro-ilíaca, utilizando uma seringa de agulha de bloqueio.
   4. Injectar 1 ml inocular lentamente rato cavidade do corpo.

3. Rato de Monitoramento

1. Monitorar os ratos diariamente até que eles expressam sinais clínicos de rato scrapie. Os sinais clínicos podem incluir: cifose, ataxia, rabo duro, falta de higiene, emagrecimento e letargia.
2. Pontuação ratos para cada um dos seis sinais clínicos, quando os sinais visíveis são evidentes, em que 0 = nenhum visível, 1 = moderado, 2 = e grave.
3. Eutanásia ratos quando escores totais diárias para cada signo atingir ≥ 8 para 1 dia, ≥ 6 continuamente por 3 dias, ou aos 365 dias após a inoculação (dpi).
4. Cérebros colheita imediatamente após euthanÁsia e armazenar a -70 ° C.
5. Para confirmar um diagnóstico de scrapie, digerir as amostras de cérebro com 3 mL de um 50 ug / ml de solução de proteinase K (PK) diluídos como se segue: 3.1. ul PK, 12,5 uL de EDTA 500 mM, pH 8, 109,39 ul de 1x PBS durante 30 min a 45 ° C, em seguida, desactivar o PK adicionando 8 ul de tampão de carga e incubando amostras a 95 ° C durante 5 min. Carregar as amostras num gel de SDS-PAGE a 12%, electroforese e transferência para PVDF Immobilon membrana e bloqueio com 5% de leite desnatado em 0,2% de Tween 20 em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida sondar com Bar224 anticorpo monoclonal anti-PRP conjugado com peroxidase de rábano, diluído em Superblock, durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar membrana durante 1 hora com PBS-Tween 20 a 0,2%. Para visualizar, incubar Western blot 5 min com substrato quimioluminescente e imagem em um sistema de documentação de gel G-box.

Resultados

Os procedimentos utilizados demonstram que o sistema digestivo do corvos não elimina PrP ^Res. infecciosidade 4 h após gavagem oral de homogeneizado de cérebro scrapie ^7. Todos os vinte corvos que foram tratadas por gavage com material PrP ^Res posteriormente transmitidos material de PrP ^Res via fezes de ratos. Ratos doentes foram identificados pela manifestação dos sinais rato-scrapie clínicos e confirmação da doença foi completada por análise de Western blot.

Discussão

Nós demonstramos um procedimento para documentar a passagem de material de PrP ^Res através do sistema digestivo de corvos. Usamos métodos convencionais para determinar se os corvos têm a capacidade de translocação de material PrP ^Res para áreas geográficas livres da doença. Outros avaliaram a resistência de PrP ^Res para ruminantes ^19-21 e roedores ^22,23 fluidos digestivos, sendo que ambos não conseguiram eliminá-lo. A futura aplicação destas técnicas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene