Процедуры выявления инфекционных прионов после прохождения через пищеварительный тракт птичьего видов

Резюме

Падальщики есть потенциал, чтобы перемещать инфекционные инфекционные губчатой ​​энцефалопатии прионы в их фекалиях безрецидивному областях. Мы методов детали, используемые для определения, если мышь-адаптированные скрепи прионы остаются инфекционные после прохождения хотя пищеварительного тракта американских ворон (Corvus brachyrhynchos), общей потребителя мертвых животных.

Аннотация

Инфекционные прионов (PRP ^Res) материал, скорее всего, причиной смертельных, нейродегенеративных передающегося губчатой ​​энцефалопатии (TSE) заболеваний ^1. Передача TSE заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО), как предполагают, от животного к животному ^2,3, а также от экологических источников ^4-6. Падальщики и плотоядные есть потенциал, чтобы перемещать PrP ^Res материала через потребление и экскреции УХО загрязненных падалью. Последние работы документально прохождение PrP ^Res материала через пищеварительную систему американских ворон (Corvus brachyrhynchos), общей североамериканского поглотителя ^7.

Мы описываем процедуры, используемые для документирования прохождения PrP ^Res материала через американские вороны. Вороны были через желудочный зонд с RML-деформированного мыши адаптированных скрепи и их фекалии собирают 4 ч после введения через зонд. Crow фекалии собирают и затем вводили внутрибрюшинно вC57BL / 6 мышей. Мышей контролировали ежедневно, пока они не выразили клинические признаки мыши скрепи и были впоследствии подвергнуты эвтаназии. Бессимптомные мышей не наблюдали до 365 дней после инокуляции. Вестерн-блот анализ был проведен для подтверждения статуса заболевания. Результаты показали, что прионы остаются инфекционные после путешествия через пищеварительную систему ворон и присутствуют в кале, вызывая болезни в тестовых мышей.

Введение

Трансмиссивные губчатые энцефалопатии (TSE) смертельные инфекционные нейродегенеративные расстройства, которые влияют на диких животных, домашние животные, и люди. Возбудитель из TSE заболеваний, как представляется, неправильно уложенные или патогенные изоформы (PRP ^Res) прионных белков ^1. Животное TSE заболевания включают хроническое заболевание атрофии (УХО) в оленя мула (Odocoileus hemionus), белохвостый олень (Odocoileus virginianus), лося (Cervus Elaphus) и лося (Alces Alces); скрепи у овец и коз; коровьей губчатой ​​энцефалопатии ( БФБ) в домашнего скота; передающийся норки энцефалопатия в выращиваемых норки; кошачий губчатая энцефалопатия у кошек; экзотические копытных губчатая энцефалопатия в экзотическом зоопарке размышляет семейного парнокопытных и губчатая энцефалопатия в приматов ^8. Сингл болезнь человеческого TSE, вариант болезни Крейтцфельда-Якоба, является редким и считается, приобрел, потребляя PrP ^{Res-разли}ованные питания ^9. Точно так же, BSE может инфицировать людей при загрязнении говядины расходуется ^10. Из всех заболеваний TSE, скрепи и УХО являются только два с самостоятельных эпидемий и источников для инфекции, как предполагается, будет от животного к животному ^2,3,11, а также от экологических источников ^4-6. Исследования показывают, что большинство болезней TSE требуют заметных длительные периоды инкубации от природных явлений облучения PrP ^Res материала проявления клинических признаков ^2-4,6,8 и очевидные видов барьеры минимизировать, но не устраняют потенциал для, передачи межвидовая ^12-14 .

Выявление механизмов для распространения инфекционных прионов (PRP ^Res) материала является чрезвычайно важным для ответов на вопросы о том, как TSE заболевания двигаться по всему ландшафту. Экспериментальные исследования показали, что насекомые ^15,16, птицы и свиней ¹⁷ и американские вороны (Corvus Брачhyrhynchos) ^7,18 являются пассивными носителями или диспергаторы из PrP ^Res материала. Прохождение PrP ^Res материала через пищеварительную систему ворон недавно были задокументированы, демонстрируя роль они могут сыграть в разгоне TSE заболеваний ^7. Эти результаты дают вероятно, что вороны, мусорщик, может столкнуться, потреблять и транспортировать инфекционного материала с помощью осаждения фекалий, безрецидивному областях.

Процедуры мы демонстрируем здесь были использованы для документирования прохождения PrP ^Res материала через системы пищеварения ворон и значительно облегчит применение этих методов к другим поглотителя и мясоеда видовой конкретных моделей в соответствующих будущих исследований. В этом исследовании обычные методы были использованы для исследования нетрадиционных средств торговли людьми, PrP ^Res материал, который мог бы внести вклад в распространение и общей бремени PrP ^Res материала.

протокол

Наш протокол адаптирован из одного мы ранее опубликованной ^7. Все процедуры с участием животных были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Соединенных Штатов департамента сельского хозяйства (USDA), животных и растений инспекционной службы здравоохранения (APHIS), дикой природы служб (WS), Национального исследовательского центра дикой природы (NWRC) на.

1. Ворона Gavaging

1. Оценка срок прохождения 'псевдо мозга материала "через пищеварительный тракт американских ворон.
   1. Смешайте 5 мл приготовленные и яичница целое яйцо с синим красителем и через желудочный зонд 1 ворона с использованием 2 в зондового иглы (рис. 1).
   2. Проверьте ворона каждые 30 мин до тех пор, синий / зеленый окрашенных фекалий не больше не выводятся из организма.
2. Получить незараженных и неизлечимо больных RML (Чандлер штамм)-инфицированных C57BL / 6 мозги мыши.
3. Создайте 20% вес / объем нормальный и зараженный гомогената мыши мозга в пуля блендера гомогенизатор с 1хфосфатный буферный раствор (PBS), и стеклянные бусы, то центрифуге при 3000 мкг в течение 1 мин для удаления крупных твердых частиц. Удалить супернатант и разбавляют равным объемом 1x PBS, чтобы генерировать 10% вес / объем в стерильном PBS. Замораживание при -80 ° С до использования.
4. 17 ч до зонд удаления остатков пищи, но не воды, от ворона ручек.
5. Случайно выделить ворон в группах лечения и в устной форме через желудочный зонд каждый ворону с 5 мл либо нормальной или зараженной гомогената мозга мыши с помощью 2 в зондового иглы.
6. Передача вороны в индивидуальные клетки и собирать и объединять все фекалии внутри каждой клетки в течение 4 часов после кормления через желудочный зонд (рис. 2).
7. Гомогенизируют объединенных фекалии для каждого ворона в пуля блендера гомогенизатора со стеклянными шариками до образования однородной текстуры не будет достигнута. * Crow фекалии в основном жидкости и может быть легко смешивается.
8. Для каждого ворон, разбавленной 500 мкл гомогената фекального в 9,5 мл 1x PBS при общем объеме 10 мл.
9. Центрифуга фекальный homogenaТе течение 15 мин при 1400 х г и извлечения супернатанта.
10. Чтобы свести к минимуму угрозу вторичного микробной инфекции, лечения супернатант с 1 мкл 100 единиц / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, Нью-Йорк) в 100 мкл гомогената затем поместите под УФ-светом при комнатной температуре в течение 20 мин, чтобы уменьшить риск вирусного и бактериального загрязнения. После УФ-облучения, соникатные образцы в 3000 Мп для обработки ультразвуком на установке 70 в течение 30 сек, чтобы сорвать мембрану оставшихся микробов.

2. Мышь Прививка

1. Случайно выделить мышей на следующие группы лечения (табл. 1):
   1. Группа 1 - Положительные мышей лечение прививку внутрибрюшинно (IP) 1 мл фекального гомогената из ворон устно которым вводили 5 мл заражен мозг мыши.
   2. Группа 2 - мыши лечения Отрицательный прививку IP 1 мл фекального гомогената из ворон устно которым вводили 5 мл нормальных мозгах мыши.
   3. Развести infecteг и нормальной мозга мыши гомогенат для групп 3 и 4 до 1:100 вес / объем в 1x PBS.
   4. Группа 3 - Положительные контрольные мыши прививку IP 1 мл зараженной гомогената мыши мозга.
   5. Группа 4 - Отрицательный контрольных мышей прививали IP 1 мл нормальной гомогената мыши мозга.

	Группа по лечению	Количество животных
Группа 1	Скрепи + Crow Фекалии	100
Группа 2	Скрепи - Crow Фекалии	25
Группа 3	Скрепи + Mouse Brain	10
Группа 4	Скрепи - мозга мыши	5

. Таблица 1 Скрепи статус посевного (положительный +, отрицательный -) и количество животных используется ^7.

2. Внутрибрюшинно прививку мышь:
   1. Scruff мыши на спинной шеи меха с большим и указательным пальцами и аккуратно поверните выставить брюшной стороне.
   2. Поднимите задний конец мыши так голова немного ниже.
   3. Вставьте 25 г иглы 1 см через кожу, 1 см латеральнее от средней линии, и 1-2 см впереди крестцово-подвздошных сочленений, используя иглы блокировки шприц.
   4. Введите 1 мл инокул медленно в полости тела мыши.

3. Мониторинг мышь

1. Монитор мышей ежедневно, пока они не выражают клинические признаки мыши скрепи. Клинические признаки могут включать: кифоз, атаксия, ригидность хвост, отсутствие ухода, истощение, и вялость.
2. Оценка мышей для каждого из клинических признаков 6, когда видимые признаки очевидны, где 0 = нет видимый, 1 = умеренная, и 2 = тяжелая.
3. Усыпить мышей, когда общая суточная баллы за каждого знака достичь ≥ 8 в течение 1 дня, ≥ 6 непрерывно в течение 3-х дней, или, по крайней 365 дней после прививки (точек на дюйм).
4. Урожай мозги сразу же после euthanАзия и хранить при температуре -70 ° С.
5. Чтобы подтвердить диагноз скрепи, переварить образцы мозга с 3 мкл 50 мкг / мл раствора протеиназы-К (PK) разбавленных следующим образом: 3.1. PK мкл, 12,5 мкл 500 мМ ЭДТА, рН 8, 109,39 мкл 1х PBS в течение 30 мин при 45 ° С, затем инактивируют добавлением PK 8 мкл загрузочного буфера и инкубации образцов при 95 ° С в течение 5 мин. Загружают образцы на 12% SDS-PAGE гель, électrophorèse и передачи в Immobilon PVDF мембрану и блок с 5% обезжиренным молоком в 0,2% Твин 20 в ЗФР ​​в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем зонд с Bar224 анти-PRP моноклонального антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена, разведенного в Суперблок, в течение 1 часа при комнатной температуре. Промыть мембрану в течение 1 часа с PBS-0.2% Tween 20. Для визуализации, инкубировать вестерн-блот 5 мин с хемилюминесцентной подложки и изображения на G-коробки системы гель документации.

Результаты

Процедуры, используемые продемонстрировать, что пищеварительная система ворон не исключает PrP ^Res инфективность 4 часа после перорального зонда скрепи гомогената мозга ^7. Все двадцать вороны, которые были через желудочный зонд с PrP ^Res материала впоследствии передается P...

Обсуждение

Мы демонстрируем процедуру документирования прохождения PrP ^Res материала через пищеварительную систему ворон. Мы использовали традиционные методы, чтобы определить, вороны имеют возможность перемещать PrP ^Res материал безрецидивному географических районах. Другие оценили с?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RML Chandler strain mouse-adapted scrapie	Rocky Mountain Laboratories
RC57BL/6 mice	Hilltop Lab Animals
American crows	wild captured
Pen/Strep	Invitrogen	15140-122
Phosphate buffered Saline	Invitrogen	70011-044
Sonicator	Misonix
Proteinase-K solution	Roche	3115887001
Loading buffer	Invitrogen	NP0007 and 0009
Bis-tris SDS PAGE 12% gel	Invitrogen	NP0342
Immobilon PVDF membrane	Millipore	1SEQ00010
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287
Bullet blender homogenizer	Braintree Scientific	BBX24B
2.3 mm Zirconia/silica beads	BioSpec Products	11079125Z
Bar224 anti-PrP monoclonal antibody	Cayman Chemical	10009035
Superblock	Thermo Scientific	37517
chemiluminescent substrate	Millipore	WBKLS0500
G-box gel documentation system	Syngene