Ultrasonido transabdominal para el diagnóstico del embarazo en los ciervos muntjac de Reeves

Resumen

El ultrasonido de Transabdominal se describe como medios eficaces, no invasores para evaluar la situación reproductiva en Reeves' ciervos del muntjac. Estos métodos se pueden utilizar para alcanzar diagnosis temprana del embarazo y para evaluar viabilidad fetal. Los usos futuros de esta técnica incluyen la valoración de la edad gestacional y los efectos de la enfermedad maternal sobre el desarrollo fetal.

Resumen

Los ciervos muntjac de Reeves (Muntiacus reevesi) son una pequeña especie de cérvido nativa del sudeste asiático, y actualmente están siendo investigados como un modelo potencial de transmisión y patogénesis de la enfermedad priónica. La transmisión vertical es un área de interés entre los investigadores que estudian las enfermedades infecciosas, incluida la enfermedad priónica, y estas investigaciones requieren métodos eficientes para evaluar los efectos de la infección materna en el rendimiento reproductivo. El examen ultrasonográfico es una herramienta bien establecida para diagnosticar el embarazo y evaluar la salud fetal en muchas especies animales^1-7,incluidas varias especies de cérvidos cultivados^8-19,sin embargo, esta técnica no se ha descrito en el ciervo muntjac de Reeves. Aquí describimos el uso del ultrasonido del transabdominal para detectar embarazo en muntjac hace y para evaluar crecimiento y el desarrollo fetales a través del período gestacional. Usando este procedimiento, los animales embarazados fueron identificados tan pronto como 35 días después del emparejamiento del dor-buck y éste era un medio eficaz de supervisar con seguridad el embarazo a intervalos regulares. Los objetivos futuros de este trabajo incluirán el establecimiento de referencias de medición fetal normales para la estimación de la edad gestacional, la determinación de la sensibilidad y la especificidad de la técnica para el diagnóstico del embarazo en diversas etapas de la gestación, y la identificación de variaciones en el crecimiento y desarrollo fetal bajo diferentes condiciones experimentales.

Introducción

El examen ultrasonográfico es un método bien descrito de diagnóstico de embarazo en bovinos^1,ovinos^2,3,caprinos^4,caballos^5,animales de compañía^6,7y otras especies de animales domésticos. Esta modalidad de imagen también se ha identificado como una herramienta valiosa para la detección del embarazo y la estimación de la edad fetal en varias especies de cérvidos cautivos, incluidos los ciervos^{barbechos 8-11,}los ciervos rojos^12-16,los ciervos sika de Hokkaido¹⁷y los renos^18,19. En muchos casos, la ecografía ha producido tasas de precisión más altas que otros mecanismos de detección del embarazo, como la progesterona sérica o el análisis de glicoproteínas asociadas al embarazo^9,18. Además, la visualización ultrasonographic de la zona reproductiva puede proporcionar la información adicional con respecto a viabilidad fetal, a edad gestacional, y a la identificación de las anormalidades de desarrollo que serían de otra manera difíciles de determinar. La utilidad de la ecografía para evaluar el estado reproductivo sugiere que esta metodología debería adaptarse a otras especies en las que se utilizan programas de reproducción activa.

El ciervo muntjac de Reeves (Muntiacus reevesi) es una pequeña especie de cérvido nativo del sudeste asiático²⁰. Si bien el ciclo reproductivo de estos animales no está bien caracterizado en sus territorios nativos, los estudios de poblaciones asilvestradas en partes del sur de Inglaterra han mejorado la comprensión de sus patrones de reproducción²⁰. A diferencia de la mayoría de los cérvidos, el muntjac de Reeves parece reproducirse durante todo el año, sin picos de aduladores estacionales aparentes^20-22. Muntjac femenino da a luz típicamente a un solo cervatillo que sigue un período de gestación de 210 días, y entra confiablemente en un estro postparto dentro de 24 horas^20-22. ¿Que no conciben durante este período postparto volverá al celo aproximadamente 24-25 días más tarde²⁰. En situaciones cautivas, la reproducción se logra típicamente mediante la vivienda con uno o más machos intactos. Este sistema produce tasas de concepción satisfactorias y requiere poca habilidad técnica para el personal, sin embargo, las fechas exactas de reproducción son difíciles, si no imposibles, de determinar.

Los muntjac se utilizan comúnmente en estudios citogenéticos debido a la amplia gama de números de cromosomas diploides y la alta tasa de diversificación cariotípica entre las diferentes especies^23. Estos animales también están siendo investigados actualmente como modelo de patogénesis y transmisión de la enfermedad priónica, con especial interés en el estudio de la transmisión vertical de la enfermedad de pérdida crónica (CWD) en cérvidos. La importancia del muntjac en una serie de diferentes aplicaciones de investigación sugiere que se deben establecer tecnologías reproductivas mejoradas para complementar los procedimientos de investigación actuales. Específicamente, los mecanismos no invasores para evaluar el período gestacional podrían potencialmente aclarar variaciones críticas en funcionamiento reproductivo y crecimiento y desarrollo fetal bajo diversas condiciones experimentales. Además, el desarrollo de referencias de medición fetal en tiempo real sería potencialmente valioso para estimar la edad gestacional en situaciones en las que no se pueden determinar las fechas de reproducción. Estudios previos han descrito mecanismos para el uso de mediciones fetales, tales como la longitud de la corona-grupa (CRL), la profundidad torácica (EC) y la longitud de la cabeza (HL) para estimar la etapa aproximada de gestación en especies cérvidas^{11-14, 16,17.} Además, algunos de estos estudios también han establecido pautas que describen cuándo se pueden identificar hitos específicos del desarrollo, como la mineralización esquelética o los latidos del corazón fetales,^8-19. Si bien estos datos pueden ser útiles para ayudar a guiar el análisis de ultrasonido reproductivo en el muntjac, la mayoría de las otras especies de cérvidos estudiadas tienen un tamaño corporal mucho mayor y períodos gestacionales más largos, lo que reduce el valor de traslación de estos estudios para aplicaciones de muntjac.

El protocolo contorneado aquí describe la sonografía transabdominal del muntjac femenino con el fin de diagnosticar y de supervisar embarazo. La ejecución acertada de este protocolo puede facilitar la detección temprana del embarazo y la evaluación del crecimiento y del desarrollo fetales. Esta técnica tiene aplicaciones valiosas en la realización de estudios que investigan la reproducción, el desarrollo en el útero o la transmisión vertical de enfermedades infecciosas en un modelo de cérvido pequeño y también puede ser útil para fines clínicos en operaciones de cría en cautividad.

Protocolo

1. Preparación procesal

Todos los procedimientos de animales descritos han sido revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Colorado, una Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC), institución internacional acreditada.

1. Antes del examen, inmovilice a los animales utilizando protocolos apropiados de sedación o anestesia para proporcionar relajación y permitir un posicionamiento adecuado. Un manejador sujeta al ciervo mientras que una segunda persona administra la sedación al animal.
   Nota: Los autores han encontrado la combinación siguiente para proporcionar la sedación eficaz en esta especie: butorfanol (0,45 mg/kg), azaperona (0,035 mg/kg), y medetomidina (0,04 mg/kg), administrada intramuscular en los músculos glúteos.
2. Una vez que la mente ha alcanzado un plano de sedación que permite el manejo conforme, colóquela en reclinación dorsal o lateral en una mesa de examen o dentro de un canal en V. Eleve ligeramente la cabeza, el cuello y el tórax (aproximadamente 20-30°) para reducir el riesgo de regurgitación y aspiración de contenido ruminal y para facilitar la ventilación adecuada durante el procedimiento.
   Nota: En la mayoría de los cérvidos u otras especies de rumiantes, el ultrasonido abdominal se realiza en animales de pie; sin embargo, el tamaño pequeño y las consideraciones del comportamiento de esta especie requieren la sedación pesada para la examinación y la colocación esternal es por lo tanto más difícil y puede imposibilitar técnica de proyección de imagen eficaz. La colocación del animal a medio camino entre la reclinación esternal y lateral puede ser ideal para reducir el riesgo de regurgitación e hipoventilación y debe considerarse si es posible. En cualquier posición reclinada, es crítico monitorear cuidadosamente las respiraciones de los animales y detener inmediatamente el examen y colocar al animal en reclinación esternal si se observa regurgitación o hipoventilación.
3. Si es necesario, recorte el cabello de la zona del abdomen a examinar para lograr un contacto adecuado entre la huella del transductor y la piel.
   Nota: En la gestación temprana, la evidencia del embarazo se puede detectar en el abdomen caudal cerca de las glándulas mamarias. Esta región del muntjac es típicamente sin pelo, y por lo tanto el afeitado puede no estar indicado en este momento. A medida que el feto crece y el útero se distede para ocupar una posición más craneal en el abdomen, el recorte del cabello será necesario antes de la toma de imágenes. Se debe tener cuidado para evitar causar cualquier trauma mecánico a la piel, incluyendo laceraciones de cuchillas de afeitar o lesiones térmicas de cortadoras eléctricas.
4. Coloque la unidad de ultrasonido en una ubicación que permita al técnico visualizar fácilmente el monitor mientras realiza el examen con su mano dominante. Introduzca información de identificación de animales (nombre, número de identificación, etc.)en el sistema para etiquetar automáticamente las imágenes guardadas y los bucles de vídeo.

2. Examen de ultrasonido reproductivo transabdominal

1. Aplique una generosa cantidad de gel de acoplamiento acústico en el abdomen caudal.
2. Coloque un transductor lineal curvo de 5-10 MHz en la piel del abdomen caudal, inmediatamente craneal al pubis, y muévalo lentamente en dirección craneal para evaluar las estructuras dentro de la cavidad pélvica. Escanee los cuadrantes izquierdo y derecho del abdomen caudal para evaluar ambos cuernos del útero bicornuado del muntjac.
   Nota: El ultrasonido abdominal completo implica la evaluación de todas las vísceras abdominales, incluyendo el hígado, los riñones, el bazo, el aparato gastrointestinal, la vejiga urinaria, y la zona reproductiva. A los efectos de este protocolo, sólo se discutirá detalladamente el examen del embarazo; sin embargo, el aspecto normal de otros órganos abdominales caudales debe ser reconocido pues estas estructuras son probables ser encontradas durante el curso del estudio. Los órganos más comúnmente vistos en esta localización incluyen segmentos del aparato gastrointestinal, de la vejiga urinaria, y de la zona reproductiva. Los intestinos grueso y delgado se identifican por la apariencia característicamente estratificada de la pared intestinal. La luz puede o no ser pronunciada dependiendo del tipo y la cantidad de contenido, que puede incluir partículas de líquidos, gases, mucosas o alimentos. La vejiga urinaria puede ser difícil de identificar a menos que se distede con la orina, y las capas de la pared de la vejiga son significativamente menos distintas que las de los intestinos. Aparte del útero, los ovarios también se pueden encontrar en la ecografía del tracto reproductivo de la hembra muntjac. Los ovarios aparecerán como estructuras ovoides cerca del polo caudal de los riñones, y su apariencia puede cambiar en el transcurso del ciclo estroso. La presencia de folículos maduros múltiples, llenos de líquido dentro de la corteza es sugestiva de celo.
   Nota: Al rotar y/o "avivar" el cabezal de exploración del transductor, las estructuras se pueden evaluar en planos transversales o sagitales.
   1. Si es necesario diferenciar un útero grávido de la vejiga urinaria, vacíe la vejiga manualmente aplicando una presión suave al abdomen caudal o colocando un catéter urinario y repitiendo la exploración.
      Nota: La expresión manual de la vejiga solo debe intentarse cuando el animal está en posición esternal o vertical, lo que facilita una orientación más natural de las vísceras abdominales y reduce el riesgo de traumatismo a otras estructuras. El útero también se puede diferenciar de la vejiga urinaria mediante la evaluación del grosor de la pared del órgano. El grosor típico de una vejiga moderadamente distendido es de aproximadamente 1,4 mm^24,mientras que los autores han encontrado que la pared más musculosa del útero grávido en el muntjac generalmente mide entre 7-8 mm.
      Nota: El embarazo temprano es difícil de diagnosticar definitivamente debido a una carencia de estructuras fetales identificables, y de hecho la primera indicación del embarazo puede ser simplemente un pequeño bolsillo flúido en el abdomen caudal. Si se ve en este momento, el embrión en desarrollo aparecerá como una estructura hiperecoica, ovoide a amorfa dentro del útero (Figura 1).
3. Realice ajustes en la profundidad, la frecuencia y la ganancia según sea necesario para mejorar el contraste y el detalle de la imagen.
   Nota:las frecuencias más altas están asociadas con longitudes de onda más cortas, que son necesarias para mejorar la resolución de la imagen. La mayoría de los transductores son capaces de funcionar dentro de una gama de frecuencias (por ejemplo, 6-10 MHz)²⁴. La frecuencia se puede ajustar utilizando los controles del escáner en la unidad de ultrasonido, y el aumento de la frecuencia dará como resultado una imagen más clara. El aumento de la frecuencia simultáneamente disminuye la profundidad de la penetración de las ondas sonoras; por lo tanto, la reducción de la frecuencia puede ser necesaria para visualizar estructuras más profundas, pero la resolución puede verse comprometida²⁴. Por esta razón es importante seleccionar la frecuencia más alta posible para alcanzar la profundidad de tejido deseada. Los ajustes en los controles de ganancia alterarán la amplificación de las ondas sonoras que regresan al transductor desde los tejidos y afectarán el grado de contraste en la imagen^24. La ganancia debe establecerse en un punto en el que se logre un contraste óptimo entre los tejidos hiperecoicos e hipoecoicos, y estos ajustes pueden necesitar ser ajustados dependiendo de las estructuras que se están fotodeando.

3. Obtención de mediciones fetales

Nota:La edad gestacional en muchas especies de animales domésticos puede estimarse utilizando rangos de referencia establecidos para las mediciones fetales obtenidas del examen de ultrasonido. Las mediciones más comúnmente utilizadas incluyen la longitud recta de la corona-grupa (SCRL), la profundidad del pecho (CD) y la longitud de la cabeza (HL)^17. Si bien aún no se han recopilado datos suficientes para desarrollar pautas confiables de edad gestacional en los ciervos muntjac de Reeves, se pueden recopilar mediciones para comenzar a establecer estas referencias. Se ha demostrado que la frecuencia cardíaca fetal (FHR) en otras especies de cérvidos y rumiantes aumenta linealmente a medida que la gestación progresa hasta cierto punto (típicamente alrededor del día 60 de gestación), momento en el que la frecuencia cardíaca comienza a disminuir^17. La FHR puede ser utilizada para estimar la edad gestacional en conjunción con otras observaciones ecográficas, sin embargo es más comúnmente utilizada como medida de viabilidad fetal^17,24. La FHR se ha calculado en el muntjac de Reeves tan pronto como 35 días después del apareamiento observado.

1. Para medir el SCRL, localice el útero en el monitor y realice ajustes finos en la posición del transductor hasta obtener una visión sagital de todo el feto (Figuras 2 y 3). Congelar la imagen y medir la distancia entre el aspecto más dorsal del cráneo y la base del sacro (Figuras 2 y 3).
2. Para medir la EC, obtener una vista sagital del feto (la misma imagen puede ser utilizada para medir scrl) y medir la distancia entre los aspectos dorsales y ventrales del tórax (Figuras 2 y 3).
3. Para medir el LH, utilizando la misma vista sagital del feto que se describe para las mediciones de SCRL y CD, mida la distancia desde la cresta occipital hasta la base de lanariz (Figuras 2 y 3).
4. Para calcular la frecuencia cardíaca fetal, identifique el corazón dentro de la cavidad torácica del feto visualizando sus contracciones rítmicas. Calcule la frecuencia cardíaca contando el número de contracciones (latidos del corazón) que ocurren dentro de un período de tiempo de 1 minuto.
   Nota: Si la unidad del ultrasonido que es utilizada tiene capacidades de Doppler, esta característica se puede emplear para ayudar más lejos en la distinción del corazón de otros movimientos fetales no específicos.
5. Verifique que todas las imágenes guardadas y los bucles de video incluyan toda la información de identificación necesaria, incluido el nombre o número del animal, la fecha, las mediciones y las etiquetas de estructura apropiadas.

4. Conclusiones procesales y recuperación

1. Retire todo el gel de contacto de ultrasonido residual del abdomen del animal con un paño suave o toallas de papel. Limpie el gel del transductor antes de almacenar.
2. Si utiliza el protocolo de sedación descrito en el paso 1.1, administre atipamezol por vía subcutánea a una dosis de 0,25 mg/kg para revertir los efectos de la medetomidina. Si se utiliza un protocolo de sedación diferente en el que se dispone de un antagonista, administre este agente al animal de acuerdo con las dosis publicadas al concluir el procedimiento para acelerar la recuperación.
3. Coloque el muntjac sobre una superficie de cama suave en reclinación esternal, con la cabeza ligeramente elevada para reducir el riesgo de regurgitación y aspiración de contenido ruminal. Vigilar de cerca al animal hasta que esté completamente recuperado y pueda ambular alrededor del recinto sin ayuda.

Resultados

Usando el protocolo descrito aquí, el embarazo se puede diagnosticar y supervisar en los ciervos muntjac de Reeve con técnicas como mínimo invasores. El punto de tiempo más temprano que el embarazo pudo ser detectado por los autores fue aproximadamente 35 días después del comportamiento de apareamiento observado.

En los primeros tiempos de la gestación, el embarazo fue diagnosticado visualizando un útero lleno de líquido identificado como espacio anecoico en el abdomen caudal. Dentro ...

Discusión

Este protocolo describe el uso de la sonografía del transabdominal para la diagnosis del embarazo en Reeves' ciervos del muntjac. De acuerdo con otros estudios de ultrasonido, el equipo apropiado y la competencia técnica son imprescindibles para un examen reproductivo exitoso del do muntjac. La revisión cuidadosa de la anatomía mamífera básica, de los principios físicos del ultrasonido de diagnóstico, y del aspecto ultrasonographic típico de las vísceras abdominales ayudará en la reducción de diagnosis equivo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Butorphanol tartrate (Torbugesic) (0.45 mg/kg)	Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa	NADA 135-780
Azaperone tartrate (0.035 mg/kg)	ZooPharm
Medetomidine HCl (0.04 mg/kg)	ZooPharm
Ultrasound contact gel	Medline, Mundelein, Illinois	MDS092005
Atipamezole hydrochloride (Antisedan) (0.25 mg/kg)	Orion Corporation, Espoo, Finland	NADA 141-033
V-trough (optional)	N/A	N/A	Animal may be supported in dorsal recumbency on a standard examination table or other surface without the use of a V-trough
Electrical clippers or razor blades for hair removal	Oster, McMinnville, Tennessee	78005-140
Ultrasound system: Ibex Pro portable ultrasound	E.I. Medical Imaging, Loveland, CO	Ibex Pro
5-10 MHz transducer: CL3.8 5-2.5 MHz 60 mm curved linear array	E.I. Medical Imaging, Loveland, CO	290420
3 ml syringes	Covidien	1.18E+09
22 G needles	Covidien	8.88E+09