Picoinjection de microfluidos gotas sin electrodos metálicos

Resumen

Hemos desarrollado una técnica para picoinjecting gotas de microfluidos que no requieren electrodos de metal. Como tales, los dispositivos que incorporan nuestra técnica son más simples de fabricar y de usar.

Resumen

Los métodos existentes para picoinjecting reactivos en gotas de microfluidos requieren electrodos de metal integradas en el chip de microfluidos. La integración de estos electrodos añade pasos engorrosos y propensos a errores en el proceso de fabricación del dispositivo. Hemos desarrollado una técnica que obvia las necesidades de electrodos de metal durante picoinjection. En lugar de ello, se utiliza el propio fluido de inyección como un electrodo, ya que la mayoría de los reactivos biológicos contienen electrolitos disueltos y son conductores. Mediante la eliminación de los electrodos, se reduce el tiempo de fabricación del dispositivo y la complejidad, y hacer los dispositivos más robustos. Además, con nuestro enfoque, el volumen de inyección depende de la tensión aplicada a la solución picoinjection; esto nos permite ajustar rápidamente el volumen inyectado mediante la modulación de la tensión aplicada. Se demuestra que nuestra técnica es compatible con los reactivos que incorporan compuestos biológicos comunes, incluyendo tampones, enzimas y ácidos nucleicos.

Introducción

En la microfluídica basada en gotitas, gotitas acuosas escala de micras se utilizan como "tubos de ensayo" para reacciones biológicas. La ventaja de llevar a cabo reacciones en las pequeñas gotas es que cada gota utiliza sólo unos pl de reactivo y, con la microfluídica, las gotas se puede formar y procesada a tasas kilohercios ^1. En combinación, estas propiedades permiten a millones de reacciones con las células individuales, moléculas de ácido nucleico, o compuestos que se deben realizar en cuestión de minutos con l de total de material.

Para usar las gotas para aplicaciones de este tipo, se necesitan técnicas para la adición de volúmenes controlados de reactivos a las gotas; tales operaciones son análogos a pipeteando en tubos de ensayo. Un método para lograr esto es electrocoalescence, en el que una gota de reactivo se combina con la caída de destino mediante la aplicación de un campo eléctrico. El campo eléctrico altera la disposición de las moléculas de tensioactivo en las interfaces de las gotas, INDucing una inestabilidad de película delgada y desencadenando coalescencia en emulsiones que son por lo demás estable ^2. Fusión inducida eléctricamente también es explotada en el diseño de la picoinjector, un dispositivo que inyecta reactivos en gotas a medida que fluyen más allá de un canal de presión ^3. Para aplicar el campo eléctrico, los dispositivos picoinjector utilizan electrodos de metal, pero la integración de electrodos de metal en los chips de microfluidos es a menudo un proceso complejo y propenso a errores que los alambres de líquido de soldadura son fácilmente comprometidos por burbujas de aire o polvo y otros desechos en el canal , así como de las fracturas de estrés o doblarse durante la configuración del dispositivo.

Aquí presentamos un método para llevar a cabo picoinjection sin el uso de electrodos de metal, por lo que la fabricación más simple y más robusta. Para activar picoinjection, nosotros en cambio utilizamos el propio fluido de inyección como un electrodo, ya que la mayoría de los reactivos biológicos contienen electrolitos disueltos y son conductores. También vamos a añadir un "Faraday Moat "para proteger a regiones sensibles del dispositivo y actuar como un suelo universales (Figura 1). El foso aísla eléctricamente las gotas de aguas arriba del sitio picoinjection proporcionando un suelo, la prevención de fusión gotita no deseado. Un beneficio adicional de nuestra técnica es que el volumen inyectado en las gotas depende de la magnitud de la tensión aplicada, permitiendo que se ajusta mediante la regulación de la señal aplicada.

Fabricamos nuestros dispositivos en poli (dimetilsiloxano) (PDMS) usando técnicas fotolitográficas suaves ^4,5. Nuestro enfoque es compatible con dispositivos fabricados en otros materiales, como resinas, plásticos y resinas epoxi. Los canales tienen alturas y anchuras de 30 micras, que son óptimas para trabajar con gotitas de 50 m de diámetro (65 pl). Introducimos los reactivos a través de tubos de polietileno (0.3/1.09 mm de diámetro interior / exterior) insertado en los puertos creados durante la fabricación del dispositivo de 0,50 mm punzones de biopsia, de forma similar a los métodos described previamente ^5. La composición exacta del fluido de inyección depende de la aplicación específica. El fluido sólo necesita contener electrolitos disueltos en concentraciones lo suficientemente altas para producir la suficiente conductividad para la señal eléctrica que se transmite a la picoinjector. En pruebas de banco, hemos encontrado que las concentraciones iónicas superiores a 10 mM deberían bastar ^6, aunque este valor y conductividades de fluido dependen de las dimensiones específicas del dispositivo y la magnitud de la tensión aplicada.

Protocolo

1. Diseño Dimensiones del dispositivo y topologías Basado en Experimental necesidades mediante diseño asistido por ordenador (CAD) Software

Nota: Selección de diámetros del canal de emulsión más pequeñas que las de las gotitas esféricas. Esto obliga a las gotitas en una forma cilíndrica o "salchicha" y permite picoinjection más eficaz. Para nuestros propósitos, hemos diseñado 30 x 30 micras canales de gotas que eran 50 m de diámetro.

1. Sitio picoinjection Modelo (s) después de los descritos por Abate et al. ³ con la excepción de que se eliminan los canales para los electrodos de metal, ya que son innecesarias.
2. Añadir canales para servir como el Faraday Foso (Figura 1) que se ejecutan entre el sitio (s) picoinjection y la emulsión de aguas arriba de tal manera que sirvan para proteger las pequeñas gotas del campo eléctrico.
   Nota: Esto evita la fusión accidental.

2. Dispositivos Fabricar Uso Soft fotolitoTécnicas radiográficos

1. Generar una máscara de fotolitografía transparencia basado en el archivo CAD utilizando los servicios comerciales existentes.
2. Con la fotomáscara, curar fotoprotector en obleas de silicio para producir un dispositivo maestro, como se describió anteriormente ^4.
3. Pour PDMS mezcla con el agente endurecedor (11:1) sobre el maestro del equipo contenido en un 5 cm de poliestireno caja de Petri.
4. Coloque el principal con PDMS en un desecador de vacío durante aproximadamente 15 minutos para eliminar cualquier burbuja de aire.
5. Curar el dispositivo de PDMS colocándolo en un horno de 95 ° C durante 1 hora. Alternativamente, el PDMS curarán a TA después de 24 horas.
6. Retire el dispositivo de corte en todo el perímetro con una hoja de bisturí y pelar cuidadosamente el dispositivo desde el maestro.
7. Perforar orificios de entrada y salida en el PDMS usando un punzón de biopsia de 0,5 mm.
8. Una el dispositivo a un portaobjetos de microscopio de vidrio usando un dispositivo de unión de plasma ^4.

3. Preparar una presión de aireControl de bombas para presurizar un depósito que contiene el fluido

1. Modificar la salida de la bomba de tal manera que las salidas de aire a presión a través de una longitud de 2,7 mm de tubo de polietileno de diámetro interior.
2. Construirla de tal manera que el tubo termina en una punta de la jeringa luer-lock mediante el ajuste de la luz sobre el pezón en la parte posterior del luer-lock.
3. Sellar rellenando el espacio entre las roscas luer-lock y el tubo con epoxi.
4. Coloque una aguja 27,5 g.

4. Preparar una monodisperso Emulsión acuosa de las gotitas (agua-en-aceite) suspendidos en un aceite inerte fluorado portador con 2% (peso / peso) disuelto biocompatible Surfactante ⁷

Los reactivos específicos contenidos en estas gotitas dependen de la aplicación

1. En preparación para la reinyección, cargue la emulsión en una jeringa de 1 ml con una aguja de 27,5.
2. Fije la jeringa en una bomba de jeringa y orientar la bomba verticalmente (la aguja hacia arriba).
   Nota: Esta orientación hace que las gotas para empacar en una capa por encima del aceite del portador. Cuando se pone en marcha la bomba, las gotas serán empujados fuera de la jeringa en la fracción de alto volumen de la capa de aceite por debajo de ellos.

5. Preparar Reactivos para Introducción al chip de microfluidos

1. Perforar tres agujeros de 0,5 mm en la tapa de un tubo de centrífuga de 15 ml (cualquier recipiente con un tapón de rosca será suficiente) usando un punzón de biopsia, la aguja, o de perforación.
2. Insertar un diámetro de electrodo de alambre de 0,5 mm y una longitud de ~ 20 cm de PE-2 tubería a través de dos de los agujeros para que lleguen a la parte inferior del tubo.
3. En el agujero restante, hilo de ~ 2,5 cm de un cm de longitud ~ 20 de la tubería de PE de forma que éste descanse sobre el nivel del fluido.
4. Selle todos los espacios en la parte superior de la tapa con epoxi curado UV.
5. Llene el tubo con el líquido picoinjection y el tornillo de la tapa.
6. Conectar la salida de la bomba de control de presión de aire a la longitud más corta de la tubería por insertoing la aguja en el lumen. La aguja debe quedar ajustado.
7. Llene una jeringa de 1 ml con 1 M de NaCl para servir como la de Faraday Foso.
8. Conecte una aguja de 27,5 y asegure la jeringa en una bomba de jeringa.
9. Llene otra jeringa de 1 ml con aceite del portador / espaciador, conecte una aguja de 27,5, y fijarlo en una bomba de jeringa.

6. Prepare el dispositivo de microfluidos para Picoinjection

1. Conectar el tubo de salida (longitud más larga) desde el recipiente de fluido de inyección al puerto de entrada del fluido picoinjection en el chip microfluídico.
2. Conectar la jeringa que contiene el NaCl 1 M a la lumbrera de entrada para el Foso de Faraday en el chip de microfluidos con una longitud de tubo de PE.
3. Conectar la jeringa que contiene el aceite portador al puerto de entrada del chip de microfluidos con una longitud de tubo de PE.
4. Introduzca el tubo de PE en el orificio de salida de la emulsión en el chip microfluídico. El tubo debe terminar en un recipiente de recogida de emulsión, ninormalmente un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
5. Introduzca el tubo de PE en el puerto de salida para el Foso de Faraday en el chip microfluídico. El tubo debe terminar en un material no conductor y el recipiente aislado eléctricamente para evitar un cortocircuito.
6. Conectar la salida del amplificador de alta tensión (HV) a través de pinza de cocodrilo para el electrodo de metal sumergido en el fluido picoinjection.
7. Conectar el electrodo de tierra del amplificador de alta tensión a través de pinza de cocodrilo para el metal de la aguja de la jeringa que contiene el NaCl 1 M.

7. Infuse Reactivos en microfluidos chip

1. Introducir el NaCl 1 M (Foso de Faraday) para el dispositivo a una velocidad de 100 l / hr.
2. Introducir la emulsión de gotas de aceite del portador y con tasas adecuadas a las dimensiones del dispositivo. Para nuestro equipo de demostración, introducimos las gotas y el aceite a 200 y 400 l / h, respectivamente. Los caudales deben permitir que las gotas pasen la picoinjector a intervalos regulares separadospor un hueco de aceite portador.
3. Ajustar la presión aplicada al fluido picoinjection de tal manera que la presión del fluido en el orificio de picoinjection está en equilibrio mecánico con el canal de gota.
   Nota: En esta presión (la presión de Laplace), el fluido de inyección debe sobresalir en el canal de gotita sin gemación y la formación de sus propias gotas (Figura 2). A estas velocidades de flujo descritos anteriormente, se aplica una presión de ~ 13 psi para el fluido de inyección para alcanzar el equilibrio en el sitio de la inyección.

8. Comience Picoinjection

1. Como gotas de pasar el orificio de inyección, aplique un 0-10 V, 10 kHz, la señal amplificada AC 1000 x por el amplificador de HV (Figura 3).
2. Modular el volumen de inyección cambiando la amplitud de la tensión aplicada.
   Nota: Los voltajes más altos deberían permitir más fluido que se presentó a las gotas. En nuestras pruebas, observamos inyección estable y consistente con tensiones serentre 100 y 3000 V utilizando soluciones de inyección de NaCl que van desde 10 hasta 500 mM (Figura 4).

Resultados

Imágenes microscópicas tomadas en el lugar muestran picoinjection que la electrificación del fluido picoinjection es suficiente para desencadenar la inyección (Figura 2). El volumen inyectado se puede controlar mediante la modulación de la amplitud de la tensión aplicada, con tensiones más elevadas que permiten volúmenes de inyección más altas. Trazamos el volumen de inyección en comparación con la magnitud de la tensión aplicada durante tres molaridades representativas de fluido de inyecci...

Discusión

La relación entre el volumen de inyección y la tensión aplicada depende de muchos factores incluyendo las dimensiones del dispositivo, la longitud del tubo que lleva el fluido picoinjection al dispositivo, molaridad de fluido picoinjection, y la velocidad de las gotitas a medida que pasan que inyector. Por este motivo, se recomienda que la relación volumen / tensión caracterizarse antes de cada ejecución de picoinjection midiendo volúmenes de inyección en los bordes de los rangos de trabajo de la tensión y la m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions