Picoinjection של Microfluidic טיפות בלי אלקטרודות מתכת

Summary

פיתחנו טכניקה לpicoinjecting טיפות microfluidic שאינו דורשות אלקטרודות מתכת. ככזה, מכשירים המשלבים הטכניקה שלנו הם פשוט כדי להמציא ולהשתמש.

Abstract

שיטות קיימות לpicoinjecting ריאגנטים לטיפי microfluidic דורשות אלקטרודות מתכת משולבות בשבב microfluidic. השילוב של אלקטרודות אלה מוסיף צעדים מסורבלים ומועדת לטעויות לתהליך ייצור מכשיר. אנחנו פיתחנו שיטה שמייתרת את הצרכים עבור אלקטרודות מתכת במהלך picoinjection. במקום זאת, היא משתמשת בנוזל להזרקה עצמה כאלקטרודה, מכיוון שרוב חומרים כימיים ביולוגיים מכילים אלקטרוליטים מומסים ומוליכים. על ידי ביטול את האלקטרודות, אנו להפחית את זמן ייצור מכשיר ומורכב, ולהפוך את המכשירים חזקים יותר. בנוסף, עם הגישה שלנו, את עוצמת הזריקה תלויה במתח להחיל את פתרון picoinjection; זה מאפשר לנו להתאים את עוצמת הקול שהוחדר על ידי ויסות המתח להחיל במהירות. אנו מראים כי הטכניקה שלנו היא בקנה אחד עם חומרים כימיים בשילוב תרכובות ביולוגיות משותפות, כוללים כריות, אנזימים, וחומצות גרעין.

Introduction

במיקרופלואידיקה מבוסס אגל, טיפות מימיות מיקרון בקנה המידה משמשות כ" מבחנות "לתגובות ביולוגיות. היתרון לביצוע תגובות בטיפין הזעירות הוא שכל טיפה משתמשת רק כמה pl של מגיב ו, עם מיקרופלואידיקה, יכולות להיווצר הטיפות ומעובד בשיעורי kilohertz ^1. בשילוב, מאפיינים אלה מאפשרים למ' תגובות עם תאים בודדים, מולקולות חומצות גרעין, או תרכובות שיש לבצע בעניין של דקות עם μl של חומר בסך הכל.

כדי להשתמש בטיפין ליישומים כמו אלה, טכניקות דרושות להוספת כמויות מבוקרות של חומרים כימיים לטיפין; פעולות כאלה הם מקבילים pipetting לתוך מבחנות. שיטה אחת לביצוע הזה היא electrocoalescence, שבו ירידה של מגיב ממוזגת עם טיפת המטרה על ידי החלת שדה חשמלי. השדה החשמלי משבש את הסדר של מולקולות פעילי שטח בממשקים של הטיפות, inducing חוסר יציבות סרט דק ומפעיל גיבוש בתחליבים כי הם יציבים ² בדרך אחרת. מיזוג חשמלי מושרה הוא גם ניצל בעיצוב של picoinjector, מכשיר שמזריק חומרים כימיים לטיפין שהם זורמים בעבר בערוץ ³ בלחץ. כדי להחיל את השדה החשמלי, מכשירי picoinjector לנצל אלקטרודות מתכת, אבל שילוב של אלקטרודות מתכת לתוך שבבי microfluidic הוא לעתים קרובות תהליך מורכב ומועדת לטעויות כמו חוטי נוזל ההלחמה נמצאים בסכנה בקלות על ידי בועות אוויר או אבק ופסולת אחרת בערוץ , כמו גם שברים מלחץ או כיפוף במהלך התקנת התקן.

כאן אנו מציגים שיטה לביצוע picoinjection ללא השימוש באלקטרודות מתכת, מה שהופך את הייצור פשוטים יותר וחזק יותר. כדי לעורר picoinjection, אנחנו במקום להשתמש בנוזל להזרקה עצמה כאלקטרודה, מכיוון שרוב חומרים כימיים ביולוגיים מכילים אלקטרוליטים מומסים ומוליכים. אנחנו גם להוסיף "פאראדיי מואהלא "כדי להגן על אזורים רגישים של המכשיר ולפעול כקרקע אוניברסלית (איור 1). החפיר חשמלי מבודד את הטיפות במעלה הזרם של אתר picoinjection על ידי מתן קרקע, מניעת מיזוג טיפה לא מכוון. יתרון נוסף של השיטה שלנו הוא ש נפח שהוחדר לתוך הטיפות תלויה בגודלו של המתח להחיל, שמאפשר לו להיות מותאמים על ידי כוונון האות מיושמת.

אנחנו לפברק המכשירים שלנו בפולי (dimethylsiloxane) (PDMS) תוך שימוש בטכניקות photolithographic רכים ^4,5. הגישה שלנו היא בקנה אחד עם ההתקנים מפוברק בחומרים אחרים, כמו רפים, פלסטיק, ואפוקסי. יש הערוצים לגבהים ורוחב של 30 מיקרומטר, שהם אופטימליים לעבודה עם טיפות 50 מיקרומטר בקוטר (65 pl). אנחנו מציגים את חומרים כימיים דרך צינורות polyethelene (0.3/1.09 מ"מ קוטר חיצוני / פנימי) מוכנסים לתוך יציאות שנוצרו במהלך ייצור מכשיר עם 0.50 מ"מ אגרופים ביופסיה, בדומה לשיטות described בעבר ^5. האיפור של נוזל ההזרקה המדויק תלוי ביישום הספציפי. הנוזל צריך להכיל רק אלקטרוליטים מומסים בריכוזים גבוהים מספיק כדי להניב מוליכות מספיק לאות החשמלי שמועבר לpicoinjector. בבדיקת ספסל, מצאנו כי ריכוזים יוניים גדולים מ10 מ"מ צריכים להספיק ^6, אם כי ערך זה ומוליכות נוזל תלויות בממדי המכשיר הספציפיים ובהיקף של המתח המופעל.

Protocol

1. מימדי עיצוב מכשיר וטופולוגיות בהתבסס על ניסיוני צרכי השימוש בתכנון בעזרת מחשב (CAD) תוכנה

הערה: קטרי ערוץ תחליב בחרו קטנים יותר מאלה של הטיפות כדוריות. זה מאלץ את הטיפות לתוך גלילי או צורה "נקניק" ומאפשר לpicoinjection יעיל יותר. למטרות שלנו, עיצבנו 30 x 30 מיקרומטר ערוצים לטיפין שהיו 50 מיקרומטר קוטר.

1. אתר מודל picoinjection (ים) אחרי אלה שתוארו על ידי אבטה et al. ³ עם החריג שהערוצים לאלקטרודות המתכת מוסרים, כפי שהם מיותרים.
2. הוספת ערוצים לשמש כחפיר פאראדיי (איור 1) הפועלים בין אתר picoinjection (ים) והתחליב נגד הזרם כזה שהם להגן על הטיפות מהשדה החשמלי.
   שים לב: זה מונע מיזוג בלתי צפויה.

2. התקנים לפברק באמצעות רך Photolithטכניקות ographic

1. ליצור מסכת photolithography שקיפות מבוססת על קובץ CAD באמצעות שירותים מסחריים קיימים.
2. עם photomask, לרפא photoresist על פרוסות סיליקון לייצר אדון מכשיר, כפי שתואר לעיל ^4.
3. יוצקים PDMS מעורבב עם סוכן ריפוי (11:1 יחס) על מאסטר המכשיר כלול בצלחת פטרי קלקר 5 סנטימטר.
4. הנח את ההורים עם PDMS בייבוש ואקום בערך 15 דקות כדי להסיר כל בועות אוויר.
5. לרפא את מכשיר PDMS על ידי הצבתו בתנור 95 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. לחלופין, PDMS ירפא ב RT אחרי 24 שעות.
6. הסר את ההתקן על ידי חיתוך סביב ההיקף עם להב כירורגים ומתקלפים המכשיר מן האדון בזהירות.
7. אגרוף כניסה ויציאת חורים לתוך PDMS באמצעות אגרוף ביופסיה 0.5 מ"מ.
8. אג"ח המכשיר לשקופית הזכוכית מיקרוסקופ באמצעות ונדר פלזמה ^4.

3. הכן את לחץ אווירמשאבת בקרה לחצי מאגר המכיל נוזלים

1. שנה את תפוקת המשאבה כך שיציאות אוויר דחוסים דרך באורך של 2.7 מ"מ צינורות פוליאתילן בקוטר פנימי.
2. לבנות אותו כך שהצינור מסתיים בקצה מזרק luer נעילה על ידי התאמת לומן על הפטמה בחלקו האחורי של luer נעילה.
3. לאטום על ידי מילוי החלל שבין אשכולות luer נעילה והצינורות עם אפוקסי.
4. צרף מחט 27.5 G.

4. הכן אמולסיה Monodisperse של מימיות טיפות (מים בשמן) מושעה בשמן נשא Fluorinated אינרטי עם 2% (wt / wt) מומסת ביולוגית ⁷ פעילי שטח

חומרים כימיים מסוימים הכלולים בטיפין אלה תלויים ביישום

1. כהכנה לreinjection, טען את התחליב לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט G 27.5.
2. אבטח את המזרק במשאבת מזרק ולכוון את המשאבה בצורה אנכית (מחט כלפי מעלה).
   פתק: נטייה זו גורמת לטיפין לארוז בשכבה מעל השמן נשא. כאשר המשאבה הוא התחילה, הטיפות יהיו דחף מהמזרק בכל חלק בנפח גבוה על ידי שכבת הנפט מתחתיהם.

5. הכן ריאגנטים למבוא לשבב microfluidic

1. אגרוף שלושה חורים 0.5 מ"מ לתוך הכובע של צינור צנטריפוגות 15 מיליליטר (כל מיכל עם מכסה בורג יספיק) באמצעות ביופסיה, מחט, או מקדחה.
2. הכנס האלקטרודה 0.5 מ"מ קוטר תיל ואורך סנטימטר ~ 20 של PE-2 צינורות באמצעות שני החורים כך שהם מגיעים לתחתית של תחתית.
3. בחור שנותר, חוט ~ 2.5 סנטימטר באורך סנטימטר ~ 20 של צינורות PE כזה שהוא ינוח מעל למפלס הנוזל.
4. לאטום כל פערים בחלק העליון של הכובע עם אפוקסי נרפא-UV.
5. מלא את הצינור עם נוזל picoinjection וברגים בכובע.
6. חברו את היציאה ממשאבת האוויר ובקרת לחץ לאורך הקצר של צינורות על ידי הוספהing את המחט לתוך לומן. המחט צריכה להתאים בנוחות.
7. ממלאי מזרק 1 מיליליטר עם 1 M NaCl לשמש כחפיר פאראדיי.
8. חבר מחט G 27.5 ולאבטח את המזרק במשאבת מזרק.
9. מלא עוד מזרק 1 מיליליטר עם השמן נשא / spacer, להתחבר מחט G 27.5, ולאבטח אותו במשאבת מזרק.

6. הכן את מכשיר microfluidic לPicoinjection

1. חבר את צינורות פלט (אורך זמן רב יותר) מיכל הזרקת הנוזל לנמל הכניסה של נוזל picoinjection על שבב microfluidic.
2. חבר את המזרק המכיל את M NaCl 1 לנמל הכניסה לחפיר פאראדיי על שבב microfluidic עם אורך של צינור PE.
3. חבר את המזרק המכיל את השמן נשא לנמל הכניסה של שבב microfluidic עם אורך של צינור PE.
4. הכנס צינור PE ליציאה לשקע תחליב על שבב microfluidic. צינורות צריכים לסיים בכלי אוסף אמולסיה, ולאמלי צינור צנטריפוגות 1.5 מיליליטר.
5. הכנס צינור PE ליציאת הפורקן לחפיר פאראדיי על שבב microfluidic. צינורות צריכים לסיים שבאינם מנהלים ומכל חשמליים מבודד כדי למנוע קצר חשמלי.
6. חברו את היציאה של מגבר מתח גבוה (HV) באמצעות קליפ תנין למתכת האלקטרודה שקועה בנוזל picoinjection.
7. חבר את האלקטרודה הקרקע של מגבר HV באמצעות קליפ תנין למתכת של מחט המזרק המכילה את M NaCl 1.

7. להשרות ריאגנטים לתוך השבב microfluidic

1. להציג את M NaCl 1 (פאראדיי החפיר) למכשיר בשיעור של 100 μl / שעה.
2. להציג את תחליב אגל ושמן נשא במחירים מתאימים למידות המכשיר. למכשיר ההדגמה שלנו, אנחנו מציגים את הטיפות ונפט ב200 ו400 μl / שעה, בהתאמה. ספיקות צריכה לאפשר הטיפות לעבור picoinjector במרווחים זמן קבוע המופרדיםעל ידי פער של שמן נשא.
3. התאם את הלחץ המופעל על נוזל picoinjection כך שלחץ הנוזל בפתח picoinjection נמצא בשיווי משקל מכאני עם ערוץ רביב.
   הערה: בלחץ הזה (לחץ Laplace), נוזל ההזרקה צריך לבלוט לתוך תעלת אגל בלי ניצנים ומיוצרים טיפות משלו (איור 2). בספיקות אלה שתוארו לעיל, אנו מיישמים את לחץ של ~ 13 psi לנוזל ההזרקה כדי להשיג שיווי משקל באזור הזריקה.

8. בגין Picoinjection

1. כמו טיפות עוברות את פתח ההזרקה, להחיל 0-10 V, 10 kHz, אות AC מוגבר 1,000 x על ידי HV-המגבר (איור 3).
2. לווסת את עוצמת הזריקה על ידי שינוי את המשרעת של המתח המופעל.
   הערה: מתח גבוה צריך לאפשר לנוזל יותר להיות הציג לטיפין. בבדיקה שלנו, שאנו רואים זריקה יציבה ועקבית במתח להיותtween 100 ו3,000 V משתמש בפתרוני הזרקה של NaCl החל 10-500 מ"מ (איור 4).

תוצאות

תמונות מיקרוסקופיות שנלקחו בתערוכת אתר picoinjection שחשמול של נוזל picoinjection הוא מספיק כדי לעורר הזרקה (איור 2). הנפח המוזרק יכול להיות נשלט על ידי ויסות המשרעת של המתח להחיל, עם מתחים גבוהים יותר ומאפשרים לכרכי הזרקה גבוהים יותר. אנו נצייר את עוצמת הזריקה לעומת סדר ?...

Discussion

הקשר בין נפח הזרקה ומתח להחיל תלוי בגורמים רבים, כולל מידות מכשיר, אורכו של הצינור שנשא את נוזל picoinjection למכשיר, molarity של picoinjection נוזלים, ואת המהירות של הטיפות כשהם עוברים הם מזרק. מסיבה זו אנו ממליצים כי יחסי נפח / מתח להתאפיין לפני כל ריצה של picoinjection על ידי מדידת נפחי הזר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions