Picoinjection de microfluidique Drops Sans électrodes métalliques

Résumé

Nous avons mis au point une technique pour picoinjecting gouttes microfluidiques qui ne nécessite pas des électrodes métalliques. En tant que tel, les dispositifs incorporant notre technique sont plus simples à fabriquer et à utiliser.

Résumé

Les méthodes existantes pour picoinjecting réactifs en gouttes microfluidiques nécessitent des électrodes métalliques intégrés dans la puce microfluidique. L'intégration de ces électrodes ajoute des étapes fastidieuses et sources d'erreurs dans le processus de fabrication de l'appareil. Nous avons développé une technique qui évite les besoins des électrodes métalliques pendant picoinjection. Au lieu de cela, il utilise le fluide d'injection elle-même comme une électrode, étant donné que la plupart des réactifs biologiques contiennent des électrolytes dissous et sont conductrices. En éliminant les électrodes, nous réduisons dispositif le temps de fabrication et de la complexité, et faisons les dispositifs plus robuste. En outre, notre approche, le volume d'injection dépend de la tension appliquée à la solution de picoinjection; ce qui nous permet d'ajuster rapidement le volume injecté par modulation de la tension appliquée. Nous démontrons que notre technique est compatible avec des réactifs comportant des composés biologiques courants, y compris des tampons, des enzymes et des acides nucléiques.

Introduction

Dans la microfluidique à base de gouttelettes, gouttelettes aqueuses l'échelle du micron sont utilisés comme "tubes à essai" pour des réactions biologiques. L'avantage de réaliser des réactions dans les minuscules gouttelettes est que chaque goutte utilise seulement quelques pl de réactif et, avec la microfluidique, les gouttes peut être formée et traitée à taux de kilohertz ^1. Ces propriétés combinées, permettent des millions de réactions avec des cellules individuelles, des molécules d'acide nucléique, ou des composés à accomplir en quelques minutes avec ul de matière totale.

Pour utiliser des gouttes pour les applications comme celles-ci, les techniques sont nécessaires pour l'ajout de volumes contrôlés de réactifs pour les gouttes; ces opérations sont analogues à pipetage dans des tubes à essai. Un procédé pour réaliser ceci est électrocoalescence, dans lequel une goutte de réactif est fusionné avec la chute de cible en appliquant un champ électrique. Le champ électrique perturbe l'agencement des molécules de tensioactif sur les interfaces des gouttes, inducing une instabilité à film mince et le déclenchement coalescence des émulsions qui sont par ailleurs stable ^2. Fusion induite électriquement est également exploité dans la conception de la picoinjector, un appareil qui injecte des réactifs en gouttes lorsqu'ils s'écoulent dernier d'un canal sous pression ^3. Pour appliquer le champ électrique, les dispositifs de picoinjector utilisent des électrodes métalliques, mais l'intégration d'électrodes métalliques en puces microfluidiques est souvent un processus complexe et source d'erreurs que les fils liquide-soudure sont facilement compromis par des bulles d'air ou de la poussière et d'autres débris dans le canal , ainsi que des fractures de stress ou de flexion lors de l'installation de l'appareil.

Ici, nous présentons une méthode pour effectuer picoinjection sans l'utilisation d'électrodes en métal, ce qui rend la fabrication plus simple et plus robuste. Pour déclencher picoinjection, on utilise à la place du fluide d'injection elle-même comme une électrode, étant donné que la plupart des réactifs biologiques contiennent des électrolytes dissous et sont conductrices. Nous ajoutons également un "Faraday Moat "pour protéger les régions sensibles de l'appareil et d'agir comme un terrain universel (Figure 1). Le fossé isole électriquement les gouttelettes en amont du site de picoinjection en fournissant un terrain, empêchant involontaire gouttelettes fusion. Un avantage supplémentaire de notre technique est que le volume injecté dans les gouttes dépend de l'amplitude de la tension appliquée, ce qui lui permet d'être ajusté en réglant le signal appliqué.

Nous fabriquons nos appareils dans le poly (diméthyl) (PDMS) en utilisant des techniques de photolithographie douces ^4,5. Notre approche est compatible avec les appareils fabriqués dans d'autres matériaux, comme des résines, des matières plastiques et des résines époxy. Les canaux ont des hauteurs et des largeurs de 30 um, qui sont optimales pour travailler avec des gouttelettes de 50 um de diamètre (65 pl). Nous introduisons réactifs via un tube en polyéthylène (0.3/1.09 mm de diamètre intérieur / extérieur) inséré dans les ports créées pendant la fabrication de l'appareil avec 0,50 mm de poinçons de biopsie, semblables à des méthodes described auparavant ^5. La composition exacte du fluide d'injection dépend de l'application spécifique. Le fluide doit seulement contenir des électrolytes dissous à des concentrations suffisamment élevées pour obtenir une conductivité suffisante pour le signal électrique devant être transmis à la picoinjector. Dans les essais au banc, nous avons trouvé que les concentrations ioniques supérieures à 10 mM ⁶ devraient suffire, bien que cette valeur de conductivité du fluide, et dépendent des dimensions de périphériques spécifiques et amplitude de la tension appliquée.

Protocole

1. Conception Dimensions de l'appareil et de topologies Basé sur Experimental besoins à l'aide Conception Assistée par Ordinateur (CAO)

Remarque: Sélection des diamètres de canaux d'émulsion plus petites que celles des gouttelettes sphériques. Cela force les gouttelettes en une forme "saucisse" ou cylindrique et permet picoinjection plus efficace. Pour nos besoins, nous avons conçu 30 x 30 um canaux de gouttelettes qui étaient de 50 m de diamètre.

1. picoinjection site de modèle (s) après ceux décrits par Abate et al. ³ à l'exception que les canaux pour les électrodes métalliques sont éliminés, car ils ne sont pas nécessaires.
2. Ajouter des canaux à servir de Faraday Moat (figure 1) qui fonctionnent entre les site (s) de picoinjection et l'émulsion en amont de telle sorte qu'ils protègent les gouttelettes à partir du champ électrique.
   Note: Ceci empêche la fusion involontaire.

2. Dispositifs Fabriquer Utilisation souple de photolithographieTechniques ographiques

1. Générer un masque de transparence de photolithographie sur la base du fichier CAO en utilisant les services commerciaux existants.
2. Avec le photomasque, guérir résine photosensible sur des tranches de silicium pour produire une base de l'appareil, comme décrit précédemment ^4.
3. Verser PDMS mélangé avec l'agent de durcissement (rapport 11:01) sur la base de l'appareil contenue dans une boîte de Petri de 5 cm de polystyrène.
4. Placez le maître avec PDMS dans un dessiccateur à vide pendant environ 15 minutes pour éliminer les bulles d'air.
5. Guérir le dispositif PDMS en le plaçant dans un four à 95 ° C pendant 1 heure. Alternativement, les PDMS durcissent à température ambiante après 24 h.
6. Retirer le périphérique en coupant autour du périmètre avec une lame chirurgicale et éplucher soigneusement l'appareil du maître.
7. Percez entrée et de sortie des trous dans les PDMS en utilisant une biopsie poinçon de 0,5 mm.
8. Lier l'appareil à une lame de microscope en verre à l'aide d'une colle de plasma ^4.

3. Préparer une pression d'airPompe de contrôle pour pressuriser un réservoir contenant le fluide

1. Modifier le débit de la pompe de telle sorte que les sorties d'air sous pression à travers une longueur de 2,7 mm de diamètre intérieur des tubes en polyethylene.
2. Construire de sorte que le tube se termine à une extrémité de la seringue Luer-Lok par ajustement de la lumière au-dessus de l'embout à l'arrière de l'ajustement luer-lock.
3. Sceller en remplissant l'espace entre les filets de Luer-lock et le tube avec de l'époxy.
4. Fixez une aiguille de 27,5 G.

4. Préparer une émulsion monodisperse de aqueuse Les gouttelettes (eau-dans-huile) en suspension dans une huile fluorée support inerte avec 2% (poids / poids) dissous biocompatible tensioactif ⁷

Les réactifs spécifiques contenues dans ces gouttelettes dépend de l'application

1. En préparation pour la réinjection, charger l'émulsion dans une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27,5 G.
2. Fixez la seringue dans une pompe à seringue et orienter la pompe à la verticale (vers le haut aiguille).
   RemarqueCette orientation amène les gouttelettes à emballer dans une couche au-dessus de l'huile support. Lorsque la pompe est démarré, les gouttelettes sont expulsées de la seringue à haute fraction volumique de la couche d'huile sous eux.

5. Préparer les réactifs pour l'introduction de la puce microfluidique

1. Poinçon trois trous de 0,5 mm dans le bouchon d'un tube à centrifuger de 15 ml (tout récipient muni d'un bouchon à vis suffira) en utilisant un poinçon de biopsie, à aiguilles, ou une perceuse.
2. Insérer une électrode en fil de diamètre 0,5 mm et une longueur de ~ 20 cm de PE-2 tubes à travers deux des trous de sorte qu'elles atteignent le fond du tube.
3. Dans le trou restant, un fil ~ 2,5 cm de longueur d'un cm ~ 20 de PE tube de telle sorte qu'il sera de repos au-dessus du niveau du liquide.
4. Sceller toutes les lacunes sur le dessus du bouchon avec de l'époxy UV-durci.
5. Remplir le tube avec le liquide de picoinjection et la vis sur le capuchon.
6. Connectez la sortie de la pompe de commande à pression d'air à la longueur plus courte de tubes par insertionment l'aiguille dans la lumière. L'aiguille doit être bien ajusté.
7. Remplir une seringue de 1 ml avec du NaCl 1 M à servir de Faraday Moat.
8. Connectez une aiguille de 27,5 G et fixez la seringue dans une pompe à seringue.
9. Remplir un autre seringue de 1 ml avec support / entretoise huile, connectez une aiguille de 27,5 G, et le fixer dans une pompe à seringue.

6. Préparer le dispositif microfluidique pour Picoinjection

1. Raccorder le tuyau de sortie (plus de longueur) à partir du conteneur de fluide d'injection à l'orifice d'entrée du fluide de picoinjection sur la puce microfluidique.
2. Raccorder la seringue contenant la 1 M de NaCl à l'orifice d'entrée pour le Faraday Moat sur la puce microfluidique avec une longueur de tube PE.
3. Raccorder la seringue contenant l'huile support à l'orifice d'entrée de la puce microfluidique avec une longueur de tube PE.
4. Insérer un tube de PE dans l'orifice de sortie de l'émulsion sur la puce microfluidique. La tubulure doit se terminer par un récipient de collecte de l'émulsion, nilement un tube de centrifugation de 1,5 ml.
5. Insérer un tube de PE dans l'orifice de sortie pour le Faraday Moat sur la puce microfluidique. La tubulure doit se terminer en un matériau non conducteur électrique et le récipient isolé électriquement pour éviter un court-circuit.
6. Connectez la sortie de l'amplificateur haute tension (HT) par pince crocodile à l'électrode métallique immergée dans le liquide de picoinjection.
7. Raccorder la chaîne de l'amplificateur de haute tension à la terre par l'intermédiaire d'une pince crocodile pour le métal de l'aiguille de la seringue contenant la 1 M de NaCl.

7. Infuse réactifs en microfluidique Chip

1. Introduire le 1 M de NaCl (Faraday Moat) à l'appareil à une vitesse de 100 pi / h.
2. Introduire l'émulsion de gouttelettes et de l'huile de support à des taux appropriés pour les dimensions de l'appareil. Pour notre dispositif de démonstration, nous présentons les gouttes et de l'huile à 200 et 400 l / h, respectivement. Les débits doivent permettre aux gouttelettes de passer à la picoinjector à des intervalles réguliers séparéspar un intervalle d'huile de support.
3. Ajuster la pression appliquée sur le fluide de picoinjection telle que la pression de fluide à l'orifice de picoinjection est en équilibre mécanique avec le canal de gouttelettes.
   Remarque: A cette pression (la pression de Laplace), le fluide d'injection devrait saillie dans le canal de gouttelettes sans bourgeonnement et former ses propres gouttes (Figure 2). A ces vitesses d'écoulement décrits ci-dessus, on applique une pression de 13 psi ~ au fluide d'injection d'atteindre l'équilibre au niveau du site d'injection.

8. Commencez Picoinjection

1. Sous forme de gouttelettes passent l'orifice d'injection, appliquer un 0-10 V, 10 kHz, signal alternatif amplifié 1000 x par le HV-amplificateur (Figure 3).
2. Moduler le volume d'injection en modifiant l'amplitude de la tension appliquée.
   Remarque: Des tensions plus élevées devraient permettre plus fluide à introduire les gouttelettes. Lors de nos tests, nous observons injection stable et cohérente à des tensions êtreentre 100 et 3000 V en utilisant des solutions d'injection de NaCl allant de 10 à 500 mM (Figure 4).

Résultats

Les images microscopiques prises sur le site de picoinjection montrent que l'électrification du fluide picoinjection suffit à déclencher l'injection (figure 2). Le volume injecté peut être commandée par la modulation de l'amplitude de la tension appliquée, avec des tensions plus élevées permettant des volumes d'injection plus élevées. On trace le volume d'injection par rapport à l'amplitude de la tension appliquée pendant trois molarités représentatifs de fluide d&...

Discussion

La relation entre le volume d'injection et la tension appliquée dépend de nombreux facteurs, notamment des dimensions de l'appareil, la longueur de la tuyauterie transportant le fluide de picoinjection au dispositif, la molarité de fluide de picoinjection, et la vitesse des gouttelettes lors de leur passage, ils injecteur. Pour cette raison, nous recommandons que la relation entre le volume / tension se caractérise avant chaque exécution de picoinjection en mesurant les volumes d'injection sur les bords...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions