Picoinjection von Mikrofluidik-Tropfen ohne Metall-Elektroden

Zusammenfassung

Wir haben eine Technik für picoinjecting Mikrofluidik-Tropfen, die Metallelektroden nicht auskommt. Als solche Vorrichtungen, die unsere Technik sind einfacher herzustellen und zu verwenden.

Zusammenfassung

Bestehende Verfahren zur picoinjecting Reagenzien in mikrofluidischen Tropfen erfordern in der mikrofluidischen Chip integrierten Metallelektroden. Die Integration dieser Elektroden fügt umständliche und fehleranfällige Schritte zum Komponenten-Herstellungsverfahren. Wir haben eine Technik entwickelt, die die Anforderungen für die Metallelektroden während picoinjection vermeidet entwickelt. Stattdessen wird die Injektionsflüssigkeit selbst als Elektrode, da die meisten biologischen Reagenzien enthalten gelöste Elektrolyte und leitend sind. Durch die Beseitigung der Elektroden reduzieren wir Gerät Herstellungszeit und Komplexität, und machen die Geräte robuster. Zusätzlich zu unserem Ansatz hängt die Einspritzvolumen auf, das mit dem picoinjection Lösung angelegt wird; dies ermöglicht es, die durch die Modulation der angelegten Spannung injizierte Volumen schnell einzustellen. Wir zeigen, dass unser Verfahren mit Reagenzien wie gemeinsame biologische Verbindungen, einschließlich Puffer, Enzyme und Nukleinsäuren kompatibel.

Einleitung

In tröpfchenbasierte Mikrofluidik, Mikrometermaßstab sind Wassertröpfchen als "Reagenzglas" für biologische Reaktionen verwendet. Der Vorteil für die Durchführung von Reaktionen in den winzigen Tröpfchen ist, dass jeder Tropfen verwendet nur wenige pl von Reagenz und mit Mikrofluidik, können die Tropfen geformt und bei ¹ Kilohertz Raten verarbeitet werden. Durch Kombination dieser Eigenschaften können Millionen von Reaktionen mit einzelnen Zellen, Nukleinsäuremoleküle oder Verbindungen, die in wenigen Minuten mit ul Gesamtmaterials durchgeführt werden.

Tropfen für Anwendungen wie diese verwenden, sind Techniken für das Hinzufügen kontrollierter Mengen von Reagenzien zu den Tropfen erforderlich ist; solche Operationen sind analog den in Teströhrchen pipettiert. Ein Verfahren, um dies zu erreichen ist Elektrokoaleszenz, wobei ein Tropfen des Reagenz mit dem Ziel Tropfen durch Anlegen eines elektrischen Feldes fusioniert. Das elektrische Feld stört die Anordnung der Tensidmoleküle an den Schnittstellen der Tropfen, inducing einen Dünnfilm-Instabilität und Auslösen Koaleszenz in Emulsionen, die sonst stabile ² sind. Elektrisch induzierten Fusion ist ebenfalls in der Gestaltung des picoinjector, eine Vorrichtung, die Reagenzien in Tropfen spritzt, als sie an einem unter Druck stehenden Strömungskanal ³ ausgenutzt. Um das elektrische Feld gelten, picoinjector Geräte nutzen Metallelektroden, sondern die Integration von Metallelektroden in Mikrofluidik-Chips ist oft ein komplexer und fehleranfälliger Prozess, wie die Flüssig-Lote werden leicht durch Luftblasen oder Staub und andere Ablagerungen im Kanal beeinträchtigt sowie Frakturen von Stress oder während der Geräte-Setup Biegen.

Hier stellen wir ein Verfahren zur picoinjection ohne die Verwendung von Metallelektroden führen, wodurch die Herstellung einfacher und robuster. Um picoinjection auslösen, wir verwenden stattdessen die Injektionsflüssigkeit selbst als Elektrode, da die meisten biologischen Reagenzien enthalten gelösten Elektrolyten und leitend sind. Wir haben auch eine "Faraday Moa hinzufügent ", um sensible Bereiche der Vorrichtung und als universelle Boden (1) abzuschirmen. Der Graben elektrisch isoliert die Tröpfchen stromaufwärts des picoinjection Website durch einen Boden und verhindert unbeabsichtigte Tröpfchen Fusion. Ein zusätzlicher Vorteil der Technik ist, dass der Menge in den Tropfen eingespritzten hängt von der Größe der angelegten Spannung, so dass sie durch Einstellen des angelegten Signals eingestellt werden.

Wir fertigen unsere Geräte in Poly (dimethylsiloxan) (PDMS) mit weichen Photolithographietechniken ^4,5. Unser Ansatz ist mit Geräten in anderen Materialien hergestellt kompatibel, wie Harzen, Kunststoffen und Epoxidharzen. Die Kanäle weisen Höhen und Breiten von 30 um, die optimal für die Arbeit mit Tröpfchen 50 um Durchmesser (65 pl) sind. Wir stellen Reagenzien über Polyethylen-Schlauch (0.3/1.09 mm inneren / äußeren Durchmesser) in den Häfen während der Herstellung der Vorrichtung geschaffen mit 0,50 mm Biopsieausstanzungen, ähnlich descr Methoden eingesetztibed zuvor ^5. Der genaue Aufbau der Einspritzfluid ist abhängig von der spezifischen Anwendung. Das Fluid braucht nur gelösten Elektrolyten in Konzentrationen, die hoch genug, um eine ausreichende Leitfähigkeit für das elektrische Signal an die picoinjector übertragen werden erhalten. In Laborversuchen wurde gefunden, dass die Ionenkonzentrationen größer als 10 mm sollte ausreichen ^6, wenn dieser Wert und die Fluidleitfähigkeit auf den spezifischen Geräteabmessungen und Größe der angelegten Spannung abhängen.

Protokoll

1. Aufbau Geräte Maße und Topologien Basierend auf experimentellen Anforderungen Computer Aided Design (CAD) Software

Hinweis: Wählen Emulsion Kanaldurchmesser kleiner als die der kugelförmigen Tropfen. Dies zwingt die Tröpfchen in eine zylindrische oder "Wurst"-Form und eine effektivere picoinjection. Für unsere Zwecke, haben wir 30 x 30 um Kanäle für Tröpfchen, 50 um im Durchmesser waren.

1. Modell picoinjection Stelle (n), nachdem die von Abate et al. ³ mit der Ausnahme, daß die Kanäle für den Metallelektroden entfernt werden, da sie unnötig sind beschrieben.
2. Kanäle hinzufügen, die als Faraday Moat (Abbildung 1), die zwischen picoinjection Website (s) und der stromaufwärts gelegenen Emulsion, so dass sie die Tropfen aus dem elektrischen Feld abschirmen laufen zu dienen.
   Hinweis: Dieser verhindert ein unbeabsichtigtes Zusammenführung.

2. Fabrizieren Geräte mit Soft-Photolithographieographic Techniken

1. Generieren Sie eine Transparenz Photolithographiemaske auf der Basis der CAD-Datei mit bestehenden kommerziellen Dienstleistungen.
2. Mit der Photomaske, heilen Photolack auf Silizium-Wafern, ein Gerät Master zu erzeugen, wie zuvor ⁴ beschrieben.
3. Gießen PDMS gemischt mit Härter (11.01-Verhältnis) über das Gerät Master in einem 5 cm Petrischale aus Polystyrol enthalten.
4. Setzen Sie den Master mit PDMS im Vakuumtrockenschrank für etwa 15 Minuten, um Luftblasen zu entfernen.
5. Cure die PDMS-Gerät, indem Sie es in einer 95 ° C-Ofen für 1 Stunde. Alternativ werden die PDMS bei RT nach 24 Stunden aushärten.
6. Entfernen Sie das Gerät, indem um den Umfang mit einem chirurgischen Messer und sorgfältig schälen Sie das Gerät vom Master.
7. Punch-und Austrittslöcher in die PDMS mit einem 0,5 mm-Biopsie Punch.
8. Bond das Gerät auf einen Glasobjektträger mit Hilfe eines ^{Plasma-Bonder-4.}

3. Bereiten Sie ein LuftdruckSteuerpumpe, ein Reservoir, das die Flüssigkeit unter Druck setzen

1. Ändern der Pumpleistung, so dass die Druckluft tritt über eine Länge von 2,7 mm Innendurchmesser Polyethylenschlauch.
2. Konstruieren, so dass der Schlauch endet an einem Luer-Lock-Spritzenspitze durch Einsetzen in das Lumen über den Nippel auf der Rückseite des Luer-Lock.
3. Abzudichten, indem der Raum zwischen den Luer-Lock-Gewinde und die Rohrleitung mit Epoxidharz.
4. Bringen Sie ein 27,5 G-Nadel.

4. Bereiten Sie eine monodisperse Emulsion von wässrigen (Wasser-in-Öl) Tröpfchen in einem inerten Fluorträgeröl mit 2% (w / w) Abgehängte Gelöste Biokompatible Surfactant ⁷

Die spezifischen Reagenzien in diesen Tröpfchen enthalten sind abhängig von der Anwendung

1. In der Vorbereitung für die Wiedereinleitung, laden Sie die Emulsion in einer 1 ml-Spritze mit einer 27,5 G-Nadel.
2. Befestigen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und richten Sie die Pumpe vertikal (Nadel nach oben).
   Anmerkung: Diese Orientierung führt die Tröpfchen in einer Schicht über dem Trägeröl zu packen. Wenn die Pumpe gestartet wird, die Tröpfchen aus der Spritze bei hohen Volumenanteil von der Ölschicht unter ihnen gedrückt werden.

5. Bereiten Reagenzien für die Einführung in die Mikrofluidik-Chip

1. Lochen Sie drei 0,5-mm-Löcher in die Kappe einer 15 ml-Zentrifugenröhrchen (alle Behälter mit einem Schraubdeckel genügt) mit einer Biopsie-Punch-, Nadel-oder Bohrmaschine.
2. Legen Sie eine 0,5 mm Drahtelektrode und eine ~ 20 cm langen PE-Schlauch 2 durch zwei der Löcher, so daß sie den Boden des Rohrs zu erreichen.
3. In der verbleibende Loch, Gewinde Ø 2,5 cm von einer ~ 20 cm Länge der PE-Schlauch, so dass es oberhalb des Flüssigkeitsspiegels liegen.
4. Verschließen Sie alle Lücken auf der Oberseite der Kappe mit UV-gehärteten Epoxid.
5. Das Rohr wird mit der Flüssigkeit und picoinjection Schraube auf der Kappe.
6. Den Ausgang von dem Luftdruck-Regelpumpe zu dem kürzeren Schlauch durch Einsatzten der Nadel in das Lumen. Die Nadel sollte eng anliegen.
7. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 M NaCl als Faraday Moat zu dienen.
8. Schließen Sie ein 27,5 G-Nadel und sichern Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe.
9. Füllen Sie ein weiteres 1-ml-Spritze mit Träger / Spacer Öl, schließen Sie ein 27,5 G-Nadel, und sichern Sie sie in eine Spritzenpumpe.

6. Bereiten Sie die Mikrofluidik-Vorrichtung zur Picoinjection

1. Verbinden der Ausgangsleitungen (Länge länger) von der Injektionsmittelbehälter mit der Einlaßöffnung des picoinjection Flüssigkeit auf der Mikrofluid-Chip.
2. Die Spritze, die das 1 M NaCl zu der Einlassöffnung für den Faraday Graben auf dem mikrofluidischen Chip mit einer Länge von PE-Schlauch.
3. Die Spritze, die das Trägeröl zu dem Einlassanschluss des mikrofluidischen Chips mit einer Länge von PE-Schlauch.
4. Legen PE-Schlauch in die Emulsion Austrittsöffnung auf dem Mikrofluidik-Chip. Der Schlauch sollte in einer Emulsion Sammelgefäß zu beenden, nochnormalerweise ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
5. Legen PE-Schlauch in die Auslassöffnung für den Faraday Graben auf dem mikrofluidischen Chip. Der Schlauch sollte in einer nicht-leitenden und elektrisch isolierten Behälter, um einen Kurzschluss zu verhindern beenden.
6. Den Ausgang der Hochspannungs-(HV)-Verstärker über Krokodilklemme mit der Metallelektrode in die Flüssigkeit eingetaucht picoinjection.
7. Verbinden der Masseelektrode der Hochspannungsverstärker über Krokodilklemme mit dem Metall der Spritzennadel, die das 1 M NaCl.

7. Infuse Reagenzien in Mikrofluidik-Chip

1. Führen Sie die 1 M NaCl (Faraday Moat) an das Gerät mit einer Geschwindigkeit von 100 ul / hr.
2. Führen Sie die Tröpfchen Emulsion und Trägeröl bei Raten für den Geräteabmessungen. Für unsere Demo-Gerät, führen wir die Tropfen und Öl bei 200 und 400 ul / h auf. Die Flussraten ermöglichen sollten die Tröpfchen, die in regelmäßigen Abständen picoinjector getrennt gebendurch einen Spalt von Trägeröl.
3. Den Druck auf die Flüssigkeit picoinjection so dass der Fluiddruck an der Öffnung picoinjection in mechanischem Gleichgewicht mit der Tröpfchen Kanal angewendet.
   Hinweis: Bei diesem Druck (der Laplace-Druck), ist die Injektion von Fluid in den Kanal ohne Tröpfchen Knospung aus und bildet einen eigenen Tropfen (Abbildung 2) zu wölben. Bei diesen oben beschriebenen Strömungsgeschwindigkeiten, einen Druck von ca. 13 psi wenden wir auf die Injektionsflüssigkeit bis zum Gleichgewicht an der Injektionsstelle zu erreichen.

8. Beginnen Picoinjection

1. Wie Tröpfchen passieren die Einspritzöffnung, gelten ein 0-10 V, 10 kHz, AC-Signal verstärkt 1.000 x von der HV-Verstärker (Abbildung 3).
2. Modulation der Einspritzmenge durch Änderung der Amplitude der angelegten Spannung.
   Hinweis: Höhere Spannungen sollten mehr auf die Tröpfchen Flüssigkeit eingebracht werden können. Bei unseren Tests beobachten wir stabile und konsistente Injektion bei Spannungen seinzwischen 100 und 3.000 V mit Injektionslösungen von NaCl im Bereich von 10 bis 500 mm (Abbildung 4).

Ergebnisse

Mikroskopische Aufnahmen am picoinjection Website zeigen werden, dass die Elektrifizierung der picoinjection Flüssigkeit ist genug, um Injektion (Abbildung 2) auslösen. Das Injektionsvolumen kann durch Modulieren der Amplitude der angelegten Spannung, mit höheren Spannungen ermöglicht eine höhere Einspritzvolumina gesteuert werden. Zeichnen wir das Injektionsvolumen gegenüber dem Betrag der angelegten Spannung für drei repräsentative Molaritäten von Injektionsflüssigkeit in (Fig. 3).

Diskussion

Die Beziehung zwischen Einspritzmenge und der angelegten Spannung ist abhängig von vielen Faktoren, einschließlich Geräteabmessungen, die Länge der Rohrleitung trägt die picoinjection Fluid zu der Vorrichtung, Molarität picoinjection Flüssigkeit und die Geschwindigkeit der Tröpfchen, wie sie passieren sie Injektors. Aus diesem Grund empfehlen wir, dass die Volumen / Spannungsbeziehung vor jedem Lauf picoinjection durch Messung Injektionsvolumina an den Rändern der Arbeitsbereiche der Spannung und Molarität cha...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml Luer-Lok™ syringes	BD Medical	309628
LocTite UV-cured adhesive	Henkel	35241
PE-2 tubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2
Novec HFE-7500	3M	98-0212-2928-5
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
1.5 ml centrifuge tubes	Eppendorf	22363531
BD Falcon 15 ml tube	BD Biosciences	352097
Air pressure control pump	Control Air Inc.		We recommend one under the control of DAQ and control software
Syringe pumps	New Era		Must be capable of holding 1 ml syringes and flowing at rates as low as 100 μl/hr
HV-amplfier			Must be capable of 1,000x amplification of signals between 0.01 and 10 V
Plasma bonder/cleaner	Harrick Plasma
3” silicon wafers	Sigma Aldrich	647535
PDMS	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agent should be included
SU-8 photoresist	MicroChem		Viscocity depends on device dimensions