Agroinfiltración y PVX Agroinfección en Papa y Nicotiana benthamiana

Resumen

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

Resumen

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son dos ensayos eficientes de expresión transitoria para el análisis funcional de genes candidatos en plantas. El agente más comúnmente utilizado para la agroinfiltración es Agrobacterium tumefaciens, un patógeno de muchas especies de plantas de dicot. Esto implica que la agroinfiltración se puede aplicar a muchas especies de plantas. Aquí, presentamos nuestros protocolos y resultados esperados al aplicar estos métodos a la patata(Solanum tuberosum),su especie silvestre relacionada con tubérculos(Solanum sección Petota)y la planta modelo Nicotiana benthamiana. Además del análisis funcional de genes individuales, como los genes de resistencia(R)o avirulencia(Avr),el ensayo de agroinfiltración es muy adecuado para recapitular las interacciones R-AVR asociadas con interacciones específicas de patógenos del huésped simplemente entregando transgenes R y Avr en la misma célula. Sin embargo, algunos genotipos vegetales pueden elevar las respuestas de defensa inespecíficas a Agrobacterium,como observamos por ejemplo para varios genotipos de patata. En comparación con la agroinfiltración, la detección de la actividad avr con la agroinfección PVX es más sensible, más de alto rendimiento en pantallas funcionales y menos sensible a las respuestas de defensa inespecíficas a Agrobacterium. Sin embargo, la defensa inespecífica al PVX puede ocurrir y hay un riesgo de faltar respuestas debido a la resistencia extrema virus-inducida. A pesar de tales limitaciones, en nuestra experiencia, la agroinfiltración y la agroinfección de PVX son ensayos adecuados y complementarios que se pueden utilizar simultáneamente para confirmar los resultados de cada uno.

Introducción

Efectoroómica, un enfoque de genómica funcional de alto rendimiento ha surgido recientemente como una poderosa herramienta para identificar genes de resistencia(R)en plantas de cultivo y genes de avirulencia(Avr)coincidentes de patógenos^1-4. En contraste con la transformación estable más lenta con genes R, la estrategia efectoómica se basa en ensayos transitorios de secuencias de genes patógenos.

Desde la era de la genómica, los genomas de patógenos de plantas han sido ampliamente explorados. Por ejemplo, para los oomycetes, que incluyen los patógenos vegetales más devastadores, se han generado y analizado grandes colecciones de secuencias en busca de genes que desempeñen un papel durante la interacción con la planta^5-10. Una clase de proteínas patógenas representa efectores, que manipulan la estructura y la función de las células huésped, ya sea para facilitar la infección (factores de virulencia) o para desencadenar respuestas de defensa (factores de avirulencia)^11-13. La expresión de genes Avr en células vegetales que contienen genes R suele tener como resultado la respuesta a la muerte celular hipersensible (HR)^14,15. En planta la expresión de los genes R y Avr se puede lograr utilizando sistemas de expresión transitoria como Agrobacterium tumefaciens -basado en la transformación transitoria (agroinfiltración)¹⁶. Esta transformación transitoria también se puede aplicar en combinación con sistemas de expresión viral (agroinfección)^17,18.

Para la agroinfiltración, el agente más comúnmente utilizado es A. tumefaciens, un patógeno de amplio rango de plantas de dicot. A . tumefaciens contiene un plásmido inductor de tumores (Ti). El ADN de transferencia (T-DNA) de un plásmido Ti se translocará en las células vegetales después de que se active la maquinaria de virulencia de la bacteria. Esto puede ser desencadenado en células vegetales heridas, por los compuestos fenólicos de bajo peso molecular liberados y monosacáridos en un ambiente ligeramente ácido¹⁹. El gen de virulencia se activa después de la infiltración de suspensiones de Agrobacterium en paneles de hojas definidos por las venas principales. Luego, las células vegetales en los paneles de hojas se transformarán y expresarán los transgenes contenidos en la región T-DNA.

Agroinfection se basa en Agrobacteriumherida-inoculado, que media el desplazamiento de un virus a las células de la planta. El virus luego se propaga aún más a los tejidos vegetales adyacentes, en ausencia de Agrobacterium. Para la agroinfección, se pueden utilizar varios virus de plantas. Los virus ARN son vectores ideales para la expresión génica porque pueden multiplicarse a niveles muy altos en plantas infectadas. Entre los virus arn de las plantas, el virus de la patata X (PVX) es ampliamente utilizado para las pantallas de efectonomía. Para facilitar las pruebas funcionales de un gen insertado, se clonaron en el T-DNA de A. tumefaciensel promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S y el terminador de la nopalina sintasa. Después de que el T-DNA se transfiere a las células de la planta, el genoma de PVX contenido en el T-DNA se transcribe del promotor 35S. Luego, las partículas de virus se propagan sistémicamente en las plantas infectadas, lo que resulta en la expresión del gen insertado. Este método basado tanto en Agrobacterium como en PVX se denomina agroinfección PVX.

Aquí mostramos ejemplos de ensayos de agroinfiltración y agroinfección pvx. Como plantas huésped utilizamos germoplasma de patata(solanum sección Petota),para lo cual los enfoques efectorómicos han sido pioneros y han demostrado ser exitosos^3,4. También utilizamos Nicotiana benthamiana,que es reconocida como una planta modelo en plantas solanáceas ^14,21,22.

Protocolo

1. Condiciones de cultivo y pruebas de plantas

1. Cultivar y mantener las plantas en invernaderos controlados o cámaras climáticas dentro del rango de temperatura de 18-22 °C y bajo régimen de luz natural o con un régimen de 16 h/8 h día/noche. Retire las ramas axilares para que las plantas sean más manejables.
2. Para la patata, mantener las plantitas in vitro en frascos de plástico estériles que contengan medio Murashige-Skoog (MS) (sacarosa de 20 g/L, sales de 5 g/L ms con vitaminas, agar 8 g/L, pH 5,8) en condiciones controladas en cámaras climáticas a 18 °C con un régimen de 16 h/8 h día/noche durante dos semanas y luego transferirlas a macetas de suelo esterilizado en compartimentos de invernadero regulados.

2. Agroinfiltración

1. Material vegetal:
   Para Nicotiana benthamiana,use alrededor de plantas cultivadas con semillas de 4-5 semanas de edad. Para la patata, utilice alrededor de trasplantes de 4-5 semanas de edad de in vitro. Elija hojas jóvenes, sanas y completamente desarrolladas para infiltraciones.
2. Cultivo de Agrobacterium:
   1. Preparar el medio YEB con antelación (Tabla 1). Llene los tubos de 50 ml con un medio YEB de 10 ml suplementado con acetosirona de 1 μl (200 mM), tampón MES de 100 μl (ácido sulfónico de 2-(N-morfolino)-etano, 1 M) y los antibióticos apropiados. Pipeta 20 μl de glicerol stock de las cepas deseadas (Tabla 2) (que contiene el gen de interés) en el YEB. Iniciar cultivos para todas las cepas de Agrobacterium en este ensayo al mismo tiempo. Incubar las células agitando durante 1-2 días a 28 °C y 200 rpm a un OD₆₀₀ de aproximadamente 1.0.
   2. Cosechar células por centrifugación a 3.000 x g durante 10 min. Vierta el sobrenadante y resuspend el pellet en medio de MMA recién hecho (Tabla 3) a un OD₆₀₀ de 0.3. Suavemente células de vórtice para resuspend ellos. Para la coinfiltración de dos cepas bacterianas, mezcle el cultivo en una proporción de 1:1.
   3. Deje el cultivo en el banco a temperatura ambiente durante 1-6 horas antes de las infiltraciones. Mientras tanto, etiquete las plantas a infiltrar y la fecha del experimento.
3. Infiltraciones:
   Use una jeringa sin agujas de 1 ml para infiltrarse en las suspensiones de Agrobacterium. Inyecte cuidadosa y lentamente los paneles de hojas con las suspensiones de la jeringa (por razones de salud y seguridad, se debe usar protección ocular durante este proceso). Infiltrar al menos tres plantas por cada cepa. Utilice tres hojas por planta para servir como triplicados.
   Nota: Normalmente, 1 ml de suspensión de Agrobacterium s podría ser suficiente para 3 plantas de N. benthamiana. Para la papa, se necesita más suspensión porque las hojas de las especies solanum son más difíciles de infiltrar. Los volúmenes requeridos de suspensiones dependen de las especies solanum. Evite la contaminación cruzada cambiando guantes o esterilizando guantes con etanol entre infiltraciones y no regando las plantas hasta el día después de la inoculación.
4. Puntuación:
   Puntuar las respuestas macroscópicas unos 3 días después de la infiltración cuando el fenotipo de muerte celular es claro (Figura 1). Si el fenotipo de muerte celular es cuantitativo, utilice los criterios dados (Figura 2). Brevemente, las escalas para la puntuación macroscópica de la muerte celular dependen principalmente de los porcentajes de muerte celular del área infiltrada. Los porcentajes de muerte celular se representan en una escala de 0% (sin síntomas) a 100% (muerte celular confluente). Las respuestas intermedias van desde respuestas débiles como la clorosis hasta el aumento de los niveles de muerte celular. Si se desea, la puntuación macroscópica también se puede evaluar cuantitativamente utilizando equipos modernos de fotoimagen.

3. Pvx Agroinfection

1. Material vegetal:
   Para N. benthamiana,use alrededor de 2-3 plantas cultivadas con semillas de 2-3 semanas de edad. Para la patata, utilice alrededor de trasplantes de 2-3 semanas de edad de in vitro. Para pruebas a gran escala, utilice plantas ligeramente más viejas (4-5 semanas), ya que estas plantas tienen hojas más y más grandes para acomodar un mayor número de puntos de inoculación de Agrobacterium.
2. Cultivo de Agrobacterium:
   1. Prepare el medio YEB con anticipación. Llene los tubos de 10 ml con 3 ml de YEB suplementados con los antibióticos apropiados. Pipeta 20 μl de glicerol stock de las cepas deseadas (Tabla 2) (que contiene el gen de interés) en el YEB. Iniciar cultivos para todas las cepas de Agrobacterium en este ensayo al mismo tiempo. Incubar las células agitando durante 1-2 días a 28 °C y 200 rpm a un OD₆₀₀ de aproximadamente 1.0.
   2. Pipetear unos 300 μl de cada cepa de Agrobacterium y esparcirlos sobre placas de medio de agar sólido LB complementadas con los antibióticos apropiados e incubar las células a 28 °C durante 1-2 días.
3. Infecciones:
   Utilice una espátula para recoger el cultivo de Agrobacterium en el plato. Sumerja un palillo de dientes de madera en el cultivo de Agrobacterium en la espátula y perfore las hojas para inocular gran cantidad de bacterias. Inocular al menos tres plantas para cada cepa. Utilice tres hojas por planta para servir como triplicados. En cada hoja, haga múltiples sitios de inoculación para cada cepa.
4. Puntuación:
   Puntuar las respuestas macroscópicas unas dos semanas después de la inoculación(Figura 3). Para pantallas de alto rendimiento, registre las respuestas cualitativas (sí/no) para cada punto de inoculación. A continuación, calcule el porcentaje de sitios que responden y compárelos con los controles.

Resultados

La Figura 1 muestra un experimento representativo de agroinfiltración con 7 efectores diferentes (E1-E7) en patata y N. benthamiana. La muerte celular aparece en los paneles de hojas infiltradas unos 3 días después de la infiltración. El grado del fenotipo de la muerte celular necesita ser comparado con los controles. Se utilizó como^controlpositivo una mezcla de la cepa Agrobacterium AGL1(pVirG)23 que contenía pBINplus-R3a y pK7WG2-AVR3a, mientras que AGL1(pVirG) se utilizó como control negativo. Las figuras 1A y 1B muestran buenos ejemplos de agroinfiltración en el genotipo de patata MaR8 (Mastenbroek R8)²⁶ y N. benthamiana,respectivamente, que son muy susceptibles de agroinfiltración. Hay muerte celular confluente en el panel de la hoja coinfiltrado con control positivo, mientras que ninguna respuesta de muerte celular se produce con control negativo o pBINplus-R3a. En MaR8, dos efectores AVR3a (E2) y AVR4 (E3) inducen una muerte celular, mientras que los otros efectores (E1 y E4-E7) no. En N. benthamiana, ninguno de los efectores probados induce una respuesta de muerte celular. Las figuras 1C y 1D muestran ejemplos de agroinfiltración en la patata silvestre Solanum berthaultii 483-1 y Solanum rechei 210-5, que no son bien susceptibles para la técnica de agroinfiltración. En S. berthaultii 483-1, el tejido foliar muestra una necrosis inespecífica a los controles negativos, así como a todos los efectores probados. En S. rechei 210-5, los paneles de hojas infiltradas muestran una respuesta de muerte celular muy débil al control positivo.

La Figura 2 muestra un rango de escalas de puntuación que se pueden utilizar para cuantificar la respuesta a Agrobacteriumagroinfiltrado. Los porcentajes de muerte celular se representan en una escala 0-100%. Los fenotipos observados van desde síntomas macroscópicamente no visibles (0%), pasando por un rango de respuestas intermedias que muestran clorosis y aumento de los niveles de muerte celular, hasta la muerte celular confluente (100%).

La Figura 3 muestra un experimento representativo después de la agroinfección de PVX en patata. Normalmente, la muerte celular de expansión se puede encontrar en los sitios alrededor de dos semanas después de la inoculación de la dedo-selección. Como se muestra en ambos paneles de figuras, la muerte celular en expansión está presente en los sitios que fueron inoculados con pGR106-CRN2 (control positivo utilizando el efector crinkler Crn2), que es un gen inductor de muerte celular general de P. infestans^27. Aparte de respuesta de menor importancia a herir, no se observa ninguna muerte celular de expansión en los sitios que eran diente-recogen inoculados con el pGR106-empty (control negativo). En la Figura 3A,que representa el genotipo de patata MaR3 (Mastenbroek R3), dos pGR106-efectores (E1 y E2) no indujeron la muerte celular. En la Figura 3B,se presenta un resultado positivo del cribado efector en el Solanum huancabambense silvestre 354-1; La respuesta a la muerte celular se observó a dos pGR106-efectores (E1-E3, que representan las elicitinas)^28.

Figura 1. Ejemplos de agroinfiltración en patata y N. benthamiana. Plantas incluyendo(A)un genotipo de patata MaR8 (Mastenbroek R8),(B) N. benthamiana,(C) Solanum berthaultii 483-1 y (D) Solanum rechei 210-5 fueron infiltrados con una mezcla de la cepa Agrobacterium AGL1(pVirG) ²³ que contiene pBINplus-R3a y pK7WG2-AVR3a (control positivo), AGL1(pvirG) (control negativo), pBINplus-R3a, y siete efectores (E1-E7). Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Cuantificación de respuestas de agroinfiltración. La fotografía muestra escalas de puntuación representativas para la muerte celular, que van desde 0% (sin síntomas) a 100% (muerte celular confluente). Las respuestas intermedias van desde respuestas débiles como la clorosis hasta el aumento de los niveles de muerte celular. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 3. Ejemplos de agroinfección de PVX en papa. Genotipo de papa MaR3 (Mastenbroek R3)(A)y Solanum huancabambense 354-1(B)de recogida de dientes inoculados con pGR106-CRN2 (control positivo), pGR106-vacío (control negativo) y pGR106-E1-2 (efectores), o pGR106-E1-E3, respectivamente. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Tabla 1. Medio YEB

1 L	destilado H2O
5 g	sacarosa
5 g	extracto de carne de vacuno
5 g	peptona bacteriológica
1 g	extracto de levadura
2 ml	MgSO4 (1 M)

Tabla 2. Vectores y cepas utilizados para la agroinfiltración y la agroinfección de PVX. Se pueden utilizar varios vectores binarios. Los vectores en la lista a continuación permiten una alta expresión de los genes candidatos y han funcionado bien en nuestras manos. Preferimos utilizar la cepa Agrobacterium GV3101(pMP90)29 en N. benthamiana y encontrar AGL1³⁰ que contiene el plásmido ayudante pVirG (pBBR1MCS-5.virGN54D)²³ más adecuado en patata^31. Se han analizado cepas adicionales en otros grupos en varias plantas modelo, incluyendo N. benthamiana, pero no en la patata^32.

GW: versión de puerta de enlace³⁶

Tabla 3. Medio de MMA.

Ajuste el pH a 5.6.

Discusión

Los ensayos transitorios como la agroinfiltración y la agroinfección son métodos eficientes que son vitales para la investigación molecular moderna de la fitopatología. A pesar de algunas limitaciones, estos métodos satisfacen la demanda de análisis funcionales eficientes y robustos de alto rendimiento en las plantas.

El sistema de agroinfiltración es un ensayo funcional ampliamente utilizado en una variedad de especies de plantas. La agroinfiltración facilita la entrega de varios transgenes en la misma célula con la expresión simultánea de proteínas que interactúan. Esto es ventajoso para recapitular las relaciones R-AVR, mediante la coinfiltración de cepas de Agrobacterium que expresan genes Avr con cepas que expresan los genes R coincidentes. Además, para los pares R-AVR conocidos, tales coinfiltraciones se pueden utilizar como controles positivos. Incluir estos controles es importante porque en algunos genotipos de plantas, la eficiencia de transformación puede estar por debajo del umbral para detectar respuestas. Incluir controles negativos, por ejemplo, una cepa de Agrobacterium que contiene un vector sin un inserto de genes, también es esencial para determinar si un determinado genotipo de planta plantea respuestas de defensa inespecíficas a Agrobacterium. Esta característica ocurre a una cierta frecuencia en el germoplasma de la patata, y no todas las especies de Solanum son adecuadas para este sistema de expresión basado en Agrobacterium. En general, el ensayo de agroinfiltración funciona muy bien en N. benthamiana y en la mayoría de los genotipos de patata. Además de la efectonomía, hay varias otras aplicaciones potenciales para la técnica de agroinfiltración, como la producción de proteínas a partir de transgenes y la localización de proteínas en células vegetales por microscopía confocal.

La agroinfección de PVX es un sistema de cribado altamente sensible y, por lo general, más adecuado para exámenes de detección de alto rendimiento. Puesto que el Agrobacterium ahora está ahora solamente localmente presente, las respuestas inespecíficas a esta bacteria ahora no son muy inquietantes, pues el virus de PVX asume el control la extensión adicional del transgene. Sin embargo, las plantas pueden ser resistentes al PVX, o montar respuestas de resistencia extrema (ER), y en ese caso el método de agroinfección no es adecuado. Otra limitación del método de agroinfección pvx es el tamaño del inserto del gen de interés. Los fenotipos observados de respuestas pueden variar de una necrosis negra intensa que rodea la herida a la necrosis débil cerca del punto de la inoculación. Tanto en las especies de N. benthamiana como en solanum, la agroinfección por PVX se reconoce como más sensible que la agroinfiltración.

Teniendo en cuenta que el fondo genético de los diversos genotipos de plantas ensayados puede tener algunas restricciones (ver arriba), generalmente obtenemos conclusiones similares por agroinfección y agroinfiltración de PVX. Estos resultados también son comparables a los obtenidos en otros ensayos, como las infiltraciones de proteínas²⁹ y ELISA^3. Teniendo en cuenta las ventajas y limitaciones de ambos sistemas, se recomienda utilizar ambos métodos para complementarse entre sí o confirmar resultados independientes.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beef extract	Sigma-Aldrich	B4888
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Yeast extract	Oxoid	LP0021
MgSO4	Sigma-Aldrich	208094
MS salts (without vitamins)	Duchefa Biochemie	M0221
MES	Duchefa Biochemie	M1503
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	300013
Incubator	Infors HT	Multitron II
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Spectrophotometer	Eppendorf	Biophotometer 6131