Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Riepilogo

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Abstract

Agroinfiltrazione e agroinfezione PVX sono due efficaci saggi di espressione transitoria per l'analisi funzionale dei geni candidati nelle piante. L'agente più comunemente usato per l'agroinfiltrazione è Agrobacterium tumefaciens, un agente patogeno di molte specie di piante dicot. Ciò implica che l'agroinfiltrazione può essere applicata a molte specie vegetali. Qui presentiamo i nostri protocolli e i risultati attesi quando applichiamo questi metodi allapatata (Solanum tuberosum),alle sue specie solanum porta tuberiche selvatiche correlate(sezione Solanum Petota)e alla pianta modello Nicotiana benthamiana. Oltre all'analisi funzionale di singoli geni, come i geni di resistenza (R) o avirulenza(Avr), il saggio di agroinfiltrazione è molto adatto per ricapitolare le interazioni R-AVR associate a specifiche interazioni patogene ospiti semplicemente fornendo transgeni R e Avr nella stessa cellula. Tuttavia, alcuni genotipi vegetali possono aumentare le risposte di difesa non specifiche all'Agrobacterium, come abbiamo osservato ad esempio per diversi genotipi di patate. Rispetto all'agroinfiltrazione, il rilevamento dell'attività AVR con agroinfezione PVX è più sensibile, più ad alto throughput negli schermi funzionali e meno sensibile alle risposte di difesa aspecifiche all'Agrobacterium. Tuttavia, può verificarsi una difesa aspecifica del PVX e c'è il rischio di perdere risposte a causa di una resistenza estrema indotta da virus. Nonostante tali limitazioni, nella nostra esperienza, l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono saggi adatti e complementari che possono essere utilizzati contemporaneamente per confermare i risultati l'uno dell'altro.

Introduzione

L'effectoromica, un approccio genomico funzionale ad alta produttività è recentemente emerso come un potente strumento per identificare igeni di resistenza (R)nelle piante coltivate e abbinare i geni di avirulenza(Avr)degli agenti patogeni^1-4. In contrasto con la trasformazione stabile più dispendiosa in termini di tempo con i geni R, la strategia dell'effettoromica si basa su saggi transitori di sequenze geniche patogene.

Fin dall'era genomica, i genomi degli agenti patogeni vegetali sono stati ampiamente esplorati. Ad esempio per gli oomiceti, che includono gli agenti patogeni vegetali più devastanti, sono state generate e analizzate grandi raccolte di sequenze per geni che svolgono un ruolo durante^{l'interazione con la pianta 5-10}. Una classe di proteine patogene rappresenta gli effettori, che manipolano la struttura e la funzione delle cellule ospiti sia per facilitare l'infezione (fattori di virulenza) sia per innescare risposte di difesa (fattori di avirulenza)^11-13. L'espressione dei geni Avr nelle cellule vegetali contenenti geni R di solito si traduce nella risposta di morte cellulare ipersensibile (HR)^14,15. Nella planta espressione dei geni R e Avr può essere realizzata utilizzando sistemi di espressione transitoria come Agrobacterium tumefaciens -trasformazione transitoria basata sulla base (agroinfiltrazione)¹⁶. Questa trasformazione transitoria può essere applicata anche in combinazione con sistemi di espressione virale (agroinfezione)^17,18.

Per l'agroinfiltrazione, l'agente più comunemente usato è A . tumefaciens, un'ampia gamma di agenti patogeni delle piante dicot. Un tumefaciens contiene un plasmide che induce il tumore (Ti). Trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide Ti si trasferirà nelle cellule vegetali dopo l'attivazione del meccanismo di virulenza del batterio. Questo può essere innescato nelle cellule vegetali ferite, dai composti fenolici a basso peso molecolare rilasciati e dai monosaccaridi in un ambiente leggermente acido¹⁹. Il gene della virulenza si attiva dopo l'infiltrazione delle sospensioni dell'Agrobacterium nei pannelli fogliari definiti dalle vene maggiori. Quindi le cellule vegetali nei pannelli fogliari saranno trasformate ed esprimeranno i transgeni contenuti nella regione T-DNA.

L'agroinfezione si basa sull'Agrobatterioinoculato dalla ferita , che media la traslocazione di un virus alle cellule vegetali. Il virus si diffonde quindi ulteriormente ai tessuti vegetali adiacenti, in assenza di Agrobacterium. Per l'agroinfezione, è possibile utilizzare diversi virus vegetali. I virus dell'RNA sono vettori ideali per l'espressione genica perché possono moltiplicarsi a livelli molto alti nelle piante infette. Tra i virus dell'RNA vegetale, Potato Virus X (PVX) è ampiamente utilizzato per gli schermi di effettioromica. Per facilitare i test funzionali per un gene inserito, i vettori binari che contengono il genoma PVX affiancato dal promotore del virus del mosaico di Cavolfiore 35S e dal terminatore della nopalina sintasi, sono stati clonati nel T-DNA di A. tumefaciens²⁰. Dopo che il T-DNA è stato trasferito in cellule vegetali, il genoma PVX contenuto nel T-DNA viene trascritto dal promotore 35S. Quindi le particelle virali si diffondono sistemicamente nelle piante infette, con conseguente espressione del gene inserito. Questo metodo basato sia sull'Agrobatterio che sul PVX è chiamato agroinfezione PVX.

Qui mostriamo esempi sia per i saggi di agroinfiltrazione che per i saggi di agroinfezione PVX. Come piante ospiti utilizziamo il germoplasma delle patate(sezione Solanum Petota), per il quale gli approcci di effettioromica sono stati pionieri e si sono^{dimostrati efficaci 3,4}. Utilizziamo anche Nicotiana benthamiana,rinomata come impianto modello nelle piante Solanaceous ^14,21,22.

Protocollo

1. Condizioni di coltivazione e collaudo delle piante

1. Coltivare e mantenere piante in serre controllate o camere climatiche entro l'intervallo di temperatura di 18-22 °C e sotto regime di luce naturale o con un regime giorno/notte di 16 ore / 8 ore. Rimuovere i rami ascellari per rendere le piante più gestibili.
2. Per le patate, mantenere le fiorine in vitro in barattoli di plastica sterili contenenti mezzo Murashige-Skoog (MS) (20 g/L di saccarosio, 5 g/L S.M. sali con vitamine, 8 g/L di agar, pH 5.8) in condizioni controllate in camere climatiche a 18 °C con regime giorno/notte di 16 ore/8 ore per due settimane e quindi trasferirli in vasi di terreno sterilizzato in compartimenti di serra regolamentati.

2. Agroinfiltrazione

1. Materiale vegetale:
   Per Nicotiana benthamiana,utilizzare piante coltivate a semi di circa 4-5 settimane. Per la patata, utilizzare circa 4-5 settimane di trapianti da in vitro. Scegli foglie giovani, sane e completamente sviluppate per le infiltrazioni.
2. Cultura agrobatterio:
   1. Preparare in anticipo il mezzo YEB(tabella 1). Riempire i tubi da 50 ml con mezzo YEB da 10 ml integrato con acido solfonico di acetosyringone da 1 μl (200 mM), tampone MES da 100 μl (acido solfonico 2-(N-morfolino)-etano, 1 M) e gli antibiotici appropriati. Pipetta 20 μl di glicerolo dei ceppi desiderati(tabella 2) (contenente il gene di interesse) nello YEB. Inizia le colture per tutti i ceppi di Agrobacterium in questo saggio allo stesso tempo. Incubare le cellule tremando per 1-2 giorni a 28 °C e 200 giri/min a un OD₆₀₀ di circa 1,0.
   2. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 10 min. Versare il supernatante e resospendare il pellet in mezzo MMA appena fatto(tabella 3)ad un OD₆₀₀ di 0,3. Delicatamente cellule vortice per ripreposerle. Per la coinfiltrazione di due ceppi batterici, mescolare la coltura in un rapporto 1:1.
   3. Lasciare la coltura in panchina a temperatura ambiente per 1-6 ore prima delle infiltrazioni. Nel frattempo, etichettare le piante da infiltrare e la data dell'esperimento.
3. Infiltrazioni:
   Utilizzare una siringa senza ago da 1 ml per infiltrarsi nelle sospensioni agrobacterium. Iniettare con attenzione e lentamente pannelli fogliari con le sospensioni dalla siringa (per motivi di salute e sicurezza la protezione degli occhi deve essere indossata durante questo processo). Infiltrarsi in almeno tre piante per ogni ceppo. Utilizzare tre foglie per pianta per servire come triplicati.
   Nota: Normalmente, 1 ml di sospensioni agrobatterio potrebbe essere sufficiente per 3 piante di N. benthamiana. Per la patata, è necessaria una maggiore sospensione perché le foglie delle specie Solanum sono più difficili da infiltrare. I volumi richiesti di sospensioni dipendono dalla specie Solanum. Evitare la contaminazione incrociata cambiando guanti o sterilizzando guanti con etanolo tra infiltrazioni e non annaffiando le piante fino al giorno dopo l'inoculazione.
4. punteggio:
   Segnare risposte macroscopiche circa 3 giorni dopo l'infiltrazione quando il fenotipo di morte cellulare è chiaro (Figura 1). Se il fenotipo di morte cellulare è quantitativo, utilizzare i criteri specificati (Figura 2). In breve, le scale per il punteggio macroscopico della morte cellulare dipendono principalmente dalle percentuali di morte cellulare dell'area infiltrata. Le percentuali di morte cellulare sono raffigurate su una scala dallo 0% (nessun sintomo) al 100% (morte cellulare confluente). Le risposte intermedie vanno da risposte deboli come la clorosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. Se lo si desidera, il punteggio macroscopico può anche essere valutato quantitativamente utilizzando moderne apparecchiature di foto-imaging.

3. Agroinfezione PVX

1. Materiale vegetale:
   Per N. benthamiana,utilizzare circa 2-3 settimane di piante coltivate a semi. Per la patata, utilizzare circa 2-3 settimane di trapianti da in vitro. Per i test su larga scala, utilizzare piante leggermente più vecchie (4-5 settimane), poiché queste piante hanno foglie sempre più grandi per ospitare un numero maggiore di macchie di inoculazione di Agrobacterium.
2. Coltivazione dell'agrobatterio:
   1. Preparare il mezzo YEB in anticipo. Riempire i tubi da 10 ml con 3 ml di YEB integrati con gli antibiotici appropriati. Pipetta 20 μl di glicerolo dei ceppi desiderati(tabella 2) (contenente il gene di interesse) nello YEB. Inizia le colture per tutti i ceppi di Agrobacterium in questo saggio allo stesso tempo. Incubare le cellule tremando per 1-2 giorni a 28 °C e 200 giri/min a un OD₆₀₀ di circa 1,0.
   2. Pipetta circa 300 μl di ogni ceppo agrobatterio e stenderli su piastre medie di agar solido LB integrate con gli antibiotici appropriati e incubare le cellule a 28 °C per 1-2 giorni.
3. Infezioni:
   Usa una spatola per raccogliere la coltura di Agrobacterium nel piatto. Immergere uno stuzzicadenti di legno nella coltura di Agrobacterium sulla spatola e perforare le foglie per inoculare una grande quantità di batteri. Inoculare almeno tre piante per ogni ceppo. Utilizzare tre foglie per pianta per servire come triplicati. In ogni foglia, creare più siti di inoculazione per ogni ceppo.
4. punteggio:
   Segnare risposte macroscopiche circa due settimane dopo l'inoculazione (Figura 3). Per gli schermi ad alta velocità effettiva, registrare le risposte qualitative (sì/no) per ogni punto di inoculazione. Quindi calcola la percentuale di siti che rispondono e confrontali con i controlli.

Risultati

La figura 1 mostra un esperimento rappresentativo di agroinfiltrazione con 7 diversi effettori (E1-E7) in patate e N. benthamiana. La morte cellulare appare nei pannelli fogliari infiltrati circa 3 giorni dopo l'infiltrazione. L'estensione del fenotipo di morte cellulare deve essere confrontata con i controlli. Una miscela del ceppo Agrobacterium AGL1(pVirG)^{23 contenente} pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a è stata utilizzata come controllo positivo^24,25, mentre AGL1(pVirG) è stato utilizzato come controllo negativo. Le figure 1A e 1B mostrano buoni esempi di agroinfiltrazione nel genotipo di patata MaR8 (Mastenbroek R8)²⁶ e N. benthamiana, rispettivamente, che sono molto suscettibili di agroinfiltrazione. C'è una morte cellulare confluente nel pannello fogliare coinfiltrato con controllo positivo, mentre non si verifica alcuna risposta di morte cellulare con controllo negativo o pBINplus-R3a. In MaR8, due effettori AVR3a (E2) e AVR4 (E3) inducono una morte cellulare, mentre gli altri effettori (E1 ed E4-E7) non lo fanno. In N. benthamiana, nessuno degli effettori testati induce una risposta di morte cellulare. Le figure 1C e 1D mostrano esempi di agroinfiltrazione nella patata selvatica Solanum berthaultii 483-1 e Solanum rechei 210-5, che non sono ben disponibili per la tecnica di agroinfiltrazione. In S. berthaultii 483-1, il tessuto fogliare mostra una necrosi non specifica ai controlli negativi e a tutti gli effettori testati. In S. rechei 210-5, i pannelli fogliari infiltrati mostrano una risposta di morte cellulare molto debole al controllo positivo.

La figura 2 mostra una serie di scale di punteggio che possono essere utilizzate per quantificare la risposta all'Agrobatterio agroinfiltrato . Le percentuali di morte cellulare sono raffigurate su una scala dello 0-100%. I fenotipi osservati vanno da sintomi macroscopicamente non visibili (0%), attraverso una serie di risposte intermedie che mostrano clorosi e livelli crescenti di morte cellulare, fino alla morte cellulare confluente (100%).

La figura 3 mostra un esperimento rappresentativo dopo l'agroinfezione PVX nella patata. Normalmente, l'espansione della morte cellulare può essere trovata nei siti circa due settimane dopo l'inoculazione del dente. Come mostrato in entrambi i pannelli di figura, la morte cellulare in espansione è presente nei siti che sono stati inoculati con pGR106-CRN2 (controllo positivo usando l'effettore crinkler Crn2), che è un gene che induce la morte cellulare generale da P. infestans²⁷. A parte una risposta minore al mento, non si nota alcuna morte cellulare in espansione nei siti che sono stati inoculati con il pGR106-vuoto (controllo negativo). Nella figura 3A, che rappresenta il genotipo di patata MaR3 (Mastenbroek R3), due effetti pGR106 (E1 ed E2) non hanno indotto la morte cellulare. Nella figura 3Bviene presentato un risultato positivo dello screening dell'effettore nella selvaggia Solanum huancabambense 354-1; la risposta di morte cellulare è stata osservata a due pGR106-effettori (E1-E3, che rappresentano le elicitina)²⁸.

Figura 1. Esempi di agroinfiltrazione in patate e N. benthamiana. Piante tra cui (A) un genotipo di patata MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 e (D) Solanum rechei 210-5 sono stati infiltrati con una miscela del ceppo agrobatterio AGL1(pVirG) ^{23 contenente} pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a (controllo positivo), AGL1(pvirG) (controllo negativo), pBINplus-R3a, e sette effettori (E1-E7). Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figura 2. Quantificazione delle risposte agroinfiltrazione. La fotografia mostra scale di punteggio rappresentative per la morte cellulare, che vanno dallo 0% (nessun sintomo) al 100% (morte cellulare confluente). Le risposte intermedie vanno da risposte deboli come la clorosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

Figura 3. Esempi di agroinfezione PVX in patate. Genotipo di patata MaR3 (Mastenbroek R3) (A) e Solanum huancabambense 354-1 (B) dente inoculato con pGR106-CRN2 (controllo positivo), pGR106-vuoto (controllo negativo) e pGR106-E1-2 (effettori) o pGR106-E1-E3, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande.

La tabella 1. Mezzo YEB

1 L	distillato H2O
5 g	saccarosio
5 g	estratto di manzo
5 g	peptone batteriologico
1 g	estratto di lievito
2 ml	MgSO4 (1 M)

La tabella 2. Vettori e ceppi utilizzati per l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX. È possibile utilizzare diversi vettori binari. I vettori nella lista seguente consentono un'alta espressione dei geni candidati e hanno funzionato bene nelle nostre mani. Preferiamo utilizzare il ceppo Agrobacterium GV3101(pMP90)²⁹ in N. benthamiana e trovare AGL1^{30 contenente} il pVirG plasmide aiutante (pBBR1MCS-5.virGN54D)²³ più adatto nella^{patata 31}. Ulteriori ceppi sono stati analizzati in altri gruppi su varie piante modello tra cui N. benthamiana ma non nella patata³².

GW: gateway versione³⁶

La tabella 3. Media MMA.

Regolare il pH a 5,6.

Discussione

Saggi transitori come l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione sono metodi efficienti che sono vitali per la moderna ricerca sulla patologia vegetale molecolare. Nonostante alcune limitazioni, questi metodi soddisfano la domanda di analisi funzionali ad alta produttività efficienti e robuste negli impianti.

Il sistema di agroinfiltrazione è un saggio funzionale ampiamente utilizzato in una serie di specie vegetali. L'agroinfiltrazione facilita la consegna di diversi transgeni nella stessa cellula con espressione simultanea di proteine interagenti. Questo è vantaggioso per ricapitolare le relazioni R-AVR, coniando ceppi di Agrobacterium che esprimono geni Avr con ceppi che esprimono i geni R corrispondenti. Inoltre, per le coppie R-AVR note, tali coinfiltrazioni possono essere utilizzate come controlli positivi. L'inclusione di tali controlli è importante perché in alcuni genotipi dell'impianto, l'efficienza di trasformazione può essere inferiore alla soglia per rilevare le risposte. Includere controlli negativi, ad esempio un ceppo di Agrobatteri contenenti un vettore senza un inserto genico, è anche essenziale per determinare se un certo genotipo vegetale solleva risposte di difesa non specifiche all'Agrobacterium. Questa caratteristica si verifica a una certa frequenza nel germplasma delle patate, e non tutte le specie Solanum sono ben adatte per questo sistema di espressione a base di Agrobacterium. Generalmente, il saggio di agroinfiltrazione funziona molto bene in N. benthamiana e nella maggior parte dei genotipi di patate. Oltre all'effettioromica, ci sono varie altre potenziali applicazioni per la tecnica di agroinfiltrazione, come la produzione di proteine dai transgeni e la localizzazione proteica nelle cellule vegetali mediante microscopia confocale.

L'agroinfezione PVX è un sistema di screening altamente sensibile e in genere più adatto per screening ad alta produttività. Poiché l'Agrobacterium è ora presente solo localmente, le risposte non specifiche a questo batterio non sono ora molto inquietanti, poiché il virus PVX assume un'ulteriore diffusione del transgene. Tuttavia, le piante possono essere resistenti al PVX o montare risposte di resistenza estrema (ER) e in tal caso il metodo di agroinfezione non è adatto. Un'altra limitazione del metodo di agroinfezione PVX è la dimensione dell'inserto del gene di interesse. I fenotipi osservati di risposte possono variare da un'intensa necrosi nera che circonda la ferita a una debole necrosi vicino al punto di inoculazione. Sia nelle specie N. benthamiana che Solanum, l'agroinfezione PVX è riconosciuta come più sensibile dell'agroinfiltrazione.

Tenendo conto del fatto che il background genetico dei diversi genotipi vegetali testati può avere alcune restrizioni (vedi sopra), generalmente otteniamo conclusioni simili per agroinfezione PVX e agroinfiltrazione. Questi risultati sono comparabili anche come si ottengono in altri saggi, come le infiltrazioni proteiche²⁹ ed ELISA³. Considerando i vantaggi e i limiti di entrambi i sistemi, si consiglia di utilizzare entrambi i metodi per completarsi a vicenda o confermare risultati indipendenti.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beef extract	Sigma-Aldrich	B4888
Bacteriological peptone	Oxoid	LP0037
Yeast extract	Oxoid	LP0021
MgSO4	Sigma-Aldrich	208094
MS salts (without vitamins)	Duchefa Biochemie	M0221
MES	Duchefa Biochemie	M1503
LB broth powder	Sigma-Aldrich	L3022
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406
Syringe (1 ml)	BD Plastipak	300013
Incubator	Infors HT	Multitron II
Centrifuge	Heraeus	Multifuge 3S-R
Spectrophotometer	Eppendorf	Biophotometer 6131