El Helsinki Rata microquirúrgica flanco Aneurisma Modelo

Resumen

Microsurgical sidewall aneurysms in rats are created by end-to-side anastomosis of an aortic graft to the abdominal aorta. We present step-by-step instructions and discuss anatomical and surgical details for successful experimental saccular aneurysm creation.

Resumen

Modelos aneurisma sacular experimentales son necesarios para probar opciones y dispositivos de tratamiento quirúrgico y endovascular nuevos antes de su introducción en la práctica clínica. Además, se necesitan modelos experimentales para dilucidar la compleja biología aneurisma conduce a la ruptura de los aneurismas saculares.

Varios tipos diferentes de modelos experimentales para aneurismas saculares se han establecido en diferentes especies. Muchos de ellos, sin embargo, requieren habilidades especiales, equipo costoso, o ambientes especiales, lo que limita su uso generalizado. Se necesita un modelo experimental simple, robusto y de bajo costo como una herramienta estandarizada que se puede utilizar de una manera estandarizada en diversas instituciones.

El modelo de aneurisma abdominal de la pared lateral de la aorta de rata microquirúrgica combina la posibilidad de estudiar ambos nuevas estrategias de tratamiento endovascular y la base de la biología molecular en un aneurisma estandarizada y baratomanera. Injertos estandarizada por medio de la forma, tamaño, y la geometría se cosechan de la aorta torácica descendente de una rata donante y luego trasplantadas a un receptor singénico de rata. Los aneurismas se suturan de extremo a lado con continua o interrumpida 9-0 suturas de nylon a la aorta abdominal infrarrenal.

Presentamos instrucciones de procedimiento paso a paso, información sobre el equipo necesario, y se discute importantes detalles anatómicos y quirúrgicos para la creación de microcirugía con éxito de un aneurisma de la pared lateral de la aorta abdominal en la rata.

Introducción

La rotura de un aneurisma de la arteria cerebral sacular provoca hemorragia que amenaza la vida que conduce a un accidente cerebrovascular, daño neurológico permanente o la muerte. La ruptura puede ser prevenida por cualquiera de clipaje o la oclusión del aneurisma endovascular. Un tratamiento médico para prevenir el crecimiento del aneurisma y la ruptura aún no ha sido establecida.

Se necesitan modelos experimentales para aneurismas saculares para estudiar la biología de los aneurismas arteriales y para el ensayo de dispositivos y nuevas estrategias terapéuticas. A estos efectos, varios modelos diferentes en diferentes especies se han desarrollado y publicado ^1. Grandes modelos de aneurismas en cerdos, perros y conejos se utilizan preferentemente para probar innovaciones endovasculares en la arquitectura aneurisma complejo ^1,2. Modelos murinos aneurisma, por otro lado, permiten probar preguntas de investigación en especies modificadas genéticamente ^3,4 y facilitar la aclaración de aneurisma en la biología celular y molecularnivel mucho mejor que las especies más grandes ^1. Aunque endovascular trans-carótida y despliegue del dispositivo de trans-ilíaca se limita a las ratas más grandes (> 400-500 g) y los stents más pequeño que 2,0 mm y 1,5 mm de diámetro ^5,6, stents también se pueden colocar a través de la inserción directa en la aorta abdominal segmento de albergar los aneurismas experimentales. El trabajo previo utilizando el modelo de rata abdominal microquirúrgico aneurisma aórtico pared lateral demostró su viabilidad en las pruebas de nuevos dispositivos embólicos y su uso en el estudio de las bases moleculares de la biología aneurisma ^3,7.

Muchos de los modelos de aneurismas saculares experimentales publicados actualmente requieren un equipo costoso, ambientes especiales (por ejemplo, quirófanos estériles con capacidades de fluoroscopia), la competencia de radiología intervencionista, o el uso de especies caros. Estos requisitos limitan el uso generalizado de estos modelos, y conducen a la utilización de diferentes modelos en diferentes laboratorios, que mcopos comparación de datos y meta-análisis difícil, si no imposible. Se necesita un modelo experimental simple, robusto y de bajo costo como una herramienta estandarizada que se puede utilizar de una manera estandarizada en diversos laboratorios con el fin de obtener resultados comparables de diferentes instituciones. Para ello, hemos creado la pared lateral de la aorta modelo aneurisma arterial sacular rata.

El objetivo de este informe es presentar instrucciones de procedimiento paso a paso, información sobre el equipo necesario, y para discutir importantes características anatómicas y quirúrgicas para la creación de microcirugía con éxito de los aneurismas abdominales de pared lateral de la aorta en la rata.

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Protocolo

NOTA: Hombre ratas Wistar (peso corporal medio: 356 ± 44 g; de 10-14 semanas de edad) fueron alojados en la sala de los animales a 22-24 ° C y la luz doce horas / oscuridad ciclo con el libre acceso a la dieta de pellets, el agua del grifo y también recibió atención humanitaria de conformidad con las directrices institucionales. Los experimentos fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Helsinki, Finlandia.

NOTA: En la siguiente demostración de este método quirúrgico es como sigue: anestesiar la rata mediante inyección subcutánea adaptado peso de hidrocloruro de medetomidina (0,5 mg / kg) y la inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (50 mg / kg). Prueba para la falta de un reflejo dedo del pie-pellizco para confirmar que la rata está totalmente anestesiado. Aplicar pomada para los ojos, una pinza de la zona quirúrgica, y limpiar la piel con un desinfectante adecuado, por ejemplo clorhexidina, ya sea en alcohol o agua. Lávese las manos, póngase ropa protectora, una cubierta de la cabeza y la caramáscara y guantes quirúrgicos estériles. Tener un asistente de ayuda quirúrgica en el mantenimiento de las condiciones de la cirugía aséptica y documentar las características quirúrgicas (como se indica en la Tabla 1). Controle la profundidad de la anestesia cada 15 minutos durante la cirugía siguiendo la frecuencia respiratoria, la frecuencia cardíaca, y la reacción a estímulos nocivos (prueba del pellizco del dedo del pie). La inyección subcutánea de buprenorfina (0,03 mg / kg) fue dado para la analgesia postoperatoria y repetirse si es necesario cada 12 horas.

1. hardware, consumibles, y Posicionamiento

1. Mantenga el animal pequeño quirófano tranquilo, aséptica, y mantener la temperatura ambiente a 23 +/- 3 ° C. Para llevar a cabo la cirugía de aneurisma experimental el siguiente equipo mínimo necesario:
   1. Use una tapa microscopio quirúrgico mesa idealmente equipado con un alcance y asistente de cámara microscopio digital. Utilice porosa superficie operativa reutilizable y lavable superficie del instrumento para proteger la mesa de laboratorio.
   2. Preparar consumibles tales como desinfectantes de la piel, suero fisiológico, gasas pequeñas y más grandes y material de sutura incluyendo 9-0 micro suturas, un no absorbible 5-0 y 3-0 sutura absorbible.
   3. Utilice los siguientes instrumentos quirúrgicos estándar: Tijeras quirúrgicas, pinzas de tejido, esparcidor de tejidos blandos o retractores de auto-retención, y dos pinzas quirúrgicas de mosquitos.
   4. Utilice un conjunto básico de microcirugía instrumento que incluye: soporte de microagujas curvo, uno curvo y dos microforceps rectas, y una microscissor recta o curva.
   5. Mantener los instrumentos de microcirugía en un plato de riñón lleno con solución salina estéril para mantener el instrumento no pegajoso y limpio durante la cirugía. El plato de riñón se rellena con alfombra de goma o un guante quirúrgico para evitar daños en las puntas de los micro-instrumentos. Asegúrese de que todos los suministros son estériles y el procedimiento se realiza con una técnica aséptica de acuerdo con las recomendaciones actuales para la cirugía de la supervivencia en animales de laboratorio ^8-10.
   6. Además, use un aplicador de clip vascular y tres pinzas vasculares temporales no traumáticas. Es importante que las abrazaderas utilizadas tienen un bajo poder de cierre para prevenir la lesión a la pared muy delgada de la aorta de rata. También hay que preparar un gobernante con barras de medio milímetro escala, una pequeña almohadilla de goma de color, y una aguja roma corto.
   7. Colocar las ratas en una posición supina, inmovilizar la parte delantera y traseras patas con cinta quirúrgica sin aplicar estiramiento o compresión a la piel, y doblar su espalda con un marcador grueso o un bolígrafo cauterio colocándolo bajo la región lumbar de la espalda. Es importante obtener la mayor lordosis de la columna lumbar como sea posible con el fin de mejorar la exposición retroperitoneal y el acceso a la aorta infrarrenal que facilita la anastomosis microquirúrgica. Se recomienda esta posición para la creación de un aneurisma de aorta abdominal pero no es necesario para la cosecha torácica injerto.

2. injerto cosecha

1. Uanestesia general nder, abrir la cavidad torácica (iniciar el tiempo de isquemia del injerto). Aplicar una pizca dedo nociva para confirmar que la rata no responde antes de continuar con los siguientes pasos. Corte a través de la pared abdominal medioventral, identificar el diafragma justo por encima del hígado, y cortar el tejido conectivo en la parte inferior del diafragma para permitir el acceso a la caja torácica. Con grandes tijeras, parte roma abajo, cortados a través de las costillas apenas un centímetro a la izquierda y derecha de la línea media de la caja torácica y abrir la cavidad torácica. Los pulmones se movilizan hacia el lado derecho del corazón. Sacrificar las ratas con una sobredosis con inyección intracardiaca de ketamina hydrochloride.Pulmonary tronco, la vena subclavia izquierda, izquierda vena cava craneal, y la vena ácigos interfiere con la cosecha de la aorta torácica proximal.
2. Caudal a las venas prominentes hay un buen punto de entrada para comenzar la disección de la aorta torácica descendente utilizando micro-tijeras y microforceps.
3. Trace la aorta torácica back de la pared dorsal del tórax hacia arriba para el arco aórtico por la retracción y disección roma suave con la abrazadera quirúrgica Mosquito.
4. Clamp y luego cortar las venas con unas tijeras. Mantener las pinzas en las venas y utilizar como un retractor para exponer el arco aórtico subyacente.
5. Colocar un no absorbible ligadura de seda 6-0 justo encima de la primera arteria intercostal dejando la aorta.
6. Cortar la aorta descendente justo debajo de la arteria subclavia izquierda y luego por debajo de la ligadura. Recorte se puede hacer con el fin de obtener una geometría estandarizada aneurisma perpendicular, o si es necesario, para conseguir un ángulo específico entre el eje del aneurisma y la aorta. Mida el injerto en su anchura y longitud.
   NOTA: Cosechado injertos o bien pueden ser trasplantados inmediatamente en ratas receptoras o se procesen para lograr descelularización de la pared del injerto. Injertos descelularizado se pueden almacenar a -4 grados Celsius hasta el re-implantación en una fecha posterior (Figura 1). The descelularización de la pared del aneurisma se ha demostrado que predisponer el aneurisma para agrandar ^11.

3. Graft Descelularización

1. Injertos de donantes Freeze en PBS a -4 ° C.
2. Al día siguiente, descongele los injertos, enjuague con agua purificada y desionizada a temperatura ambiente, y se incuba durante 10 horas a 37 ° C en el 0,1% de dodecil sulfato de sodio.
3. Finalmente, lavar los injertos tratados con sulfato de dodecil de sodio tres veces con agitación suave, vuelva a congelar en tampón fosfato salino, y mantener a -4 ° C hasta su uso.

4. Aneurisma Creación

1. La disección de la aorta abdominal
   1. Después de que el animal ha sido anestesiado, cortar la piel de la zona quirúrgica y limpiar la piel con un desinfectante adecuado. Prueba para la falta de una respuesta dedo del pie-pellizco antes de la incisión de la piel. Inicie el 1cm proximal de la incisión en los genitales in posición medioventral (hora de inicio de operación). Separar cuidadosamente la piel de los músculos subyacentes. Fin disección uno a dos centímetros por debajo del esternón.
   2. Con cuidado pero con firmeza, tire hacia arriba los músculos abdominales subyacentes para evitar daños a los órganos subyacentes. Extender el corte longitudinal a lo largo de la línea alba hacia arriba para el proceso xifoides y terminan en dirección caudal a nivel de la vejiga.
   3. Aplique suavemente la presión a la vejiga para vaciarla a fin de facilitar el acceso al espacio retroperitoneal.
   4. Mueva el intestino delgado y el ciego prominente a la derecha oa la izquierda. Identificar el intestino grueso a saber, el colon descendente en la parte inferior izquierda de la cavidad abdominal.
   5. Cortar el ligamento entre el intestino delgado y el colon descendente en dirección craneal para permitir más amplia exposición de la pared dorsal del cuerpo. Coloque un retractor de auto-retención para mantener los intestinos aparte.
   6. La ubicación ideal de extremo a lado anastomosis aneurisma is encuentra en el nivel entre el renal y iliolumbar venas. La aorta abdominal se encuentra retroperitoneal incrustado en el tejido graso. Durante la disección de prestar especial atención a los pares casi transparentes uréteres y los vasos testiculares.
   7. Si se necesita mayor retracción de los intestinos, utilizar swaps de gasa grandes. La lordosis lumbar inducida durante el posicionamiento mediante la colocación de un lápiz cauterizador u objeto similar en la parte posterior inferior de la rata, reduce significativamente la necesidad de retracción del intestino.
   8. La superficie ventral de la pared dorsal del cuerpo está cubierta con una delgada peritoneo parietal. Una vez que se abrió, visualizar la aorta justo debajo. Durante la disección cuidadosa, precisa y roma de la aorta abdominal de las grandes venas adyacentes comprender sólo la adventicia para evitar daños a la pared del vaso.
   9. Con poca frecuencia, las pequeñas arterias lumbares surgen como recipiente segmentaria de la superficie dorsal de la aorta abdominal e interfieren con la preparación. La ligadura y corte de la vasija es neeDED para evitar exudación retrógrada durante la sutura aneurisma. El uso de curvas micro-fórceps puede facilitar la colocación de ligadura en la profundidad.
2. De extremo a lado anastomosis
   1. Ponga una almohadilla de goma de color debajo de la aorta abdominal y tapizar con un pequeño hisopo de gasa. Quitar el tejido conectivo laxo y adventicia en el nivel del sitio de la anastomosis planificada.
   2. Sujete la aorta abdominal distal a la anastomosis, luego proximal (hora de inicio pinzamiento aórtico). Esto asegura un llenado firme de la embarcación y facilita la posterior arteriotomía.
   3. Realice la arteriotomía usando ya sea micro-tijeras rectas o curvas. Un micro-forceps sostiene un pedazo muy pequeño de la pared del vaso para cortar una forma elíptica.
   4. Enjuague la arteria a fondo con solución salina en ambas direcciones utilizando una aguja de punta roma.
   5. Coloque los dos primeros puntos de sutura de esta anastomosis de extremo a lado en el extremo proximal y distal de la arteriotomía (hora de inicio anastomosis). Evite agarrar de la pared del vaso con las micro-fórceps siempre que sea posible. Asegúrese de que cada sutura se coloca a través de todas las capas de la pared del vaso.
   6. Realizar sutura ya sea como suturas continuas o interrumpidas. Si se elige la sutura interrumpida luego colocar la parte de atrás nueve en punto de sutura en primer lugar. Suturas posteriores pueden estar separadas de partida adyacente a la primera sutura. Sujete la adventicia cuidadosamente. Evitar cualquier compresión / aferramiento de la íntima.
   7. Una vez finalizada la pared trasera, compruebe la parte endoluminal de la anastomosis para suturas fuera de lugar. Realice los mismos procedimientos en el mismo orden en el lado frontal. Asegúrese de que el primero de un total de tres nudos por sutura es firme, pero no demasiado ajustado.
3. Hemostasia y Clausura
   1. Tras el fin de la anastomosis lateral se completa (fin de los tiempos anastomosis), enjuagar la zona con solución salina y retire la pinza distal primero para permitir el flujo de retorno (aórtica extremo de sujeción del tiempo y del injerto final ti isquemiame).
   2. Si el sangrado evidente se produce por reflujo puede ser necesaria una puntada adicional (hora de inicio de la hemostasia). En caso de menor exudación, lograr la hemostasia con una presión suave sobre la zona de sangrado utilizando una pequeña pieza de un hisopo de gasa.
   3. Retire la pinza vascular proximal, enjuagar el sitio de la anastomosis, una vez más, y cortar los extremos restantes de la ligadura en la cúpula del aneurisma.
   4. Confirmar la permeabilidad del aneurisma mediante la observación de aumento de volumen del aneurisma durante la onda de pulso arterial alta. Evaluar la permeabilidad de la arteria abdominal distal a través de la "prueba de ordeño" directa.
   5. Retire la lámina de plástico y el pequeño hisopo de gasa debajo. El torbellino de sangre palpitante dentro del aneurisma creado es claramente visible.
   6. Cubra líneas de sutura alrededor de la anastomosis con pequeños trozos de tejido adiposo o Spongostan para hemostasis adicional si pequeña exudación está todavía presente (hora de finalización de la hemostasia).
   7. Retire las separadoras y gasa hisopos de los tejidos blandos.Coloque el intestino delgado, el ciego y la masa grasa en su posición correcta.
   8. Cierre los músculos abdominales en la línea media utilizando 5-0, 4-0, o 3-0 suturas reabsorbibles o no reabsorbibles, seguido de cierre de la herida de la piel utilizando la técnica de sutura continua con 3-0 sutura multifilamento reabsorbible (tiempo de funcionamiento de extremo). Nota: En nuestra experiencia ratas toleraron suturas reabsorbibles piel mejor que las suturas de monofilamento no absorbibles.

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Resultados

Una serie piloto comprendía 14 ratas. Posteriormente un total de 84 animales fueron operados de acuerdo con el protocolo presentado por varios proyectos de investigación, entre marzo y septiembre de 2012. adicionales 29 animales sirvieron como donantes de injertos arteriales saculares. Los experimentos restantes se realizaron utilizando injertos pretratadas cosechadas y almacenadas a partir de experimentos previos utilizando ratas del mismo sexo, la tensión, el peso y la edad.

El peso cor...

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Discusión

Los avances en nuestra comprensión de la compleja biología de aneurisma de la arteria cerebral sacular depende del análisis de los datos epidemiológicos y clínicos, complementados por estudios de laboratorio sobre muestras de los pacientes y el trabajo experimental en modelos animales ^3,12,13.

Animales pequeños, tales como la rata están intrínsecamente asociados con menores costos de experimentos y la vivienda, y la necesidad de equipo especializado reducidos. Un tiempo de...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine			Any genericon
Ketamin			Any genericon
Buprenorphine			Any genericon
Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
6-0 non absorbable silk suture	B. Braun, Germany	C0761060
9-0 nylon micro suture	B. Braun, Germany	G1118471
Spongostan	Ethicon Inc., USA	MS0002
Operation microscope	Leica , Germany	M651
Digital microscope camera	Sony, Japan	SSC-DC58AP
Standard surgical instruments	B. Braun, Germany	Multiple	See protocol 1.4
Microsurgical instruments	B. Braun, Germany	Multiple	See protocol 1.5
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Temporary vascular clamps	B. Braun, Germany	FT250T
Graph Pad Prism statistical software	GraphPad Software, San Diego, California, USA		V 6.02 for Windows