Le Helsinki Rat microchirurgie flanc anévrisme modèle

Résumé

Microsurgical sidewall aneurysms in rats are created by end-to-side anastomosis of an aortic graft to the abdominal aorta. We present step-by-step instructions and discuss anatomical and surgical details for successful experimental saccular aneurysm creation.

Résumé

Modèles d'anévrisme sacculaire expérimentales sont nécessaires pour tester de nouvelles options et des dispositifs de traitement chirurgical et endovasculaire avant leur introduction dans la pratique clinique. En outre, des modèles expérimentaux sont nécessaires pour élucider la biologie de l'anévrisme complexe conduisant à la rupture d'un anévrisme sacculaire.

Plusieurs types de modèles expérimentaux de l'anévrisme sacculaire ont été mis en place dans les différentes espèces. Beaucoup d'entre eux, cependant, nécessitent des compétences particulières, des équipements coûteux, ou des environnements spécifiques, ce qui limite leur utilisation à grande échelle. Un modèle expérimental simple, robuste et peu coûteux est nécessaire comme un outil normalisé qui peut être utilisé d'une manière standardisée dans diverses institutions.

Le modèle de l'aorte abdominale latérale de l'anévrisme de rat microchirurgicale combine la possibilité d'étudier les stratégies de traitement endovasculaire nouvelles et les bases moléculaires de l'anévrisme de biologie dans un standard et peu coûteuxmanière. Greffes standardisé au moyen de la forme, la taille et la géométrie sont récoltées à partir de l'aorte thoracique descendante d'un rat des bailleurs de fonds et ensuite transplantés à un destinataire rat syngénique. Les anévrismes sont suturés bout-à-face avec continu ou interrompu 9-0 sutures en nylon de l'aorte abdominale sous-rénale.

Nous présentons étape par étape les instructions procédurales, d'information sur l'équipement nécessaire, et de discuter des détails anatomiques et chirurgicales importantes pour la création de microchirurgie succès d'un anévrisme de l'aorte abdominale du flanc chez le rat.

Introduction

La rupture d'un anévrisme de l'artère cérébrale sacculaire provoque une hémorragie menaçant la vie qui conduit à la course, des dommages neurologiques permanents ou la mort. Rupture peut être évitée soit par découpage de microchirurgie ou endovasculaire anévrisme occlusion. Un traitement médical pour empêcher la croissance et la rupture de l'anévrisme n'est pas encore établie.

Les modèles expérimentaux de l'anévrisme sacculaire sont nécessaires pour étudier la biologie des anévrismes artériels et pour le contrôle des dispositifs et de nouvelles stratégies thérapeutiques. A ces fins, plusieurs modèles différents d'espèces différentes ont été développées et ^une publiée. Modèles d'anévrisme grandes chez les porcs, les chiens et les lapins sont de préférence utilisés pour tester les innovations endovasculaires dans l'architecture de l'anévrisme complexe ^1,2. Modèles murins d'anévrisme, d'autre part, permettent de tester des questions de recherche en espèces génétiquement modifiées ^3,4 et faciliter la clarification de l'anévrisme de la biologie cellulaire et moléculaire àniveau bien meilleur que les grandes espèces ^1. Bien que trans-carotidienne endovasculaire et le déploiement de dispositif trans-iliaque est limitée à de plus grands rats (> 400-500 g) et les stents plus petit que 2,0 mm et 1,5 mm de diamètre ^5,6, les stents peuvent également être placés par insertion directe dans l'aorte abdominale secteur abritant les anévrismes expérimentaux. Des travaux antérieurs utilisant le rat microchirurgicale de modèle abdominale anévrisme aortique flanc démontré sa faisabilité dans les tests de nouveaux dispositifs emboliques et son utilisation dans l'étude de la base moléculaire de l'anévrisme de biologie ^3,7.

Beaucoup de modèles sont actuellement publiés anévrisme sacculaire expérimentales nécessitent des équipements coûteux, des environnements particuliers (par exemple les salles d'opération stériles avec des capacités de fluoroscopie), la compétence de la radiologie interventionnelle, ou l'utilisation d'espèces coûteuses. Ces exigences limitent l'utilisation généralisée de ces modèles, et conduisent à l'utilisation de différents modèles dans différents laboratoires, qui mpaillettes comparaison des données et des méta-analyse difficile, voire impossible. Un modèle expérimental simple, robuste et peu coûteux est nécessaire comme un outil normalisé qui peut être utilisé d'une manière standardisée dans différents laboratoires afin d'obtenir des résultats comparables provenant de différentes institutions. Pour ce faire, nous avons créé l'aorte flanc artérielle sacculaire modèle d'anévrisme de rat.

Le but de ce rapport est de présenter étape par étape les instructions procédurales, d'information sur l'équipement nécessaire, et de discuter des caractéristiques anatomiques et chirurgicales importantes pour la création de microchirurgie succès de l'abdomen anévrismes aortiques de flancs chez le rat.

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Protocole

NOTE: rats mâles Wistar (poids corporel moyen: 356 ± 44 g; vieux 10-14 semaines) ont été logés dans la chambre des animaux à 22-24 ° C et douze heures de lumière cycle jour / nuit avec un accès libre à l'alimentation de pellets, de l'eau du robinet et a également reçu des soins humains en conformité avec les directives institutionnelles. Les expériences ont été examinés et approuvés par le Comité pour la protection des animaux à l'Université de Helsinki, Finlande.

REMARQUE: Dans la démonstration suivante notre méthode chirurgicale est le suivant: anesthésier la rat par injection sous-cutanée adaptée poids de chlorhydrate de médétomidine (0,5 mg / kg) et une injection intrapéritonéale de chlorhydrate de kétamine (50 mg / kg). Test de l'absence d'un réflexe orteil-pincement pour confirmer que le rat est anesthésié complètement. Appliquer une pommade pour les yeux, couper du site chirurgical, et nettoyer la peau avec un désinfectant approprié, par exemple chlorhexidine, dans de l'alcool ou de l'eau. Se laver les mains, mettre des vêtements de protection, un couvre-tête et le visagemasque et des gants chirurgicaux stériles. Avoir une aide assistante en chirurgie à maintenir des conditions d'asepsie en chirurgie et de documenter les caractéristiques chirurgicales (comme indiqué dans le tableau 1). Surveiller la profondeur de l'anesthésie toutes les 15 minutes pendant la chirurgie en suivant le rythme respiratoire, le rythme cardiaque, et la réaction à une stimulation nociceptive (test de pincement de l'orteil). Injection sous-cutanée de la buprénorphine (0,03 mg / kg) a été donné pour l'analgésie postopératoire et répétée si nécessaire toutes les 12 heures.

1. matériel, consommables, et positionnement

1. Gardez la petite salle de la chirurgie des animaux calme, aseptique, et maintenir la température ambiante à 23 ° C +/- 3. Pour effectuer la chirurgie de l'anévrisme de l'équipement expérimental minimale suivante est nécessaire:
   1. Utilisez une table microscope chirurgical idéalement équipé d'un cadre et assistant caméra microscope numérique. Utilisation surface de commande réutilisable surface non poreuse et d'instrument à nettoyer à protéger la paillasse de laboratoire.
   2. Préparer consommables tels que les désinfectants pour la peau, sérum physiologique, petites et grandes compresses de gaze et matériel de suture, y compris les micro-sutures 9-0, 5-0 non absorbable, et 3-0 suture absorbable.
   3. Utilisez les instruments chirurgicaux standards suivants: Ciseaux chirurgicaux, pinces de tissus, écartement des tissus mous ou écarteur auto-maintien, et deux pinces chirurgicales moustiques.
   4. Utilisez un ensemble de base de microchirurgie de bord qui comprend: support de micro-aiguille courbe, une courbe et deux microforceps droites, et un microscissor droite ou courbe.
   5. Gardez les instruments de microchirurgie dans un plat de rein remplie de sérum physiologique stérile afin de maintenir l'instrument non-collante et propre lors de la chirurgie. Le haricot est complétée avec des tapis en caoutchouc ou un gant chirurgical pour éviter d'endommager les pointes des micro-instruments. Veiller à ce que toutes les fournitures sont stériles et la procédure est réalisée avec une technique aseptique selon les recommandations actuelles pour la chirurgie de survie sur des animaux de laboratoire ^10.8.
   6. En outre, utiliser une pince applicateur vasculaire et trois pinces vasculaires temporaires atraumatiques. Il est important que les pinces utilisées ont une puissance faible de fermeture pour empêcher un dommage à la paroi très mince de l'aorte de rat. Préparez aussi une règle de demi-millimètre barres d'échelle, un petit tampon de caoutchouc de couleur, et une aiguille émoussée courte.
   7. Placez les rats en position couchée, immobiliser l'avant et de derrière les pattes avec du ruban adhésif chirurgical sans appliquer étirement ou compression de la peau, et plier le dos avec un gros marqueur ou un stylo de cautérisation en le plaçant sous la région lombaire du dos. Il est important d'obtenir autant de colonne vertébrale lombaire lordose que possible afin d'améliorer l'exposition rétropéritonéale et l'accès à l'aorte sous-rénale qui facilite l'anastomose microchirurgicale. Ce positionnement est recommandé pour la création aorte anévrisme abdominal mais pas nécessaire pour thoracique greffe récolte.

2. prélèvement de greffe

1. Under anesthésie générale, ouvrir la cavité thoracique (commencer greffe temps d'ischémie). Appliquer un pincement de l'orteil nocive pour confirmer que le rat ne répond pas avant de passer aux étapes suivantes. Couper à travers la paroi abdominale médioventral, identifier le diaphragme au-dessus du foie, et de couper le tissu conjonctif dans le bas de la membrane pour permettre l'accès à la cage thoracique. Avec de grands ciseaux, côté non tranchant vers le bas, couper à travers les côtes juste un centimètre à gauche et à droite de la ligne médiane de la cage thoracique et d'ouvrir la cavité thoracique. Les poumons sont mobilisés sur le côté droit du cœur. Sacrifier les rats par surdosage avec injection intracardiaque de kétamine hydrochloride.Pulmonary tronc, gauche veine sous-clavière gauche veine cave crânienne, et la veine azygos interférer avec la récolte de l'aorte thoracique proximale.
2. Caudal aux veines saillantes, il est un bon point de départ la dissection de l'aorte thoracique descendante aide de micro-ciseaux et microforceps entrée.
3. Trace l'aorte thoracique back de la paroi dorsale du thorax vers le haut de la crosse de l'aorte par rétraction douce et émoussée dissection avec la pince chirurgicale moustiques.
4. Clamp, puis couper les veines avec des ciseaux. Maintenir les pinces sur les veines et l'utiliser comme un écarteur pour exposer la crosse de l'aorte sous-jacent.
5. Placez un non résorbable 6-0 ligature de soie juste au-dessus de la première artère intercostale laissant l'aorte.
6. Couper l'aorte descendante juste en dessous de l'artère sous-clavière gauche, puis au-dessous de la ligature. Découper peut être fait afin d'obtenir une géométrie de l'anévrisme standardisé perpendiculaire, ou, si nécessaire, pour obtenir un angle spécifique entre l'axe de l'anévrisme et l'aorte. Mesurer le greffon dans sa largeur et sa longueur.
   NOTE: Vendange greffes peuvent être soit immédiatement transplantées chez des rats bénéficiaires ou encore traités pour obtenir décellularisation de la paroi de la prothèse. Greffes décellularisés peuvent être conservés à -4 degrés Celsius jusqu'à ce que la réimplantation à une date ultérieure (Figure 1). The décellularisation de la paroi d'anévrisme a été montré pour prédisposer l'anévrisme pour agrandir ^11.

3. greffe décellularisation

1. Greffes de donneurs gel dans un tampon phosphate salin à -4 ° C.
2. Le lendemain, dégeler les greffes, rincer avec de l'eau purifiée et déminéralisée à la température ambiante, et incuber pendant 10 heures à 37 ° C dans 0,1% de dodécylsulfate de sodium.
3. Enfin, laver les greffes de sulfate de sodium dodécyl traité trois fois avec agitation douce, recongeler saline tamponnée au phosphate, et de garder à -4 ° C jusqu'à utilisation.

4. anévrisme Création

1. Dissection de l'aorte abdominale
   1. Après que l'animal a été anesthésié, couper la fourrure du site chirurgical et nettoyer la peau avec un désinfectant approprié. Test de l'absence d'une réponse pincement pincement avant l'incision de la peau. Lancer l'incision de 1 cm en amont des organes génitaux in poste médioventral (heure de début de l'opération). Séparez délicatement la peau des muscles sous-jacents. Fin dissection un à deux centimètres au-dessous du sternum.
   2. Soigneusement mais fermement les muscles abdominaux sous-jacents pour éviter d'endommager les organes sous-jacents. Elargir la coupe longitudinale le long de la ligne blanche vers le haut à la pointe du sternum et se terminer en direction caudale au niveau de la vessie.
   3. Appuyez doucement sur la vessie pour la vider afin de faciliter l'accès à l'espace rétro-péritonéal.
   4. Déplacez l'intestin grêle et le caecum importante vers la droite ou la gauche. Identifier le gros intestin à savoir le côlon descendant en bas à gauche de la cavité abdominale.
   5. Couper le ligament entre l'intestin grêle et le côlon descendant en direction du crâne pour permettre une exposition plus large de la paroi dorsale du corps. Placer un écarteur auto-maintien pour maintenir les entrailles dehors.
   6. L'emplacement idéal de bout-en-côté anévrisme anastomose is trouvé au niveau entre la rénale et iliolombaires veines. L'aorte abdominale est rétropéritonéale intégré dans le tissu adipeux. Lors de la dissection accorder une attention particulière aux uretères presque transparentes paires et vaisseaux testiculaires.
   7. Si en outre le retrait de l'intestin est nécessaire, utiliser de plus grandes gaze swaps. La lordose lombaire induite pendant le positionnement en plaçant un stylo de cautérisation ou un objet similaire sous le bas du dos du rat, réduit considérablement la nécessité de l'intestin rétractation.
   8. La surface ventrale de la paroi dorsale du corps est recouvert d'une mince pariétal du péritoine. Une fois cette ouverture, de visualiser l'aorte juste en dessous. Au cours de dissection minutieuse forte et brutale de l'aorte abdominale de grosses veines adjacentes saisir que l'adventice pour éviter d'endommager la paroi du vaisseau.
   9. Il arrive parfois que les petites artères lombaires surviennent comme récipient segmentaire de la face dorsale de l'aorte abdominale et interfèrent avec la préparation. La ligature et la coupe de la cuve est néeded pour éviter un suintement rétrograde pendant anévrisme suture. Utilisation des micro-forceps incurvés peut faciliter le placement de ligature dans la profondeur.
2. End-to-anastomose
   1. Mettez un tapis de caoutchouc de couleur sous l'aorte abdominale et tapisser avec un petit tampon de gaze. Retirer tissu conjonctif lâche et adventice au niveau du site d'anastomose prévue.
   2. Fixer l'aorte abdominale distale de l'anastomose d'abord, puis proximale (heure de début de clampage aortique). Ceci assure un remplissage de la cuve ferme et facilite artériotomie ultérieure.
   3. Effectuez l'artériotomie en utilisant soit des micro-ciseaux droits ou courbes. Un micro-pinces détient un très petit morceau de la paroi du vaisseau pour découper une forme elliptique.
   4. Rincer abondamment avec de l'artère saline dans les deux directions à l'aide d'une aiguille à pointe émoussée.
   5. Placer les deux premiers fils de suture de la présente anastomose termino-latérale à l'extrémité proximale et distale de l'artériotomie (heure de début d'anastomose). Éviter de saisir de la paroi du vaisseau avec les micro-pince chaque fois que possible. Assurez-vous que chaque fil de suture est placé à travers toutes les couches de la paroi du vaisseau.
   6. Effectuer suture soit en tant que sutures continues ou interrompues. Si suture interrompue est choisie puis placez d'abord le côté arrière neuf o`clock suture. Sutures ultérieures peuvent être espacées de départ adjacente à la première suture. Saisissez l'adventice attentivement. Éviter toute compression / saisie de l'intima.
   7. Lorsque le mur du fond est terminée, vérifiez la partie endoluminale de l'anastomose pour sutures égarés. Effectuez les mêmes procédures dans le même ordre sur la face avant. Assurez-vous que la première d'une série de trois nœuds par suture est ferme mais pas trop serré.
3. Hémostase et la fermeture
   1. Après la fin anastomose est terminée (fin du temps d'anastomose), rincer le site avec une solution saline et retirer la pince distale premier à permettre de refoulement (aortique de fin de serrage du temps et de la greffe de fin ischémie time).
   2. Si le saignement se produit évident de refoulement d'un point supplémentaire peut être nécessaire (l'heure de début de l'hémostase). En cas de suintement mineur, obtenir l'hémostase avec une légère pression sur le site de saignement à l'aide d'un petit morceau d'un tampon de gaze.
   3. Retirer la pince vasculaire proximale, rincez le site d'anastomose fois de plus, et couper les extrémités restantes de la ligature au niveau du dôme de l'anévrisme.
   4. Confirmer la perméabilité de l'anévrisme par l'observation de l'augmentation de volume de l'anévrisme lors de pic d'onde de pouls artériel. Évaluer la perméabilité distale de l'artère abdominale à travers le «test de traite" directe.
   5. Retirer la feuille de plastique et la petite de gaze dessous. Le tourbillon de sang pulsé dans l'anévrisme créé est clairement visible.
   6. Couvrir lignes de suture autour de l'anastomose de petits morceaux de tissu adipeux ou Spongostan pour hémostase supplémentaire si petit suintement est toujours présent (temps de l'hémostase de fin).
   7. Retirez les barres de flèche et une gaze des tissus mous.Placez l'intestin grêle, le caecum, et la masse de graisse dans leur position correcte.
   8. Fermer les muscles abdominaux ligne médiane en utilisant 5-0, 4-0, 3-0 ou fils résorbables ou non résorbables suivie par la peau fermeture de la plaie en utilisant la technique de suture continue avec 3-0 résorbable suture polyfilament (fin de durée d'utilisation). Remarque: Dans nos rats d'expérience tolérés résorbables sutures de la peau mieux que les sutures de monofilament non résorbable.

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Résultats

Une série de pilote comprenait 14 rats. Par la suite un total de 84 animaux ont été opérés selon le protocole présenté plusieurs projets de recherche entre Mars et Septembre 2012. supplémentaires 29 animaux ont servi de donneurs pour des greffes sacculaires artérielles. Les expériences restantes ont été réalisées avec des greffons prétraités récoltées et stockées par des expériences antérieures sur des rats du même sexe, la souche, le poids et l'âge.

Le poids corpo...

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Discussion

Progrès dans notre compréhension de la biologie complexe de sacculaire anévrisme de l'artère cérébrale dépend de l'analyse des données épidémiologiques et cliniques, complétés par des études en laboratoire sur des échantillons de patients et les travaux expérimentaux dans des modèles animaux ^3,12,13.

Les petits animaux comme le rat sont intrinsèquement associés à des coûts inférieurs d'expériences et de logement, et de réduire le besoin d'éq...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine			Any genericon
Ketamin			Any genericon
Buprenorphine			Any genericon
Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
6-0 non absorbable silk suture	B. Braun, Germany	C0761060
9-0 nylon micro suture	B. Braun, Germany	G1118471
Spongostan	Ethicon Inc., USA	MS0002
Operation microscope	Leica , Germany	M651
Digital microscope camera	Sony, Japan	SSC-DC58AP
Standard surgical instruments	B. Braun, Germany	Multiple	See protocol 1.4
Microsurgical instruments	B. Braun, Germany	Multiple	See protocol 1.5
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Temporary vascular clamps	B. Braun, Germany	FT250T
Graph Pad Prism statistical software	GraphPad Software, San Diego, California, USA		V 6.02 for Windows