La Helsinki Rat microchirurgica Sidewall Aneurisma Modello

Riepilogo

Microsurgical sidewall aneurysms in rats are created by end-to-side anastomosis of an aortic graft to the abdominal aorta. We present step-by-step instructions and discuss anatomical and surgical details for successful experimental saccular aneurysm creation.

Abstract

Modelli sperimentali aneurisma sacciforme sono necessari per testare nuove opzioni di trattamento chirurgico ed endovascolare e dispositivi prima di essere introdotti nella pratica clinica. Inoltre, sono necessari modelli sperimentali per chiarire la complessa biologia aneurisma che porta alla rottura di aneurismi sacciformi.

Diversi tipi di modelli sperimentali per aneurismi sacciformi sono stati stabiliti in specie diverse. Molti di loro, tuttavia, richiedono abilità speciali, attrezzature costose, o in ambienti speciali, che limita il loro uso diffuso. Un modello sperimentale semplice, robusto ed economico è necessario come strumento standardizzato che può essere utilizzato in modo standardizzato in varie istituzioni.

Il modello aortico addominale fianco aneurisma ratto microchirurgica unisce la possibilità di studiare entrambe le strategie di trattamento endovascolare nuove e le basi molecolari di aneurisma biologia in un standardizzata e poco costosomodo. Innesti standardizzati per mezzo di forma, dimensione, e la geometria vengono raccolte da aorta toracica discendente di un topo donatore e poi trapiantato a un destinatario ratto singenici. Gli aneurismi sono suturati end-to-side con continui o interrotti 9-0 suture in nylon per l'aorta addominale sottorenale.

Presentiamo passo-passo le istruzioni procedurali, le informazioni sulle attrezzature necessarie, e discutiamo importanti dettagli anatomici e chirurgici per il successo creazione microchirurgico di un aneurisma aortico fianco nel ratto.

Introduzione

La rottura di un aneurisma sacciforme dell'arteria cerebrale provoca emorragia pericolosa per la vita che porta a ictus, danni neurologici permanenti, o la morte. La rottura può essere prevenuta o clipping microchirurgica o endovascolare dell'aneurisma occlusione. Non è stato ancora istituito un trattamento medico per prevenire la crescita dell'aneurisma e la rottura.

Sono necessari modelli sperimentali per aneurismi sacciformi per studiare la biologia degli aneurismi arteriosi e per la sperimentazione di dispositivi terapeutici e le strategie. Per questi scopi, diversi modelli in diverse specie sono stati sviluppati e pubblicati ^1. Modelli aneurisma più grandi in maiali, cani e conigli sono preferibilmente utilizzati per testare le innovazioni endovascolari in architettura complessa aneurisma ^1,2. Modelli murini aneurisma, d'altro canto, consentono test domande di ricerca di specie geneticamente modificate ^3,4 e facilitare il chiarimento di aneurisma biologia a livello cellulare e molecolarelivello molto meglio di specie più grandi ^1. Anche se endovascolare trans-carotideo e la distribuzione dispositivo trans-iliaca è limitato ai ratti più grandi (> 400-500 g) e stent più piccolo di 2,0 mm e 1,5 mm di diametro di ^5,6, stent possono anche essere collocati attraverso l'inserimento diretto nel dell'aorta addominale segmento di ospitare gli aneurismi sperimentali. Impieghi precedenti utilizzando il ratto microchirurgico addominale fianco aortico modello aneurisma dimostrato la sua fattibilità in dispositivi embolici test romanzo e il suo uso nello studio delle basi molecolari di aneurisma biologia ^3,7.

Molti dei modelli sperimentali aneurisma sacciforme attualmente pubblicati richiedono costose attrezzature, ambienti particolari (ad esempio sale operatorie sterili con capacità di fluoroscopia), la competenza radiologia interventistica, o l'uso di specie costosi. Questi requisiti limitano l'uso diffuso di questi modelli, e portano a l'uso di modelli diversi in diversi laboratori, che mfiocchi confronto dei dati e meta-analisi di difficile, se non impossibile. Un modello sperimentale semplice, robusto ed economico è necessario come strumento standardizzato che può essere utilizzato in modo standardizzato in vari laboratori al fine di ottenere risultati comparabili da varie istituzioni. A questo scopo, abbiamo creato l'aorta fianco arteriosa sacculare modello aneurisma ratto.

Lo scopo di questo rapporto è quello di presentare passo-passo le istruzioni procedurali, le informazioni sulle attrezzature necessarie, e per discutere importanti caratteristiche anatomiche e chirurgiche per il successo creazione microchirurgico di aneurismi aortici addominali laterali nel ratto.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

NOTA: Maschio ratti Wistar (media di peso corporeo: 356 ± 44 g; 10-14 settimane di età) sono stati alloggiati in camera animali a 22-24 ° C e dodici ore di luce / buio ciclo con libero accesso a pellet dieta, acqua di rubinetto normale e ha anche ricevuto la cura umana, in conformità con le linee guida istituzionali. Gli esperimenti sono stati esaminati e approvati dal Comitato per il benessere degli animali presso l'Università di Helsinki, Finlandia.

NOTA: Nella seguente dimostrazione nostro metodo chirurgico è il seguente: Anestetizzare ratto mediante iniezione sottocutanea peso adattato di medetomidina cloridrato (0,5 mg / kg) e iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (50 mg / kg). Test per la mancanza di un riflesso punta pizzico per confermare che il ratto sia completamente anestetizzato. Applicare una pomata occhio, agganciare il sito chirurgico, e pulire la pelle con un disinfettante adatto, per esempio clorexidina, sia in alcool o acqua. Lavarsi le mani, indossare indumenti protettivi, un coperchio testa e visomaschera e guanti chirurgici sterili. Avere un aiuto chirurgico assistente nel mantenere condizioni asettiche chirurgia e per documentare le caratteristiche chirurgiche (come elencato nella tabella 1). Monitorare la profondità dell'anestesia ogni 15 minuti durante l'intervento seguendo frequenza respiratoria, frequenza cardiaca, e la reazione alla stimolazione nociva (tep pinch test). L'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,03 mg / kg) è stato dato per l'analgesia postoperatoria e ripetuto, se necessario, ogni 12 ore.

1 Hardware, Materiali di consumo, e Posizionamento

1. Tenere il piccolo animale sala operatoria tranquilla, asettica, e mantenere la temperatura ambiente a 23 +/- 3 ° C. Per eseguire l'intervento chirurgico aneurisma sperimentale la seguente attrezzatura minima necessaria:
   1. Utilizzare un tavolo microscopio operatorio perfettamente equipaggiato con un ambito assistente e la fotocamera microscopio digitale. Utilizzare superficie non porosa operativo riutilizzabile e lavabile superficie strumento per proteggere il banco di laboratorio.
   2. Preparare materiali di consumo come disinfettanti cutanei, soluzione salina fisiologica, tamponi di garza più piccoli e più grandi e materiale di sutura tra cui 9-0 micro-suture, un non-assorbibile 5-0 e 3-0 sutura assorbibile.
   3. Utilizzare i seguenti strumenti chirurgici standard: forbici chirurgiche, pinze tessuto, spalmatore di tessuti molli o auto-divaricatore, e due pinze chirurgiche Mosquito.
   4. Utilizzare un set di base microchirurgico strumento che include: supporto microneedle curva, una curva e due microforceps dritti, e un microscissor dritti o curvi.
   5. Mantenere gli strumenti di microchirurgia in un piatto di rene riempito con soluzione salina sterile per mantenere lo strumento non colloso e pulite durante l'intervento chirurgico. Il piatto di rene è imbottita con materassino di gomma o un guanto chirurgico per evitare di danneggiare le punte dei micro-strumenti. Assicurarsi che tutte le forniture sono sterili e la procedura viene eseguita con tecnica asettica secondo le attuali raccomandazioni per la chirurgia sopravvivenza su animali di laboratorio ^8-10.
   6. Inoltre, utilizzare una clip applicatore vascolare e tre pinze vascolari temporanei atraumatica. È importante che i morsetti utilizzati hanno un potere di chiusura bassa per evitare lesioni alla parete molto sottile dell'aorta di ratto. Anche preparare un righello con barre di mezzo millimetro di scala, un piccolo pad di gomma colorata, e un ago corto smussato.
   7. Mettere i ratti in posizione supina, immobilizzare sia anteriori e posteriori zampe con nastro adesivo chirurgico senza applicare tratto o compressione per la pelle, e piegare la schiena con un pennarello o una penna di spessore cauterizzazione ponendolo sotto la zona lombare della schiena. È importante ottenere quante lordosi della colonna vertebrale lombare possibile al fine di migliorare l'esposizione retroperitoneale e accesso alla sottorenale che facilita anastomosi microchirurgica. Questo posizionamento è consigliato per la creazione di aorta addominale aneurisma ma non necessaria per la raccolta graft toracico.

2. innesto raccolta

1. Uanestesia generale nder, aprire la cavità toracica (start innesto tempo di ischemia). Applicare un pizzico punta nociva per confermare che il ratto non risponde prima di procedere con i seguenti passi. Tagliare attraverso la parete addominale midventral, identificare il diaframma appena sopra il fegato, e tagliare il tessuto connettivo nella parte inferiore del diaframma per consentire l'accesso alla gabbia toracica. Con forbici grandi, lato smussato verso il basso, tagliano costole solo uno centimetro a destra ea sinistra della linea mediana gabbia toracica e aprire la cavità toracica. I polmoni sono mobilitati per il lato destro del cuore. Sacrifica i ratti da sovradosaggio con iniezione intracardiaca di ketamina tronco hydrochloride.Pulmonary, vena succlavia sinistra, sinistra cranica vena cava, e la vena azygos interferire con la raccolta dell'aorta toracica prossimale.
2. Caudale per le vene prominenti c'è un buon punto di ingresso per iniziare la dissezione dell'aorta toracica discendente utilizzando micro-forbici e microforceps.
3. Tracciare l'aorta toracica back dalla parete dorsale del torace verso l'alto per l'arco aortico delicatamente retrazione schietto e dissezione con la pinza chirurgica Mosquito.
4. Morsetto e poi tagliare le vene con le forbici. Mantenere i morsetti sulle vene e utilizzare come un divaricatore per esporre l'arco aortico sottostante.
5. Posizionare un non assorbibile 6-0 legatura di seta appena sopra la prima arteria intercostale lasciando l'aorta.
6. Tagliare l'aorta discendente appena sotto l'arteria succlavia sinistra e poi sotto la legatura. Trimming può essere realizzata in modo da ottenere una geometria aneurisma standardizzato perpendicolare, o se necessario, per ottenere un determinato angolo tra l'asse del aneurisma e l'aorta. Misurare l'innesto nella sua larghezza e lunghezza.
   NOTA: Raccolta innesti possono sia essere immediatamente trapiantate in ratti riceventi o ulteriormente elaborati per ottenere decellularization della parete dell'innesto. Innesti decellularized possono essere conservati a -4 gradi Celsius fino a re-impianto in un secondo momento (Figura 1). The decellularization della parete dell'aneurisma ha dimostrato di predisporre l'aneurisma per ingrandire ^11.

3 Graft Decellularization

1. Innesti donatori congelare in tampone fosfato a -4 ° C.
2. Il giorno successivo, scongelare gli innesti, sciacquare con acqua depurata e deionizzata a temperatura ambiente, e incubare per 10 ore a 37 ° C nel 0,1% sodio dodecil solfato.
3. Infine, lavare gli innesti solfato trattati con sodio dodecil tre volte con agitazione, ricongelare in tampone fosfato, e mantenerlo a -4 ° C fino al momento dell'uso.

4. Aneurisma Creation

1. Dissezione della Aorta addominale
   1. Dopo che l'animale è stato anestetizzato, agganciare il pelo dal sito chirurgico e pulire la pelle con un disinfettante idoneo. Test per la mancanza di una risposta toe-pinch prima incisione cutanea. Avviare l'incisione prossimale 1cm a genitali in posizione midventral (ora di inizio dell'operazione). Separare con cura la pelle dai muscoli sottostanti. Fine dissezione 1-2 centimetri sotto lo sterno.
   2. Cautela ma con decisione tirare i muscoli addominali sottostanti per evitare danni agli organi sottostanti. Estrarre il taglio longitudinale lungo la linea alba verso l'alto per il processo xifoideo e terminare in direzione caudale a livello della vescica.
   3. Esercitare una leggera pressione sulla vescica per svuotarla al fine di agevolare l'accesso allo spazio retroperitoneale.
   4. Spostare l'intestino tenue e il cieco di primo piano a destra oa sinistra. Identificare l'intestino crasso e cioè del colon discendente in basso a sinistra della cavità addominale.
   5. Tagliare il legamento tra tenue e il colon discendente in direzione craniale per consentire più ampia esposizione della parete dorsale del corpo. Posizionare un divaricatore auto-mantenendo per contenere le viscere a parte.
   6. La posizione ideale di end-to-side aneurisma anastomosi is trova al livello tra la renale e ileolombare vene. L'aorta addominale si trova retroperitoneale incorporato nel tessuto adiposo. Durante la dissezione prestare particolare attenzione alle coppie di quasi trasparenti ureteri e vasi testicolari.
   7. Se è necessaria ulteriore retrazione di intestino, utilizzare grandi garza swap. La lordosi della colonna lombare indotta durante il posizionamento mettendo una penna cauterizzazione o un oggetto simile sotto la parte posteriore inferiore del ratto, riduce significativamente la necessità di intestino retrazione.
   8. La superficie ventrale della parete dorsale del corpo è coperto con una peritoneo parietale sottile. Una volta che questo viene aperto, visualizza l'aorta appena sotto. Durante attenta dissezione acuta e smussato dell'aorta addominale dalle grandi vene adiacenti cogliere solo l'avventizia per evitare danni alla parete del vaso.
   9. Raramente, piccole arterie lombari nascono come vaso segmentale dalla superficie dorsale dell'aorta addominale e interferiscono con la preparazione. Legatura e taglio della nave è needed per evitare stillicidio retrograda durante aneurisma sutura. L'utilizzo di curve micro-pinza può facilitare il posizionamento legatura in profondità.
2. End-to-side Anastomosi
   1. Mettere un pad in gomma colorata sotto l'aorta addominale e rivestire con un piccolo tampone di garza. Rimuovere tessuto connettivo lasso e avventizia a livello del sito di anastomosi previsto.
   2. Bloccare l'aorta addominale distale al anastomosi prima, poi prossimale (ora di inizio clampaggio aortico). Questo assicura un riempimento fermo della nave e facilita la successiva arteriotomia.
   3. Eseguire il arteriotomia utilizzando sia micro-forbici diritte o curve. Un micro-pinza detiene un pezzo molto piccolo della parete del vaso di ritagliare una forma ellittica.
   4. Lavare accuratamente l'arteria con soluzione fisiologica in entrambe le direzioni utilizzando un ago a punta smussata.
   5. Mettere i primi due punti di sutura di questo anastomosi end-to-side alla fine prossimale e distale del arteriotomia (ora di inizio anastomosi). Evitare di afferrare della parete dei vasi con le micro-pinza quando possibile. Assicurarsi che ogni sutura viene inserito attraverso tutti gli strati della parete del vaso.
   6. Eseguire la sutura sia come suture continue o interrotte. Se si sceglie di sutura interrotta poi posizionare il retro nove o`clock sutura prima. Suture successive possono essere distanziate di partenza adiacente al primo sutura. Afferrare con attenzione l'avventizia. Evitare qualsiasi spremitura / afferrare dell'intima.
   7. Quando la parete di fondo è finito, controllare la parte endoluminale della anastomosi per suture fuori luogo. Eseguire le stesse procedure nello stesso ordine dal lato anteriore. Assicurarsi che la prima di un totale di tre nodi per sutura è duro ma non troppo stretto.
3. Emostasi e chiusura
   1. Dopo la fine di anastomosi lato è completata (tempo di anastomosi termino), sciacquare il sito con soluzione salina e rimuovere il morsetto distale prima per consentire il riflusso (fine aortica serraggio tempo e la fine del trapianto ischemia time).
   2. Se l'emorragia evidente si verifica da riflusso un punto in più può essere necessaria (tempo di emostasi cominciare). In caso di stillicidio minore, ottenere emostasi con una leggera pressione sul sito di sanguinamento con un piccolo pezzo di un tampone di garza.
   3. Rimuovere il morsetto vascolare prossimale, sciacquare il sito anastomosi una volta di più, e tagliare le rimanenti estremità della legatura alla cupola aneurisma.
   4. Confermare pervietà dell'aneurisma mediante l'osservazione di aumento di volume dell'aneurisma durante il picco dell'onda di polso arterioso. Valutare distale dell'arteria addominale pervietà attraverso la diretta "test di mungitura".
   5. Rimuovere il foglio di plastica e il piccolo tampone di garza sotto. Il vortice di sangue pulsante all'interno dell'aneurisma creato è chiaramente visibile.
   6. Coprire linee di sutura intorno alla anastomosi con piccoli pezzi di tessuto adiposo o Spongostan per emostasi supplementare se piccolo stillicidio è ancora presente (ora di fine della emostasi).
   7. Rimuovere i tessuti molli spalmatore e tamponi di garza.Posizionare l'intestino tenue, il cieco, e la massa grassa di nuovo nella loro posizione corretta.
   8. Chiudere i muscoli addominali della linea mediana con 5-0, 4-0, o 3-0 suture riassorbibili o non riassorbibili seguiti da pelle chiusura della ferita con tecnica di sutura continua con 3-0 sutura riassorbibile polifilamento (tempo di funzionamento di fine). Nota: Nella nostra esperienza ratti tollerati suture riassorbibili pelle meglio di suture monofilamento non assorbibili.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Una serie pilota composto da 14 ratti. Successivamente un totale di 84 animali sono stati operati in base al protocollo presentato per diversi progetti di ricerca tra marzo e settembre 2012. Altri 29 animali servivano come donatori per innesti sacculari arteriosi. I restanti esperimenti sono stati eseguiti utilizzando innesti pre-trattati raccolti e conservati da precedenti esperimenti utilizzando ratti dello stesso sesso, ceppo, peso ed età.

Il peso corporeo, tempo complessivo di funzionam...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

I progressi nella nostra comprensione della complessa biologia di sacciforme dell'arteria cerebrale aneurisma dipende analisi dei dati epidemiologici e clinici, integrati da studi di laboratorio su campioni di pazienti e lavori sperimentali in modelli animali ^3,12,13.

Piccoli animali come il topo sono intrinsecamente associati a minori costi di esperimenti e abitazioni, e la necessità di attrezzature specializzate ridotti. Un tempo medio di funzionamento totale di meno di 60 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine			Any genericon
Ketamin			Any genericon
Buprenorphine			Any genericon
Phosphate buffered saline
Sodium dodecyl sulfate (0.1%)
3-0 resorbable suture	Ethicon Inc., USA	VCP824G
5-0 non absorbable suture	Ethicon Inc., USA	8618G
6-0 non absorbable silk suture	B. Braun, Germany	C0761060
9-0 nylon micro suture	B. Braun, Germany	G1118471
Spongostan	Ethicon Inc., USA	MS0002
Operation microscope	Leica , Germany	M651
Digital microscope camera	Sony, Japan	SSC-DC58AP
Standard surgical instruments	B. Braun, Germany	Multiple	See protocol 1.4
Microsurgical instruments	B. Braun, Germany	Multiple	See protocol 1.5
Vascular clip applicator	B. Braun, Germany	FT495T
Temporary vascular clamps	B. Braun, Germany	FT250T
Graph Pad Prism statistical software	GraphPad Software, San Diego, California, USA		V 6.02 for Windows