Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

Resumen

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Resumen

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

Introducción

Exosomas urinario son pequeñas vesículas internas de 100 nm de los cuerpos multivesiculares (MVB) derivados de todos los tipos de células en condiciones normales y patológicas en el espacio urinario incluyendo podocitos glomerulares, células del túbulo renal y las células que revisten los sistemas de drenaje urinario que parecen ser enriquecido para miRNAs ^{1 -2.} Muchos investigadores han detectado proteínas distintas en exosomas aislados de la orina de individuos sanos, así como aquellos con insuficiencia renal y / o enfermedades sistemáticas ^3-5. Los exosomas se pueden aislar utilizando diferentes métodos, tales como de dos etapas de ultracentrifugación diferencial con o sin sacarosa ^6-7, la combinación de filtro nanomembrana con ultracentrifugación ^{8-9, 10-11} o precipitación. Recientemente hemos desarrollado un método simple, rápido, escalable y eficaz para aislar exosomas urinario y detectar miRNA y biomarcadores de proteínas ^11. Aunque los biomarcadores pueden ser detectados en una variedad de diferentes fluidos biológicos, urine es la opción más conveniente para los pacientes con enfermedades de los riñones y del tracto urinario, ya que puede obtenerse en grandes cantidades de una manera relativamente no invasiva.

Aunque existen varios métodos para aislar exosomas urinario ^6-11, el procedimiento más comúnmente utilizado depende de ultracentrifugación diferencial con un colchón de sacarosa al 30%. Si bien este método es eficiente y la calidad de los exosomas resultantes aisladas con este procedimiento es alto, la técnica en sí requiere de personal capacitado y consume mucho tiempo, que requiere varios pasos de ultracentrifugación. Otros métodos, tales como filtración y precipitación, se han desarrollado para el aislamiento de exosomas, incluyendo uno que utiliza un reactivo de precipitación de propiedad (es decir, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Aunque precipitación usando este reactivo es rápido y relativamente fácil, la pureza de los exosomas aislados es baja en comparación con la ultracentrifugación metod. Recientemente nos comparamos seis métodos para el aislamiento de los exosomas urinario, incluyendo una modificación del método de precipitación usando ExoQuick-TC que hemos desarrollado en nuestro laboratorio ^11. Encontramos que este método de precipitación modificado produjo mayores cantidades de proteína, miRNA y los ARNm y el procedimiento en sí era más rápido y más fácil de implementar que ultracentrifugación. Aquí se describe el protocolo experimental de nuestro método de precipitación modificado de una manera gradual, e incluir un análisis de las ventajas y desventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de aislamiento exosome. El método de precipitación modificada implica una precipitación inicial de partículas de exosoma, seguido de la eliminación de la proteína de Tamm-Horsfall, que se correlaciona con las proteínas exosomal, y se sabe que reducir el rendimiento exosome de la orina. Se encontró que estas modificaciones aumentan el rendimiento y la pureza de la preparación exosomal de la orina.

Protocolo

NOTA:. Los pasos implicados en el aislamiento de los exosomas urinarios utilizando el método de precipitación modificado se ilustran en la Figura 1 Los primeros pasos implican la eliminación de grandes células muertas y los desechos celulares por centrifugación. El sedimento final obtenido a partir del sobrenadante recogido de cada paso subsiguiente corresponde a la exosome, que se disuelve en solución de aislamiento para una mayor extracción de proteína, ARN y ADN.

1. Recolección de orina

1. Antes de la recogida de orina, preparar cóctel inhibidor de proteasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante y añadir 3,125 ml de este cóctel a un receptáculo estéril vacía. El tubo que contiene el cóctel inhibidor de la proteasa se puede distribuir a los voluntarios para la recogida de orina.
   NOTA: La razón de la adición de inhibidor de la proteasa es reducir al mínimo la degradación de proteínas en la muestra de orina. Aunque hemos utilizado específicamente un cóctel inhibidor de la proteasa deSigma, otros inhibidores de la proteasa comercialmente disponibles pueden ser sustituidos.
2. Recoger aproximadamente 10 ml de orina de primera evacuación. Procesar la orina inmediatamente después de la recolección sin almacenamiento o refrigeración. Aislar los exosomas urinario en duplicado utilizando el método de precipitación modificado; uno de los duplicados es para el ADN, el ARN total y la extracción de proteína, mientras que el otro es para la cuantificación de partículas de exosoma urinario.
   NOTA: Una muestra de orina de 24 horas se pueden recoger para el aislamiento exosome mediante el almacenamiento a 4 ° C.

2. La eliminación de los restos celulares y Tamm-Horsfall Proteína (THP)

1. Transferir las muestras de orina de 15 ml tubos de centrífuga. Centrifugar 10 ml de orina a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar las células y los residuos celulares (Figura 1).
2. Con una pipeta, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para su posterior procesamiento. Resuspender el precipitado en 500 l de solución de aislamiento (sacarosa 250 mM, 10 mM prueba lasanolamine, pH 7.6) seguido de 10 min de incubación con DL-ditiotreitol (DTT: concentración final de 200 mg / ml) a 37 ° C.
   NOTA: la TDT se añade para degradar THP, que atrapa los exosomas, lo que lleva a la disminución de los rendimientos. Tenga cuidado de dejar el pellet inalteradas durante la transferencia del sobrenadante, y confirme que el sobrenadante esté libre de pellets.
3. Muestras de pellets Vortex cada 2 minutos hasta que la pastilla se disuelva completamente. A continuación, añadir 500 l de solución de aislamiento al sedimento disuelto.
4. Inmediatamente después de la adición de solución de aislamiento al sedimento, se centrifuga a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipetear el sobrenadante y se combinan con el sobrenadante recogido antes.
5. Resuspender el precipitado en 50 l de solución de aislamiento para el análisis de SDS-PAGE.
   NOTA: PBS o TBS se pueden utilizar en lugar de solución de aislamiento para resuspender el pellet.

3. Aislamiento de exosome Pellet

1. Para 11 ml de la supern recogidaatant, añadir 3,3 ml de reactivo de ExoQuick-TC y se incuba a 4 ° C durante al menos 12 h.
   NOTA: La relación de volumen de sobrenadante a reactivo ExoQuick-TC se puede ajustar para aumentar o disminuir el rendimiento exosomal. Hemos observado que menores volúmenes de reactivo añadido producen rendimientos más pequeños de exosomas.
2. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla de muestra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
3. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo para el análisis SDS-PAGE.
4. El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C para el ADN, el ARN y la extracción de proteínas y cuantificación de las partículas de exosoma usando ELISA ¹¹ CD9.
   NOTA: El sedimento exosome se puede almacenar a -80 ° C durante 1 año con la congelación y descongelación limitada.

4. La detección de biomarcadores y Análisis de exosome Pellet

1. Para los análisis corriente abajo, extraer el ADN, ARN y proteínas a partir del sedimento usando el exosome / ARN / kit de aislamiento de proteínas de ADN y un ki aislamiento de ARNt de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Determinar las concentraciones utilizando un espectrofotómetro Nanodrop midiendo la absorbancia a 260 y 280 nm con 2 l de muestra.
2. Realizar cuantitativa en tiempo real RT-PCR (qPCR) utilizando ensayos TaqMan microARN (en nuestro caso, hemos utilizado miR-192- y 1207-5p específicas MIR ensayos humanos) o cebadores miRNA-específicos.
3. Para el análisis de SDS-PAGE, usar 4-12% de gel de Bis-Tris y muestras de proteínas separadas por electroforesis unidimensional. Visualizar geles utilizando el kit de tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
4. Realizar análisis de transferencia de Western usando membranas de PVDF de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Use anticuerpo policlonal de conejo a la apoptosis ligada al gen-2 interactuando proteína X o ALIX y anticuerpo monoclonal de ratón a genes de susceptibilidad tumoral 101 proteína o TSG101 en la detección de Western blot. Cuantificar la densidad de las bandas por el libre acceso software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) oun programa similar.
5. Cuantificar el número de partículas de exosoma urinarios obtenidos usando un kit de ELISA CD9 según las instrucciones del fabricante.

Resultados

Exosomas urinarios llevan proteínas, miRNA y de ARNm biomarcadores secretadas por las células epiteliales renales. El aislamiento y la detección de estos exosomas pueden proporcionar una herramienta de diagnóstico útil para la detección precoz de enfermedades renales tales como la nefropatía diabética. Hay varios métodos para el aislamiento de exosomas a partir de muestras de orina recogidas de sujetos humanos. Anteriormente comparamos seis métodos de aislamiento exosome orina y se investigaron resultante de p...

Discusión

La mayoría de los métodos que implican la precipitación de exosomas de la orina no se ocupan de la eliminación de la red polimérica formada por la proteína de Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente en grandes cantidades en la orina, donde supuestamente trampas exosomas durante la centrifugación inicial baja velocidad. En nuestro método modificado redujimos THP utilizando la TDT antes de la precipitación exosome. Como se muestra en la Figura 2, se observó una mayor cantidad de THP e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Centrifuge Tube	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuge	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	used at final concentration of 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	For SDS-PAGE analysis
ECL Advance Western blotting detection kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	For western blot detection of biomarkers
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	For exosome isolation
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	For exosome quantification
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit	Qiagen	80004	For DNA, RNA, Protein isolation
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific		For Protein Quantification
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	For staining SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Life Technologies		For running the SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays	Life Technologies		For RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software	Biogazelle NV		For analysis of RT-PCR assay data
Rabbit polyclonal antibody to ALIX	Millipore		For western blot detection of biomarkers
Mouse monoclonal antibody to TSG101	Abcam		For western blot detection of biomarkers