Um método de precipitação de modificação para isolar exossomas urinária

Resumo

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Resumo

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

Introdução

Exosomes urinário são pequenas vesículas internas de 100 nm de corpos multivesiculares (MVB) derivados de todos os tipos de células em condições normais e patológicas no espaço urinário incluindo podocytes glomerular, células tubulares renais e células que revestem os sistemas de drenagem urinária que parecem ser enriquecido para miRNAs ^{1 -2.} Muitos investigadores detectaram proteínas distintas em exossomas isoladas a partir da urina de indivíduos saudáveis, bem como aqueles com insuficiência renal e / ou doenças sistemáticas ^3-5. Os exossomas podem ser isoladas utilizando métodos diferentes, tais como de dois passos de ultracentrifugação diferencial com ou sem sacarose ^6-7, combinando filtro nanomembrane com ultracentrifugação ^{8-9, 10-11} ou precipitação. Recentemente, desenvolveu um método simples, rápido, escalável e eficaz para isolar exossomos urinárias e detectar miRNA e biomarcadores de proteínas ^11. Embora biomarcadores pode ser detectada numa variedade de diferentes fluidos biológicos, urina é a escolha mais conveniente para os doentes com doenças do rim e do tracto urinário, porque pode ser obtido em grandes quantidades de forma relativamente não invasivo.

Embora existam vários métodos para isolar exossomas urinário ^6-11, o processo mais vulgarmente usado depende ultracentrifugação diferencial com uma almofada de sacarose a 30%. Enquanto este método é eficiente e a qualidade das resultantes isolados exossomas com este procedimento é alta, a técnica em si requer pessoal especializado e é, que exige vários passos de ultracentrifugação demorado. Outros métodos, tais como filtração e precipitação, têm sido desenvolvidos para o isolamento de exossomas, incluindo um que utiliza um reagente de precipitação proprietário (ou seja, ExoQuick-TC: Biosciences sistema; Mountain View, CA). Embora a precipitação utilizando este reagente é rápido e relativamente fácil, a pureza dos isolados exossomas é baixa em comparação com o met ultracentrifugaçãood. Recentemente, em comparação seis métodos para o isolamento de exossomas urinário, incluindo uma modificação do método de precipitação utilizando ExoQuick-TC que nós desenvolvemos no nosso laboratório ^11. Descobrimos que este método de precipitação modificada produziu maiores quantidades de proteína, miRNA e mRNAs e o procedimento em si foi mais rápido e mais fácil de implementar do que ultracentrifugação. Aqui, nós descrevemos o protocolo experimental do nosso método de precipitação modificado de forma gradual, e incluem uma discussão sobre as vantagens e desvantagens da técnica em comparação com outros métodos de isolamento de exossomas. O método envolve uma precipitação modificado precipitação inicial de partículas de exossoma, seguido de remoção de proteína Tamm-Horsfall, que está correlacionada com proteínas exosomal, e conhecido por reduzir a produção de urina a partir de exossoma. Descobrimos que essas modificações aumentaram o rendimento e a pureza da preparação exosomal a partir de urina.

Protocolo

NOTA:. As etapas envolvidas no isolamento dos exossomas urinário, utilizando o método de precipitação modificados são ilustrados na Figura 1 Os passos iniciais envolvem a remoção de grandes células mortas e detritos celulares por centrifugação. O sedimento final obtido a partir do sobrenadante recolhido a partir de cada etapa subsequente corresponde à exosoma, que é dissolvido em solução de isolamento por extracção adicional da proteína, ARN, e ADN.

1. Coleta de Urina

1. Antes da recolha de urina, cocktail inibidor de protease de preparar de acordo com as instruções do fabricante e adicionar 3,125 ml de este cocktail para um receptáculo vazio e estéril. O tubo contendo a mistura de inibidores de protease pode então ser distribuída aos voluntários para a recolha de urina.
   Observação: A razão para a adição de inibidor de protease é o de minimizar a degradação das proteínas na amostra de urina. Apesar de termos usado especificamente um cocktail inibidor de protease deSigma, outros inibidores de protease disponíveis comercialmente pode ser substituído.
2. Recolher cerca de 10 ml de urina primeiro-void. Processar a urina imediatamente após a coleta, sem armazenamento ou refrigeração. Isolar os exossomos urinário em duplicata, utilizando o método de precipitação modificado; um de ambos os resultados para o DNA, o RNA total e a extracção de proteínas, enquanto que o outro é para a quantificação de partículas de exossoma urinário.
   NOTA: Uma amostra de urina de 24 horas pode ser recolhida para o isolamento exosome armazenando a 4 ° C.

2. remoção de restos celulares e Tamm-Horsfall Protein (THP)

1. Transferir as amostras de urina para tubos de centrífuga de 15 ml. Centrifugar 10 ml de urina em 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C para eliminar as células e os resíduos celulares (Figura 1).
2. Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo fresco para processamento adicional. Ressuspender o sedimento em 500 ul de solução de isolamento (250 mM de sacarose, 10 mM que provaanolamine, pH 7,6) seguido por 10 min de incubação com DL-ditiotreitol (DTT: concentração final de 200 mg / ml) a 37 ° C.
   NOTA: DTT é adicionado para degradar THP, que aprisiona exossomos, levando à diminuição da produtividade. Tome o cuidado de deixar o pellet imperturbável durante a transferência do sobrenadante, e confirmar que o sobrenadante é claro de pellet.
3. De amostras de sedimentos de vórtice cada 2 min, até o pelete estar completamente dissolvido. Em seguida adicionar 500 ul de solução de isolamento para o sedimento dissolvido.
4. Imediatamente após a adição da solução de isolamento para o sedimento, centrifugar a 17.000 xg durante 10 min a 37 ° C. Pipeta-se o sobrenadante e combinam-se com o sobrenadante recolhido anteriormente.
5. Ressuspender o sedimento em 50 ul de solução de isolamento por análise de SDS-PAGE.
   NOTA: PBS ou TBS pode ser usado em vez de solução de isolamento para ressuspender o sedimento.

3. Isolamento de exossomo Pellet

1. Para 11 ml do supern recolhidosatant, adicionar 3,3 ml de reagente ExoQuick-TC e incubar a 4 ° C durante pelo menos 12 horas.
   NOTA: O índice de volume de sobrenadante de reagente ExoQuick-TC pode ser ajustada para aumentar ou diminuir o rendimento exosomal. Observou-se que volumes menores de reagente adicionado produzir rendimentos menores de exossomos.
2. Após a incubação, centrifugar a mistura amostra / ExoQuick-TC a 10.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
3. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco para a análise de SDS-PAGE.
4. O sedimento de exossoma pode ser armazenado a -80 ° C para o ADN, ARN e proteína de extracção e quantificação de partículas de exossoma utilizando ELISA CD9 ^11.
   NOTA: O sedimento exossoma pode ser armazenado a -80 ° C durante 1 ano com a congelação e descongelação limitada.

4. detecção e análise de exossomo Pellet Biomarker

1. Para as análises a jusante, extrair DNA, RNA e proteínas a partir do sedimento exossoma utilizando o / ARN / ADN kit de isolamento de proteína e um ki de isolamento de ARNt de acordo com as instruções do fabricante. Determinar as concentrações por espectrofotometria Nanodrop medindo a absorvância a 260 nm e 280 nm com 2 ul de amostra.
2. Realizar quantitativa em tempo real de RT-PCR (qPCR) utilizando ensaios microRNA TaqMan (em nosso caso, foi utilizada humanos miR-192- e específicos miR-1207-5p-ensaios) ou iniciadores específicos de miARN.
3. Para a análise de SDS-PAGE, 4-12% usar Bis-Tris gel e amostras de proteínas separadas por electroforese unidimensional. Visualizar géis utilizando o kit de coloração com prata de acordo com as instruções do fabricante.
4. Realizar a análise de Western blot utilizando membranas de PVDF de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Use anticorpo policlonal de coelho para ligados a apoptose gene-2 ​​interagindo proteína X ou ALIX e anticorpo monoclonal mouse para gene de susceptibilidade tumor 101 proteína ou TSG101 na detecção de western blot. Quantificar a densidade das bandas de acesso aberto software NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ouum programa semelhante.
5. Quantificar o número de partículas de exossoma urinários obtidos utilizando um kit de ELISA CD9, conforme as instruções do fabricante.

Resultados

Exosomes urinário transportar proteínas, miRNA e mRNA biomarcadores secretadas a partir de células epiteliais renais. O isolamento e detecção destes exossomas podem fornecer uma ferramenta de diagnóstico útil para a detecção precoce de doenças renais tais como nefropatia diabética. Existem vários métodos para o isolamento de exossomas a partir de amostras de urina colhidas de indivíduos humanos. Anteriormente, em comparação seis métodos de isolamento exosome urina e investigados resultante de proteína,...

Discussão

A maioria dos métodos que envolvem a precipitação de exossomas a partir de urina não abordam a remoção da rede polimérica formada pela proteína Tamm-Horsfall (THP). Esta proteína está presente em grandes quantidades na urina, onde entra em armadilhas putativamente exossomas inicial durante a centrifugação a baixa velocidade. Em nosso método modificado reduzimos THP usando DTT antes da precipitação exosome. Como mostrado na Figura 2, uma quantidade mais elevada de THP foi observado na urin...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Centrifuge Tube	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuge	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	used at final concentration of 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	For SDS-PAGE analysis
ECL Advance Western blotting detection kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	For western blot detection of biomarkers
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	For exosome isolation
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	For exosome quantification
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit	Qiagen	80004	For DNA, RNA, Protein isolation
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific		For Protein Quantification
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	For staining SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Life Technologies		For running the SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays	Life Technologies		For RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software	Biogazelle NV		For analysis of RT-PCR assay data
Rabbit polyclonal antibody to ALIX	Millipore		For western blot detection of biomarkers
Mouse monoclonal antibody to TSG101	Abcam		For western blot detection of biomarkers