Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Özet

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Özet

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

Giriş

İdrar eksozomlar miRNA'ların ¹ zenginleştirilmiş görünmektedir idrar drenaj sistemlerinin astar glomerüler Podositler, renal tübül hücreleri ve hücreler de dahil olmak üzere idrar alanı normal ve patolojik koşullar altında tüm hücre tipleri türetilen multiveziküler organları (MVB), 100 nm küçük bir iç veziküllerdir ^-2. Pek çok araştırmacı, sağlıklı bireylerin idrar aynı zamanda böbrek ve / veya sistematik hastalık ^3-5 olan izole eksozom belirgin proteinleri tespit ettik. Eksozomlar, ultra ^{santrifüjleme, 8-9} ya da ^10-11 çökeltme ile nanomembrane filtrenin birlikte, bu ya da sukroz ^6-7 olmaksızın iki aşamalı bir diferansiyel ultra-santrifüj gibi farklı yöntemler kullanılarak izole edilebilir. Biz son zamanlarda idrar eksozomlar izole ve miRNA ve protein biyomarkerları ¹¹ algılamak için, basit, hızlı, ölçeklenebilir ve etkili bir yöntem geliştirdik. Biyomarkerler farklı biyolojik sıvıların çeşitli tespit edilebilir olsa da, urine nispeten invazif olmayan bir şekilde büyük miktarlarda elde edilebilir, çünkü, böbrek ve idrar yolu hastalıkları olan hastalar için uygun bir seçimdir.

Idrar eksozomlar ^6-11 izole etmek birkaç yöntem olmasına rağmen, en yaygın kullanılan prosedür% 30 sukroz yastık ile diferansiyel Ultrasantrifügasyon bağlıdır. Bu yöntem etkili değildir ve bu yönteme izole elde edilen eksozom kalitesi yüksek olsa da, teknik kendisi uzman personel gerektirir ve zaman alıcı birçok adımları ultrasantrifügasyon, zorunlu kılmaktadır. Bu, süzme ve çökeltme gibi başka yöntemler, özel bir özelliği, çökeltme reaktifinin kullanan bir de dahil olmak üzere, eksozom izolasyonu için geliştirilmiştir (örneğin, ExoQuick-TC: Sistem Biosciences, Mountain View, CA). Bu reaktif kullanılarak yağış hızlı ve nispeten kolay olmasına rağmen, izole eksozomlann saflık Ultrasantrifügasyon meth kıyasla düşüktürod. Kısa bir süre önce laboratuarımızda ¹¹ geliştirilen ExoQuick-TC ile çökeltme yönteminin bir modifikasyonu dahil olmak üzere idrar eksozomlann izole edilmesi için altı yöntemi olarak karşılaştırılmıştır. Biz bu değiştirilmiş çöktürme yöntemi protein, miRNA ve mRNA'larının ve kendisi daha hızlı ve daha Ultrasantrifügasyon uygulamak kolay oldu prosedürün daha yüksek miktarlarda vermiştir bulundu. Burada, biz kademeli bir şekilde bizim modifiye yağış yöntemi deneysel protokol açıklar ve eksozom izolasyonu diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında bu tekniğin avantajları ve dezavantajları bir tartışma vardır. değiştirilmiş çöktürme yöntemi exosomal proteinleri ile ilişkili ve idrardan eksozom veriminin azalmasına yol açtığı bilinmektedir Tamm-Horsfall proteini ile uzaklaştırılarak elde edilmiş eksozom partiküllerinin ilk çökeltme, içerir. Biz, bu değişimler idrardan exosomal hazırlama verim ve saflıkta arttırdığı bulunmuştur.

Protokol

Not:. Modifiye çökeltme yöntemi kullanılarak idrar eksozomlann izole söz konusu olan adımlar, Şekil 1 'de gösterilmektedir, ilk adım santrifüj ile büyük ölü hücrelerin çıkarılması ve hücre artıkları içerir. Her bir sonraki aşamada toplanan kültür bakiyesinden elde edilen nihai pelet, protein, RNA ve DNA daha fazla ekstre için ayırma çözeltisi içinde eritilir eksozom tekabül eder.

İdrar 1. Koleksiyonu

1. Idrar toplama öncesinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir proteaz inhibitörü kokteyli hazırlamak ve boş steril hazne Bu kokteyl 3.125 ilave edin. proteaz inhibitörü kokteyli içeren Tüp daha sonra idrar toplama gönüllülere dağıtılabilir.
   Not: proteaz inhibitörü ilave nedeni idrar numunesi içinde bulunan proteini bozulmasını en aza indirmektir. Biz özellikle bir proteaz inhibitörü kokteyl kullanılmasına rağmenSigma, diğer ticari olarak temin edilebilen proteaz inhibitörleri ikame edilebilir.
2. İlk boşluk idrar yaklaşık 10 ml toplayın. Toplandıktan hemen sonra depolama veya soğutma olmadan idrar işleyin. Modifiye yağış yöntemini kullanarak kopya üriner eksozomlar yalıtmak; üriner eksozom partiküllerinin ölçülmesi için ise çiftleri biri, DNA, toplam RNA ve protein ekstre içindir.
   NOT: 24 saat idrar numunesi 4 ° C'de saklayarak eksozom izolasyonu için toplanabilir.

Hücre Moloz ve Tamm-Horsfall Protein 2. Kaldırma (THP)

1. 15 ml santrifüj tüplerine idrar örnekleri aktarın. Santrifüj 37 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g'de idrar 10 mi hücreleri ve hücre kalıntısını (Şekil 1) ortadan kaldırmak için.
2. Bir pipet kullanarak, daha fazla işlem için yeni bir tüpe süpernatantı aktarın. Izolasyon çözeltisi 500 ul pelletini (250 mM sakaroz, 10 mM Trietilamininnihai konsantrasyon 200 mg / ml), 37 ° C 'de DL-ditiyotreitol (DTT ile 10 dakika inkübasyon ile takip anolamine, pH 7.6).
   Not: DTT verim azalmasına yol açan, eksozomlar yakalar THP, indirgeme eklenir. Süpernatant transferi sırasında rahatsız pelet bırakmak özen, ve yüzer pelet açık olduğunu doğrulayın.
3. Vortex pelet örnekleri pelet kadar her 2 dk tamamen çözülür. Ardından çözünmüş pelet izolasyon çözeltisi 500 ul ekleyin.
4. 37 ° C, 10 dakika için 17,000 x g'de izole pelet çözeltisi santrifüj ilave edildikten sonra. Pipetleyin süpernatant ve önceki toplanan süpernatant ile birleştirmek.
5. SDS-PAGE analizi için ayırma çözeltisi 50 ul pelletini.
   Not: PBS veya TBS pelletini yerine yalıtım çözeltisi kullanılabilir.

Exosome Peleti 3. İzolasyonu

1. Toplanan supern 11 mlatant, ExoQuick-TC ayıracı 3.3 ml ilave edilir ve en az 12 saat süre ile 4 ° C'de inkübe edin.
   Not: ExoQuick-TC reaktif süpernatant hacmine oranı arttırmak veya exosomal verim azaltmak için ayarlanabilir. Bu ilave reaktif az miktarlar eksozom küçük anomerin görülmektedir.
2. Inkübasyondan sonra, santrifüj 25 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de örnek / ExoQuick-TC karışımı.
3. SDS-PAGE analizi için temiz bir tüpe süpernatant aktarın.
4. eksozom pelet, DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu ve CD9 ELISA ¹¹ kullanılarak eksozom partiküllerinin ölçümü için, -80 ° C'de saklanabilir.
   Not: eksozom pelet sınırlı dondurma ve eritme ile 1 yıl boyunca, -80 ° C'de saklanabilir.

4. Biyomarker Algılama ve Exosome Peleti Analizi

1. Alt baş analizler için, DNA / RNA / protein izolasyon kiti ve bir RNA izolasyon Ki ile eksozom topağından DNA, RNA ve protein özüüreticinin talimatlarına uygun olarak T. Örnek 2 ul 260 absorbans ve 280nm ölçerek Nanodrop spektrofotometre kullanılarak konsantrasyonlarını belirleyin.
2. Kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR (qPCR), TaqMan microRNA deneyleri kullanılarak veya miRNA-spesifik primerler (bizim durumumuzda, biz insan miR-192- ve miR-1207-5p özel deneyleri kullanılır) gerçekleştirin.
3. SDS-PAGE analizi için, tek boyutlu elektroforez ile% 4-12 Bis-Tris jel ve ayrı protein numuneleri kullanmaktadır. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, gümüş boya kitini kullanarak jeller görselleştirmek.
4. Üretici tarafından sağlanan talimatlara uygun olarak PVDF membranlar kullanılarak Western blot analizi. Western blot algılama tümör bir gen 101 protein veya TSG101 apoptoz bağlantılı gen-2 etkileşimli protein X veya Alix ve fare monoklonal antikor tavşan poliklonal antikor kullanın. Açık erişim NIH ImageJ yazılımı tarafından bantların yoğunluğu ölçmek (http://rsbweb.nih.gov/ij/) veyabenzer bir program.
5. Üreticinin talimatlarına göre bir CD9 ELISA kiti kullanılarak elde edilen idrar eksozom parçacıkların sayısını ölçmek.

Sonuçlar

İdrar eksozomlar böbrek epitel hücrelerinden salgılanan protein MiRNA ve mRNA biyolojik işaretleri taşırlar. Bu eksozomlann izolasyon ve algılama gibi diyabetik nefropati gibi böbrek hastalıklarının erken teşhisi için yararlı bir tanısal araç sağlayabilir. Insan deneklerden alınan idrar örneklerinde eksozomlann izole edilmesi için bir kaç yöntem vardır. Biz daha önce idrar eksozom izolasyon altı yöntemleri karşılaştırıldığında ve protein, mRNA ve miRNA düzeyleri ¹¹ Elde inc...

Tartışmalar

Idrardan eksozom çökelmesini içeren çok yöntem Tamm-Horsfall proteini (THP) tarafından oluşturulan polimerik ağ kaldırılmasını ele alınmamıştır. Bu protein, bu varsayımsal trans ilk düşük hızlı santrifüj içinde eksozomlar idrar, büyük miktarlarda mevcuttur. Modifiye yönteminde, sonuç eksozom çökeltme öncesinde DTT kullanılarak THP azaltmıştır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, THP, daha yüksek bir miktar, proteine ​​çıkarılmasını gösteren, son yüzer taba...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning 15 ml Centrifuge Tube	Corning (Sigma Aldrich)	CLS430791
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P8340
Centrifuge	Sorvall
DL-dithiothreitol	Sigma Aldrich	D9779	used at final concentration of 200 mg/ml
Novex NuPAGE SDS-PAGE system (4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 10 well	Invitrogen	NP0321BOX	For SDS-PAGE analysis
ECL Advance Western blotting detection kit	GE Healthcare Life Sciences	RPN2135	For western blot detection of biomarkers
Exoquick-TC Reagent	System Biosciences (SBI)	EXOTC50A-1	For exosome isolation
Exosome CD9 ELISA Complete Kit	System Biosciences (SBI)	EXOEL-CD9-A-1	For exosome quantification
AllPrep DNA/RNA/Protein mini kit	Qiagen	80004	For DNA, RNA, Protein isolation
Rneasy MinElute Cleanup kit	Qiagen	74204
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific		For Protein Quantification
ProteoSilver Sliver Stain Kit	Sigma Aldrich	PROTSIL1-1KT	For staining SDS-PAGE gels
Xcell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Life Technologies		For running the SDS-PAGE gels
TaqMan microRNA assays	Life Technologies		For RT-PCR assays
qBasePlus v1.5 software	Biogazelle NV		For analysis of RT-PCR assay data
Rabbit polyclonal antibody to ALIX	Millipore		For western blot detection of biomarkers
Mouse monoclonal antibody to TSG101	Abcam		For western blot detection of biomarkers