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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En el siguiente experimento se describe un protocolo para rastrear el miedo acondicionado en ratones. Este tipo de memoria asociativa incluye un período de seguimiento que separa el estímulo neutro y el estímulo no condicionado.

Resumen

En este experimento se presenta una técnica para medir el aprendizaje y la memoria. En el protocolo acondicionado rastrear el miedo que se presenta aquí hay cinco emparejamientos entre un estímulo neutro y un estímulo incondicionado. Hay un período de 20 segundos traza que separa cada ensayo acondicionado. En la siguiente congelación día se mide durante la presentación del estímulo condicionado (EC) y el periodo de rastreo. En el tercer día hay una prueba de 8 min para medir la memoria contextual. Los resultados representativos son de los ratones que fueron presentados con el estímulo incondicionado aversivo (shock) en comparación con los ratones que recibieron las presentaciones de tono sin el estímulo incondicionado. Traza el condicionamiento del miedo se ha utilizado con éxito para detectar los déficits de aprendizaje y memoria y mejoras sutiles en los ratones que no se encuentran con otros métodos de condicionamiento del miedo. Este tipo de condicionamiento del miedo se cree que es dependiente de las conexiones entre la corteza medial prefrontal y el hipocampo. Una controversia actual es si se cree que este método es-amígdala independiente. Por lo tanto, es necesaria otra prueba acondicionado miedo para examinar los efectos de aprendizaje y memoria de la amígdala-dependientes, como a través del retardo condicionamiento del miedo.

Introducción

En el condicionamiento del miedo un estímulo neutro (NS) está emparejado con un estímulo aversivo incondicionado (EE.UU.). El NS es normalmente un tono y se convierte en un estímulo condicionado (EC) a través de apareamientos repetidos con los EE.UU.. El CS puede entonces provocar una respuesta condicionada (RC), tales como la congelación, en ausencia de la aversivo EE.UU.. Un protocolo acondicionado temor comúnmente utilizado es el retraso acondicionado. En este protocolo la aparición de la SN y los EE.UU. es contigua o con algún solapamiento en la presentación del estímulo. A pesar de que demora el condicionamiento del miedo es uno de los tipos más comunes de temporal acondicionado asociativo, hay varios otros tipos de arreglos temporales acondicionado asociativa: acondicionamiento simultánea, acondicionamiento de espaldas, y traza acondicionado 1. En traza el condicionamiento del miedo hay un intervalo de estímulo libre entre la SN y los EE.UU. de varios segundos que resulta en un período de "rastro".

Varios estudios han reportado déficits en traza el condicionamiento del miedo cuando lesiones neurotóxicas se producen en las estructuras que la entrada en el hipocampo 2-5 o cuando los agentes farmacológicos se utilizan para bloquear la función del receptor en el hipocampo. Lesión a los resultados del hipocampo en los déficits en rastro acondicionador y acondicionador contextual, pero no perjudica demora el condicionamiento del miedo 8. Hay varias ventajas a usar traza el condicionamiento del miedo. El protocolo acondicionado temor se puede lograr en un período de prueba de tres días de la memoria y permite hipocampo-dependiente que no es espacialmente dependiente. Traza el condicionamiento del miedo puede ser utilizado como una prueba complementaria para el laberinto de Morris agua, nuevo test de reconocimiento de objetos, u otras pruebas de laberinto en la investigación de la memoria dependiente del hipocampo.

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Protocolo

Los ratones usados ​​en el experimento siguiente se generaron y se alojaron en la Universidad de Baylor en una temperatura ambiente de 22 ° C, con una luz de 14 horas y 10 horas de oscuridad (20:00-06:00 h) ciclo diurno. Los ratones se les dio acceso ad libitum a comida y agua. Todos los procedimientos a los ratones estaban en el cumplimiento de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el protocolo de los animales fue aprobado por la Universidad de Baylor Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

Visión de conjunto

La traza acondicionado tarea temor se basa en los procedimientos descritos por Wiltgen y colegas 9.

1. Preparación de Equipo

La cámara de aparato de acondicionamiento de miedo (26 cm x 22 cm x 18 cm) se compone de dos partes que son de acrílico, dos lados que son metal, y un fondo suelo de rejilla que se utiliza para entregar un choque leve pie. La cámara de pruebas es la casad en una cámara de sonido atenuado. La cámara también es estanca a la luz para evitar que la luz fuera de influir en el software de detección de movimiento.

  1. Calibre los niveles de impacto, los niveles de luz, y los niveles de intensidad sonora de la cámara de prueba. Medir el nivel de fondo de la cámara de prueba. El ruido de fondo en esta cámara es de 65 dB. Utilice un medidor de sonido para medir este nivel. El medidor se debe establecer en 70 dB, establece en C, y para la detección de establecer lento.
    1. Calibre el nivel de impacto de 0,5 mA. Utilice un dispositivo de ajuste externo para calibrar correctamente el nivel de impacto (véase la Tabla de Materiales). La medición interna del generador de descargas no es exacta. El generador de descargas administra un choque revueltos, que no se puede medir con precisión mediante un medidor de amplificador estándar.
    2. Coloque un cable en una de las barras de la rejilla y colocar el otro cable de 3 o 4 bares terminado. Utilice el generador de descargas para administrar el shock. Ajuste el nivel de impacto hasta que se alcance el nivel correcto. Haga esto por each temer cámara de acondicionamiento.
    3. Cierre la puerta de la cámara cuando se mide el nivel de luz de la cámara. Calibre el nivel de luz de aproximadamente 1,0. Este es un número específico para el software freezeframe utilizado en este experimento. Un medidor de luz externa se lee esto como 2 lux. El nivel de luz puede ajustarse moviendo la ubicación de la luz de la casa o ajustando el condensador de la lente. Asegúrese de apretar los tornillos de ajuste de la lente después del ajuste.
    4. Calibre el nivel de decibeles de sonido de 85 dB. Utilice un medidor de decibelios externa dentro de la jaula de pruebas para calibrar el nivel de decibeles (ver Tabla de Materiales). El sonido se presenta será un tono de 2700 Hz. Nota: Si el uso de ratones mayores de 6 meses de edad, puede ser mejor utilizar ruido blanco ya que los ratones de edad avanzada pueden tener déficits auditivos.
  2. Después de que el aparato está listo tomar los sujetos a una sala de espera separada. Nota: No albergar el ratón en la habitación con la sala de pruebas.
  3. ª de la etiquetae la cola de los ratones a los que se pondrán a prueba con el fin de la prueba. Lo mejor es reducir la manipulación excesiva antes de la prueba. Alternativamente, las colas pueden ser etiquetados el día antes del experimento para reducir el manejo de estrés. Después de que los ratones han sido etiquetados les permite aclimatarse al ambiente durante 30 min. Tener jaulas limpias adicional para alojar a los ratones una vez finalizada la prueba.

2. Traza Acondicionado Día 1

  1. Retire cada ratón de la jaula y colocarlos en jaulas individuales para el transporte a la cámara de acondicionamiento miedo. Utilice ropa de cama limpia para cada jaula. Coloque una nota adhesiva en la caja de transferencia para mantener el orden de los ratones prueba correcta. Nota: Si los ratones son alojados individualmente, entonces pueden ser transportados en sus jaulas.
  2. Coloque el ratón en la cámara de pruebas y cierre la puerta. Inicie el programa de software.
  3. En el día de entrenamiento, permiten a los ratones para explorar la cámara durante 3 min. Entonces, el programa presenta un segundo tono de 20 (85 dB, 2700 Hz) to el animal. Después de un período de seguimiento de 20 seg un choque suave (2 seg, 0,5 mA) se administra al animal.
  4. Registre la reacción del sujeto para confirmar que recibieron los estímulos aversivos viendo el video. Un intervalo entre ensayos de 200 seg separa los ensayos de condicionamiento 5. Cada prueba consiste en un tono de 20 segundos seguida de un retraso de 20 segundos luego un shock.
  5. Una vez finalizada la prueba que el animal pueda permanecer en la cámara de ensayo durante 1 minuto antes de sacarla de la jaula de la prueba.
  6. Colocar el animal en la jaula de transferencia y devolverlo a su jaula. Si hay otros ratones en su jaula y luego albergar individualmente el ratón hasta que todos los ratones de prueba completa. Esto reducirá la tensión a la otra ratones que no han sido probados. Una solución alternativa sería para albergar por separado todos los ratones una semana antes de la prueba para reducir la influencia de la eliminación continua de los ratones de una jaula.
  7. Limpie la cámara de pruebas con isopropanol al 30% después de each animales se prueba.
  8. Repetir los pasos 2.2 a 2.7 para todos los ratones en la cohorte de pruebas.
  9. Volver a todos los ratones a su habitación después de la última colonia del ratón en la cohorte ha sido probado.

3. Traza el condicionamiento del miedo Día 2: Pruebas de memoria de seguimiento

  1. Las pruebas de memoria de seguimiento tendrá lugar el día 2. En este protocolo hay 3 presentaciones de tono. Coloque el ratón en un nuevo contexto para la prueba de rastreo acondicionado.
  2. Preparar el software para ejecutar un programa con un período de línea de base 2 min seguido de tres presentaciones de tono 20 seg. No sa 220 sec ITI entre cada presentación tono.
  3. Para la nueva condición de contexto, colocar insertos de acrílico transparente en el suelo de la cámara para alterar la forma, la textura, y el color de la cámara de acondicionamiento.
  4. Cambie el olor en la cámara mediante la colocación de extracto de vainilla en un barco bajo el peso de inserción baja.
  5. Limpie la cámara con etanol al 70% en lugar del 30% de isopropanol. Nota: Esto ayudará apara crear un nuevo contexto.
  6. Traiga a los ratones a la sala de espera y volver a etiquetar sus colas para probar si es necesario.
  7. Preparar las jaulas de transferencia de contexto novedosos mediante la sustitución de la ropa de cama con papel triturado. Nota: Esto le ayudará en la creación de un nuevo contexto.
  8. Coloque el ratón en la cámara de prueba, se iniciará el programa. Limpiar la cámara con etanol al 70% después de que se complete la prueba.
  9. Volver a los ratones a su jaula después de que se completó la traza acondicionado. Volver a todos los ratones a su habitación colonia cuando todos los ratones han sido probados.

4. Traza el condicionamiento del miedo Día 3: Pruebas de memoria contextual

  1. En el tercer día se lleva a cabo el condicionamiento contextual. Preparar el software para ejecutar un programa para grabar el comportamiento de congelación durante 8 min.
  2. Limpie la cámara con isopropanol al 30% antes de la prueba y después de las pruebas de cada ratón. El contexto debe ser idéntica a la del día 1. Las jaulas de transferencia deben ser el mismo que en el día 1.
  3. Traer los ratones a la sala de espera y la etiqueta de la cola para la prueba.
  4. Coloque cada ratón en la cámara de pruebas se iniciará el programa. Limpie la cámara con isopropanol al 30% después de finalizar la prueba.
  5. Volver a todos los ratones a su habitación colonia cuando esté terminado.

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Resultados

Para obtener resultados representativos se presentan datos de C57BL/6J ratones adultos control que recibieron los emparejamientos de estímulo neutro con el estímulo no condicionado (condición shock) en comparación con los ratones que recibieron el estímulo neutro, pero no recibieron el estímulo incondicionado (sin condiciones de choque). Es importante ejecutar esta condición cuando el ajuste inicial de esta prueba de comportamiento para determinar si el protocolo se ha realizado correctamente.

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Discusión

Se han realizado varios estudios que han aclarado el circuito neural que subyace traza el condicionamiento del miedo. Se cree Trazar el condicionamiento del miedo de involucrar a la CA1 del hipocampo 12-14. También hay evidencia de que la corteza prefrontal medial (mPFC) desempeña un papel importante en la traza de ojos parpadean acondicionado 15, y el córtex prefrontal medial se ha encontrado a participar en traza el condicionamiento del miedo. Un estudio encontró que las neuronas mPFC proporc...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por una beca de la Universidad de Baylor Research Council y de una beca de investigación de la Fundación para la Epilepsia.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
FreezeFrameCoulbourn
30% IsopropanolPurchase 90% isopropanol and dilute it down to 30%
70% Ethanol
Amp-meterMed-AssociatesENV-420Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only)
Digital Sound Level Meter33-2055
Vanilla ExtractMcCormick Pure Vanilla Extract
Sticky NotesPost-it3 in x 3 in

Referencias

  1. Powell, R. A., Honey, P. L., Symbaluk, D. G. Introduction to learning and behavior. , 4th ed, Wadsworth Cengage Learning. Forthcoming.
  2. Tsaltas, E., Preston, G. C., Gray, J. A. The effects of dorsal bundle lesions on serial and trace conditioning. Behav. Brain Res. 10, 361-374 (1983).
  3. McAlonan, G. M., Dawson, G. R., Wilkinson, L. O., Robbins, T. W., Everitt, B. J. The effects of AMPA-induced lesions of the medial septum and vertical limb nucleus of the diagonal band of Broca on spatial delayed non-matching to sample and spatial learning in the water maze. Eur. J. Neurosci. 7, 1034-1049 (1995).
  4. Chowdhury, N., Quinn, J. J., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus involvement in trace fear conditioning with long, but not short, trace intervals in mice. Behav. Neurosci. 119, 1396-1402 (2005).
  5. Quinn, J. J., Oommen, S. S., Morrison, G. E., Fanselow, M. S. Post-training excitotoxic lesions of the dorsal hippocampus attenuate forward trace, backward trace, and delay fear conditioning in a temporally specific manner. Hippocampus. 12, 495-504 (2002).
  6. Misane, I., et al. Time-dependent involvement of the dorsal hippocampus in trace fear conditioning in mice. Hippocampus. 15, 418-426 (2005).
  7. Quinn, J. J., Loya, F., Ma, Q. D., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus NMDA receptors differentially mediate trace and contextual fear conditioning. Hippocampus. 15, 665-674 (2005).
  8. McEchron, M. D., Bouwmeester, H., Tseng, W., Weiss, C., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts auditory trace fear conditioning and contextual fear conditioning in the rat. Hippocampus. 8, 638-646 (1998).
  9. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Ferguson, C., Homanics, G. E., Fanselow, M. S. Trace fear conditioning is enhanced in mice lacking the delta subunit of the GABAA receptor. Learn. Mem. 12, 327-333 (2005).
  10. Davis, R. R., et al. Genetic basis for susceptibility to noise-induced hearing loss in mice. Hear. Res. 155, 82-90 (2001).
  11. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hear. Res. 130, 94-107 (1999).
  12. Moyer, J. R., Thompson, L. T., Disterhoft, J. F. Trace eyeblink conditioning increases CA1 excitability in a transient and learning-specific manner. 16, 5536-5546 (1996).
  13. Leuner, B., Falduto, J., Shors, T. J. Associative memory formation increases the observation of dendritic spines in the hippocampus. J. Neurosci. 23, 659-665 (2003).
  14. McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Hippocampal encoding of non-spatial trace conditioning. Hippocampus. 9, 385-396 (1999).
  15. McLaughlin, J., Skaggs, H., Churchwell, J., Powell, D. A. Medial prefrontal cortex and pavlovian conditioning: trace versus delay conditioning. Behav. Neurosci. 116, 37-47 (2002).
  16. Runyan, J. D., Moore, A. N., Dash, P. K. A role for prefrontal cortex in memory storage for trace fear conditioning. J. Neurosci. 24, 1288-1295 (2004).
  17. Gilmartin, M. R., McEchron, M. D. Single neurons in the medial prefrontal cortex of the rat exhibit tonic and phasic coding during trace fear conditioning. Behav. Neurosci. 119, 1496-1510 (2005).
  18. Crow, T., Xue-Bian, J. J., Siddiqi, V., Kang, Y., Neary, J. T. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase by one-trial and multi-trial classical conditioning. J. Neurosci. 18, 3480-3487 (1998).
  19. Martin, K. C., et al. MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron. 18, 899-912 (1997).
  20. Crestani, F., et al. Trace fear conditioning involves hippocampal alpha5 GABA(A) receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8980-8985 (2002).
  21. Crestani, F., et al. Decreased GABAA-receptor clustering results in enhanced anxiety and a bias for threat cues. Nat. Neurosci. 2, 833-839 (1999).
  22. Moore, M. D., et al. Trace and contextual fear conditioning is enhanced in mice lacking the alpha4 subunit of the GABA(A) receptor. Neurobiol. Learn. Mem. 93, 383-387 (2010).
  23. Cushman, J. D., Moore, M. D., Jacobs, N. S., Olsen, R. W., Fanselow, M. S. Behavioral pharmacogenetic analysis on the role of the alpha4 GABA(A) receptor subunit in the ethanol-mediated impairment of hippocampus-dependent contextual learning. Alcohol Clin. Exp. Res. 35, 1948-1959 (2011).
  24. Raybuck, J. D., Lattal, K. M. Double dissociation of amygdala and hippocampal contributions to trace and delay fear conditioning. PLoS ONE. 6, (2011).
  25. Kwapis, J. L., Jarome, T. J., Schiff, J. C., Helmstetter, F. J. Memory consolidation in both trace and delay fear conditioning is disrupted by intra-amygdala infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin. Learn. Mem. 18, 728-732 (2011).
  26. Gilmartin, M. R., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Trace and contextual fear conditioning are impaired following unilateral microinjection of muscimol in the ventral hippocampus or amygdala, but not the medial prefrontal cortex. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 452-464 (2012).
  27. Baysinger, A. N., Kent, B. A., Brown, T. H. Muscarinic receptors in amygdala control trace fear conditioning. PLoS ONE. 7, (2012).
  28. Wanisch, K., Tang, J., Mederer, A., Wotjak, C. T. Trace fear conditioning depends on NMDA receptor activation and protein synthesis within the dorsal hippocampus of mice. Behav. Brain. 157, 63-69 (2005).
  29. Smith, D. R., Gallagher, M., Stanton, M. E. Genetic background differences and nonassociative effects in mouse trace fear conditioning. Learn. Mem. 14, 597-605 (2007).
  30. Rudy, J. W., O'Reilly, R. C. Contextual fear conditioning, conjunctive representations, pattern completion, and the hippocampus. Behav. Neurosci. 113, 867-880 (1999).
  31. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Anagnostaras, S. G., Sage, J. R., Fanselow, M. S. Context fear learning in the absence of the hippocampus. J. Neurosci. 26, 5484-5491 (2006).
  32. Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317, 1230-1233 (2007).
  33. Huerta, P. T., Sun, L. D., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Formation of temporal memory requires NMDA receptors within CA1 pyramidal neurons. Neuron. 25, 473-480 (2000).
  34. Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. J. Neurosci. Methods. 190, 235-239 (2010).

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