JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

No experimento seguinte, descrevemos um protocolo para traço medo condicionado em ratos. Este tipo de memória associativa inclui um período de traço que separa o estímulo neutro eo estímulo incondicionado.

Resumo

Neste experimento, apresentamos uma técnica para medir a aprendizagem ea memória. No protocolo condicionado traço medo aqui apresentada há cinco sorteios entre um estímulo neutro e um estímulo incondicionado. Há um período de rastreio de 20 segundos que separa cada ensaio condicionado. Na próxima congelamento dia é medido durante a apresentação do estímulo condicionado (CS) e período de vestígios. No terceiro dia, há um teste de 8 minutos para medir a memória contextual. Os resultados representativos são de camundongos que foram apresentados com o estímulo incondicionado aversivo (choque) em comparação com ratos que receberam as apresentações de tom, sem o estímulo incondicionado. Rastreamento medo condicionado foi usado com sucesso para detectar déficits e melhorias sutis de aprendizagem e memória em ratos que não são encontrados com outros métodos de medo condicionado. Este tipo de medo condicionado é considerada dependente da ligação entre o córtex pré-frontal e o hipocampo medial. Uma controvérsia atual é saber se este método é acreditado para ser independente de amígdala. Portanto, é necessário outro teste medo condicionado para examinar os efeitos de aprendizagem e memória dependente de amígdala, como através do atraso medo condicionado.

Introdução

Com medo condicionado um estímulo neutro (NS) está emparelhado com um estímulo incondicionado aversivo (EUA). O NS é normalmente um tom e se torna um estímulo condicionado (CS) através de sorteios repetidos com os EUA. O CS pode então induzir uma resposta condicionada (CR), tal como a congelação, na ausência do aversivo EUA. Um protocolo de condicionamento do medo utilizada é atraso condicionado. Neste protocolo o início do NS e os EUA é contíguo ou com alguma sobreposição na apresentação do estímulo. Mesmo que demora medo condicionado é um dos tipos mais usados ​​de condicionamento associativo temporais, existem vários outros tipos de arranjos temporais condicionamento associativo: condicionamento simultâneo, condicionado para trás, e traço condicionado 1. No rastro do medo condicionado há um intervalo livre de estímulo entre o NS e os EUA de vários segundos, resultando em um período de "trace".

Vários estudos relataram déficits em rastreio de condicionamento de medo quando as lesões neurotóxicas são produzidas nas estruturas de entrada em que as hipocampo 2-5 ou quando os agentes farmacológicos são utilizados para bloquear a função do receptor no hipocampo. Lesão aos resultados hipocampo os défices traço e no condicionamento contextual, mas não prejudica atraso medo condicionado 8. Existem várias vantagens de se utilizar traço medo condicionado. O protocolo de condicionamento ao medo pode ser alcançado depois de um período de teste de três dias e permite a memória dependente do hipocampo que não é espacialmente dependente. Traçar medo condicionado pode ser usado como um exame complementar para o labirinto Morris água, romance teste de reconhecimento de objeto, ou outros testes de labirinto em investigar a memória dependente do hipocampo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Os ratos utilizados no experimento seguinte foram gerados e alojados na Universidade de Baylor em uma temperatura ambiente de 22 ° C, com uma luz de 14 horas e 10 horas escuro (20:00-06:00 hr) ciclo diurno. Os ratinhos foram fornecidas ad libitum acesso a comida e água. Todos os procedimentos para os ratos estavam em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e do protocolo de animais foi aprovado pela Universidade de Baylor Animal Care e do Comitê Use.

Visão global

A tarefa do medo condicionado traço é baseado em procedimentos descritos por Wiltgen e colegas 9.

1. Preparação do Equipamento

A câmara de aparelho de condicionamento do medo (26 centímetros x 22 cm x 18) consiste de duas partes que são de acrílico, de dois lados, que são de metal, e um chão de grade de fundo, que é usado para fornecer um choque no pé leve. A câmara de teste é a casad em uma câmara de som atenuado. A câmara também é apertado luz para evitar a luz do lado de fora de influenciar o software de detecção de movimento.

  1. Calibrar os níveis de choque, os níveis de luz, e os níveis de intensidade sonora para a câmara de testes. Medir o nível de fundo da câmara de testes. O ruído de fundo nesta câmara é de 65 dB. Use um medidor de som para medir este nível. O medidor deve ser ajustado para 70 dB, definido como C, e para a detecção de ajuste lento.
    1. Calibrar o nível de choque de 0,5 mA. Use um dispositivo de calibração externa para calibrar corretamente o nível de choque (ver Tabela Materiais). A medição interna do gerador de choque não é preciso. O gerador de choque administra um choque mexidos que não pode ser medido com precisão por um medidor de amp padrão.
    2. Coloque uma das pontas em um dos bares da rede e colocar os outros levam 3 ou 4 bares mais. Use o gerador de choque para administrar o choque. Ajuste o nível de choque até o nível correto seja atingido. Faça isso por eAch temer câmara de condicionamento.
    3. Feche a porta para a câmara quando se mede o nível de luz da câmara. Calibrar o nível de luz de aproximadamente 1,0. Este é um número específico para o software freezeframe utilizado nesta experiência. Um medidor de luz externa vai ler isso como 2 lux. O nível de luz pode ser ajustada movendo a localização da luz casa ou ajustando o condensador da lente. Certifique-se de apertar os parafusos de ajuste para a lente após o ajuste.
    4. Calibrar o nível do som em decibéis a 85 dB. Use um decibelímetro externo dentro da gaiola de testes para calibrar o nível de decibéis (ver Tabela Materiais). O som apresentado será um tom Hz 2.700. Nota: Se estiver usando camundongos com idade superior a 6 meses de idade, pode ser melhor usar o ruído branco desde ratos mais velhos podem ter déficit auditivo.
  2. Depois que o aparelho está pronto levar os sujeitos a uma sala de espera separada. Nota: Não abrigar o mouse na mesma sala, como a sala de testes.
  3. ª rótuloe a cauda dos ratos que serão testadas em ordem de teste. É melhor reduzir o manuseio excessivo antes do teste. Alternativamente, as caudas podem ser rotuladas no dia anterior ao ensaio para reduzir a lidar com o stress. Após os ratinhos foram rotulados permitir a aclimatar ao ambiente durante 30 minutos. Tenha gaiolas adicional limpas para abrigar os ratos após o teste é concluído.

2. Traçar Condicionado Dia 1

  1. Retire cada rato da gaiola e colocá-los em gaiolas individuais para o transporte para a câmara de medo condicionado. Use roupa de cama limpa para cada gaiola. Coloque uma nota em gaiola transferência para manter a ordem de camundongos testando correta. Nota: Se os ratos são alojados individualmente em seguida, eles podem ser transportadas na sua gaiola de origem.
  2. Posicione o mouse na câmara de teste e fechar a porta. Inicie o programa de software.
  3. No dia de treino, permite que os ratinhos para explorar a câmara durante 3 min. O software em seguida, apresenta a 20 seg de tom (85 dB, 2.700 Hz) to animal. Depois de um período de rastreio de 20 seg um choque ligeiro (2 s, 0,5 mA) é administrado ao animal.
  4. Registre a reação do assunto para confirmar que recebeu os estímulos aversivos, visualizando o vídeo. Um intervalo inter-julgamento 200 seg separa os ensaios 5 condicionamento. Cada ensaio consiste de 20 seg tom seguido por um atraso de 20 segundos, em seguida, um choque.
  5. Após o teste é concluído que os animais possam permanecer na câmara de teste durante 1 minuto antes de a retirar da gaiola de teste.
  6. Colocar o animal de volta na gaiola de transferência e devolvê-lo à sua gaiola. Se houver ratos adicionais em sua gaiola casa, então abrigar individualmente o mouse até que todos os ratos de teste completo. Isto irá reduzir a tensão para o outro ratos que não foram testados. Uma solução alternativa seria a de abrigar individualmente todos os ratinhos uma semana antes do ensaio, para reduzir a influência da remoção contínua ratinhos de uma gaiola.
  7. Limpe a câmara de testes com 30% de isopropanol após each animal é testado.
  8. Repita os passos de 2,2-2,7 para todos os murganhos no grupo do teste.
  9. Retornar todos os ratos para o quarto colônia após o último rato na coorte foi testado.

3. Rastreamento Medo Condicionado Day 2: Teste de memória Rastreamento

  1. Teste de memória rastreamento ocorrerá no dia 2. Neste protocolo há 3 apresentações de tom. Coloque os ratos em um novo contexto para o teste traço condicionado.
  2. Prepare o software para executar um programa com um período inicial de 2 min seguido por três apresentações de 20 segundos de tom. Há sa 220 sec ITI entre cada apresentação tom.
  3. Para a nova condição contexto, colocar inserções de acrílico no chão da câmara para alterar a forma, textura e cor da câmara de condicionamento.
  4. Alterar o odor na câmara, colocando extrato de baunilha em um barco pesar sob a inserção chão.
  5. Limpar a câmara com etanol a 70% em vez de 30% de isopropanol. Nota: Isso vai ajudarpara criar um novo contexto.
  6. Traga os ratos para a sala de detenção e relabel suas caudas para testes, se necessário.
  7. Prepare novas gaiolas de transferência contexto, substituindo a cama com papel picado. Nota: Isso vai ajudar na criação de um novo contexto.
  8. Coloque os ratos na câmara de teste, em seguida, iniciar o programa. Limpar a câmara com etanol a 70% após o teste é concluído.
  9. Retorne os ratos para sua gaiola para casa após o traço condicionado está concluída. Retornar todos os ratos para o quarto colônia quando todos os ratos foram testados.

4. Rastreamento Medo Condicionado Dia 3: Teste de memória Contextual

  1. No terceiro dia de condicionamento contextual é conduzida. Prepare o software para executar um programa para gravar o comportamento de congelamento por 8 min.
  2. Limpe a câmara com 30% isopropanol antes de testar e depois de testar cada rato. O contexto deve ser idêntica à do dia 1. As gaiolas de transferência deve ser o mesmo que no dia 1.
  3. Trazer camundongos para a sala de detenção e rotular suas caudas para testes.
  4. Coloque cada rato na câmara de teste, em seguida, iniciar o programa. Limpe a câmara com 30% de isopropanol após o teste é concluído.
  5. Retornar todos os ratos para o quarto colônia quando concluído.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Para os resultados representativos são apresentados dados de ratos adultos da estirpe C57BL/6J de controlo que receberam os emparelhamentos de estímulo neutro com o estímulo não condicionado (choque condição) em comparação com os ratos que receberam o estímulo neutro, mas não receberam o estímulo não condicionado (nenhum estado de choque). É importante executar esta condição quando a primeira criação deste teste comportamental para determinar se o protocolo foi realizado corretamente.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Houve vários estudos que têm elucidado o circuito neural que subjaz traço medo condicionado. Traçar medo condicionado é acreditado para envolver CA1 do hipocampo 12-14. Existe também evidência de que o córtex pré-frontal medial (CPFm) desempenha um grande papel no rastreio do pestanejar condicionado 15, e o CPFm foi encontrado para ser envolvido no rastreio de condicionamento de medo. Um estudo descobriu que os neurônios mPFC fornecer atividade sustentada durante o período de rastreio, p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por uma bolsa do Conselho de Pesquisa da Universidade de Baylor e de uma bolsa de pesquisa da Fundação de Epilepsia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
FreezeFrameCoulbourn
30% IsopropanolPurchase 90% isopropanol and dilute it down to 30%
70% Ethanol
Amp-meterMed-AssociatesENV-420Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only)
Digital Sound Level Meter33-2055
Vanilla ExtractMcCormick Pure Vanilla Extract
Sticky NotesPost-it3 in x 3 in

Referências

  1. Powell, R. A., Honey, P. L., Symbaluk, D. G. Introduction to learning and behavior. , 4th ed, Wadsworth Cengage Learning. Forthcoming.
  2. Tsaltas, E., Preston, G. C., Gray, J. A. The effects of dorsal bundle lesions on serial and trace conditioning. Behav. Brain Res. 10, 361-374 (1983).
  3. McAlonan, G. M., Dawson, G. R., Wilkinson, L. O., Robbins, T. W., Everitt, B. J. The effects of AMPA-induced lesions of the medial septum and vertical limb nucleus of the diagonal band of Broca on spatial delayed non-matching to sample and spatial learning in the water maze. Eur. J. Neurosci. 7, 1034-1049 (1995).
  4. Chowdhury, N., Quinn, J. J., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus involvement in trace fear conditioning with long, but not short, trace intervals in mice. Behav. Neurosci. 119, 1396-1402 (2005).
  5. Quinn, J. J., Oommen, S. S., Morrison, G. E., Fanselow, M. S. Post-training excitotoxic lesions of the dorsal hippocampus attenuate forward trace, backward trace, and delay fear conditioning in a temporally specific manner. Hippocampus. 12, 495-504 (2002).
  6. Misane, I., et al. Time-dependent involvement of the dorsal hippocampus in trace fear conditioning in mice. Hippocampus. 15, 418-426 (2005).
  7. Quinn, J. J., Loya, F., Ma, Q. D., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus NMDA receptors differentially mediate trace and contextual fear conditioning. Hippocampus. 15, 665-674 (2005).
  8. McEchron, M. D., Bouwmeester, H., Tseng, W., Weiss, C., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts auditory trace fear conditioning and contextual fear conditioning in the rat. Hippocampus. 8, 638-646 (1998).
  9. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Ferguson, C., Homanics, G. E., Fanselow, M. S. Trace fear conditioning is enhanced in mice lacking the delta subunit of the GABAA receptor. Learn. Mem. 12, 327-333 (2005).
  10. Davis, R. R., et al. Genetic basis for susceptibility to noise-induced hearing loss in mice. Hear. Res. 155, 82-90 (2001).
  11. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hear. Res. 130, 94-107 (1999).
  12. Moyer, J. R., Thompson, L. T., Disterhoft, J. F. Trace eyeblink conditioning increases CA1 excitability in a transient and learning-specific manner. 16, 5536-5546 (1996).
  13. Leuner, B., Falduto, J., Shors, T. J. Associative memory formation increases the observation of dendritic spines in the hippocampus. J. Neurosci. 23, 659-665 (2003).
  14. McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Hippocampal encoding of non-spatial trace conditioning. Hippocampus. 9, 385-396 (1999).
  15. McLaughlin, J., Skaggs, H., Churchwell, J., Powell, D. A. Medial prefrontal cortex and pavlovian conditioning: trace versus delay conditioning. Behav. Neurosci. 116, 37-47 (2002).
  16. Runyan, J. D., Moore, A. N., Dash, P. K. A role for prefrontal cortex in memory storage for trace fear conditioning. J. Neurosci. 24, 1288-1295 (2004).
  17. Gilmartin, M. R., McEchron, M. D. Single neurons in the medial prefrontal cortex of the rat exhibit tonic and phasic coding during trace fear conditioning. Behav. Neurosci. 119, 1496-1510 (2005).
  18. Crow, T., Xue-Bian, J. J., Siddiqi, V., Kang, Y., Neary, J. T. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase by one-trial and multi-trial classical conditioning. J. Neurosci. 18, 3480-3487 (1998).
  19. Martin, K. C., et al. MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron. 18, 899-912 (1997).
  20. Crestani, F., et al. Trace fear conditioning involves hippocampal alpha5 GABA(A) receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8980-8985 (2002).
  21. Crestani, F., et al. Decreased GABAA-receptor clustering results in enhanced anxiety and a bias for threat cues. Nat. Neurosci. 2, 833-839 (1999).
  22. Moore, M. D., et al. Trace and contextual fear conditioning is enhanced in mice lacking the alpha4 subunit of the GABA(A) receptor. Neurobiol. Learn. Mem. 93, 383-387 (2010).
  23. Cushman, J. D., Moore, M. D., Jacobs, N. S., Olsen, R. W., Fanselow, M. S. Behavioral pharmacogenetic analysis on the role of the alpha4 GABA(A) receptor subunit in the ethanol-mediated impairment of hippocampus-dependent contextual learning. Alcohol Clin. Exp. Res. 35, 1948-1959 (2011).
  24. Raybuck, J. D., Lattal, K. M. Double dissociation of amygdala and hippocampal contributions to trace and delay fear conditioning. PLoS ONE. 6, (2011).
  25. Kwapis, J. L., Jarome, T. J., Schiff, J. C., Helmstetter, F. J. Memory consolidation in both trace and delay fear conditioning is disrupted by intra-amygdala infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin. Learn. Mem. 18, 728-732 (2011).
  26. Gilmartin, M. R., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Trace and contextual fear conditioning are impaired following unilateral microinjection of muscimol in the ventral hippocampus or amygdala, but not the medial prefrontal cortex. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 452-464 (2012).
  27. Baysinger, A. N., Kent, B. A., Brown, T. H. Muscarinic receptors in amygdala control trace fear conditioning. PLoS ONE. 7, (2012).
  28. Wanisch, K., Tang, J., Mederer, A., Wotjak, C. T. Trace fear conditioning depends on NMDA receptor activation and protein synthesis within the dorsal hippocampus of mice. Behav. Brain. 157, 63-69 (2005).
  29. Smith, D. R., Gallagher, M., Stanton, M. E. Genetic background differences and nonassociative effects in mouse trace fear conditioning. Learn. Mem. 14, 597-605 (2007).
  30. Rudy, J. W., O'Reilly, R. C. Contextual fear conditioning, conjunctive representations, pattern completion, and the hippocampus. Behav. Neurosci. 113, 867-880 (1999).
  31. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Anagnostaras, S. G., Sage, J. R., Fanselow, M. S. Context fear learning in the absence of the hippocampus. J. Neurosci. 26, 5484-5491 (2006).
  32. Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317, 1230-1233 (2007).
  33. Huerta, P. T., Sun, L. D., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Formation of temporal memory requires NMDA receptors within CA1 pyramidal neurons. Neuron. 25, 473-480 (2000).
  34. Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. J. Neurosci. Methods. 190, 235-239 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

ComportamentoEdi o 85o condicionamento do medoaprendendotra o condicionadomem riacondicionado e est mulo incondicionadoo est mulo neutrodependente da am gdala aprendizagem

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados