JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בניסוי הבא אנו מתארים פרוטוקול לאוויר פחד עקבות בעכברים. סוג זה של זיכרון אסוציאטיבי כולל תקופת עקבות שמפרידה בין הגירוי הניטרלי והגירוי הבלתי מותנה.

Abstract

בניסוי זה אנו מציגים טכניקה למדידת למידה וזיכרון. בפרוטוקול אוויר פחד עקבות שהוצג כאן יש חמישה זיווגים בין גירוי ניטראלי וגירוי הבלתי מותנה. יש תקופת עקבות 20 שניות שמפרידה בין כל ניסוי אוויר. על ההקפאה למחרת נמדד במהלך ההצגה של הגירוי המותנה (CS) ותקופת עקבות. ביום השלישי יש מבחן 8 דקות כדי למדוד זיכרון תלוי קשר. תוצאות הנציגים מעכברים שהוצגו עם הגירוי מרתיע הבלתי מותנה (הלם) בהשוואה לעכברים שקיבלו את מצגות הטון ללא הגירוי הבלתי מותנה. עקבות מיזוג פחד שמש בהצלחה כדי לאתר גירעונות למידה וזיכרון עדינים ושיפורים בעכברים שאינם נמצאים בשיטות מיזוג פחד אחרות. סוג זה של מיזוג פחד הוא האמין להיות תלוי בקשרים בין קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי וההיפוקמפוס. מחלוקת נוכחית אחת היא אם הוא האמין בשיטה זו כדי להיות האמיגדלה עצמאית. לכן, יש צורך בבדיקות אוויר פחד אחרים כדי לבחון השפעות למידה וזיכרון האמיגדלה תלויה, כגון באמצעות פחד עיכוב האוויר.

Introduction

במיזוג פחד גירוי ניטראלי (NS) הוא זיווג עם גירוי מרתיע הבלתי מותנה (US). NS הוא בדרך כלל טון והופך לגירוי מותנה (CS) באמצעות זיווגים חוזרים ונשנים עם ארה"ב. אז CS יכול לעורר תגובה מותנית (CR), כגון הקפאה, בהיעדרה של ארה"ב מרתיעה. פרוטוקול אוויר פחד נפוץ הוא עיכוב אוויר. בפרוטוקול זה תחילתה של NS וארה"ב היא רציפה או עם חפיפה מסוימת בהצגת גירוי. למרות פחד עיכוב אוויר הוא אחד מהסוגים הנפוצים ביותר של אוויר אסוציאטיבי זמני, יש כמה סוגים אחרים של הסדרים זמניים אסוציאטיבי אוויר: אוויר בו זמנית, אוויר לאחור, ועקבות אוויר 1. בעקבת מיזוג פחד יש מרווח ללא גירוי בין NS ובארצות הברית של כמה שניות וכתוצאה מכך תקופת "עקבות".

מחקרים אחדים דיווחו על גירעוןים בעקבת מיזוג פחד כאשר נגעים רעילים מיוצרים במבנים שקלט לתוך ההיפוקמפוס 2-5 או כאשר סוכנים תרופתיים משמשים כדי לחסום את פונקצית קולטן בהיפוקמפוס. נגע לתוצאות היפוקמפוס בגירעונות באוויר עקבות ואוויר קונטקסטואלי, אך אינו מפריע לפחד עיכוב אוויר 8. ישנם מספר יתרונות לשימוש עקבות מיזוג פחד. פרוטוקול אוויר הפחד יכול להיות מושגת על פני תקופה בדיקה של שלושה ימים ומאפשר לזיכרון בהיפוקמפוס תלוי שאינו תלוי במרחב. עקוב אחר מיזוג פחד יכול לשמש כמבחן משלים למבוך מוריס מים, מבחן זיהוי אובייקט רומן, או בדיקות אחרות במבוך חוקר זיכרון בהיפוקמפוס תלוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

העכברים ששמשו בניסוי הבא נוצרו ושוכנו באוניברסיטה ביילור בטמפרטורת סביבה של 22 מעלות צלזיוס, עם אור 14 שעה ו10 כהה שעה (20:00-06:00 hr) מחזור יומי. עכברי גישה כרצונך מודעה למזון ומים היו נתון. כל הנהלים לעכברים היו בעמידה במכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול והשימוש בחי מעבדה ופרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי האוניברסיטה ביילור טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.

סקירה

משימת פחד העקבות מותנות מבוססת על נהלים שתוארו על ידי Wiltgen ועמיתים 9.

1. הכנת הציוד

תא פחד מנגנון האוויר (26 סנטימטר x 22 סנטימטר x 18 סנטימטר) מורכב משני צדדים כי הם אקריליק, שני צדדים כי הם מתכת, ורצפה תחתונה רשת המשמש כדי לספק הלם ברגל קל. חדר הבדיקה הוא ביתד בתא נחלש קול. הקאמרית הוא גם חזק אור כדי למנוע אור בחוץ ממשפיע על תוכנת זיהוי תנועה.

  1. לכייל את רמות ההלם, רמות אור, ורמות עוצמת קול לחדר הבדיקה. מדוד את רמת הרקע של חדר הבדיקות. רעשי הרקע בחדר הזה הוא 65 dB. השתמש במד קול כדי למדוד רמה זו. המטר צריך להיות מוגדר 70 dB, להגדיר ל-C, ולאיתור הגדרה איטי.
    1. לכייל את רמת הלם 0.5 mA. השתמש במכשיר כיול חיצוני כדי לכייל את רמת ההלם (ראה לוח חומרים) בצורה נכונה. המדידה הפנימית של הגנרטור ההלם היא לא מדויקת. גנרטור ההלם מנהל הלם מקושקשת שלא ניתן למדוד באופן מדויק על ידי מטר מגבר סטנדרטי.
    2. הנח להוביל אחד על אחד הברים הרשת ולמקם את יתרון 3 או 4 ברים האחרים על פני. השתמש במחולל ההלם לנהל את ההלם. התאם את רמת ההלם ועד לרמה הנכונה מושגת. האם זה עבור each חושש תא אוויר.
    3. סגור את הדלת לתא בעת מדידת רמת האור של החדר. לכייל את רמת האור לכ 1.0. זהו מספר ייחודיים לתוכנת FreezeFrame השתמשה בניסוי זה. מד אור חיצוני יהיה לקרוא את זה כמו 2 סוויטה דה לוקס. רמת האור יכולה להיות מותאמת על ידי הזזת מיקומו של האור בבית או על ידי התאמת הקבל של העדשה. הקפד להדק את ברגי התאמה לעדשה לאחר ההתאמה.
    4. לכייל את רמת הדציבלים קול ל85 dB. השתמש במד הדציבלים חיצוני בתוך כלוב הבדיקה כדי לכייל את רמת הדציבלים (ראה לוח חומרים). הצליל שהוצג יהיה טון הרץ 2,700. הערה: אם אתם משתמשים בעכברים מבוגרים לגיל 6 חודשים זה יכול להיות טוב יותר להשתמש רעש לבן מאז עכברים מבוגרים יכולים היו לשמוע את הגירעונות.
  2. לאחר המנגנון מוכן לקחת את הנושאים לחדר אחזקות נפרדים. הערה: אל בית העכבר באותו החדר כחדר הבדיקות.
  3. ה תוויתזנב דואר של העכברים שייבחנו על פי סדר הבדיקה. עדיף להפחית טיפול מוגזם לפני הבדיקה. לחלופין, יכולים להיות מתויגים זנבות היום שלפני הניסוי כדי להפחית את הטיפול בלחץ. אחרי העכברים כבר שכותרתו לאפשר להם להסתגל למקום ל30 דקות. יש כלובים נוספים נקיים לדיור העכברים לאחר הבדיקה הושלמה.

2. עקוב אחר אוויר יום 1

  1. הסר את כל עכבר מהכלוב ולמקם אותם בכלובים נפרדים להובלה לתא אוויר הפחד. השתמש בכלי מיטה נקיות לכל כלוב. מניחים פתק דביק על כלוב ההעברה כדי לשמור על הסדר של עכברי בדיקה נכונים. הערה: אם העכברים הם שוכנו ביחידים ואז הם יכולים להיות מועברים בכלוב בבית שלהם.
  2. מניחים את העכבר בתא הבדיקה וסגור את הדלת. הפעל את התוכנה.
  3. ביום ההכשרה, תאפשר העכברים כדי לחקור את החדר במשך 3 דקות. התוכנה ואז מציגה טון שניות 20 (85 dB, 2,700 Hz) to בעלי החיים. לאחר תקופת מעקב של 20 שניות הלם קל (2 שניות, MA 0.5) ניתן לבעלי החיים.
  4. רשום את התגובה בנושא כדי לוודא שהם קיבלו את הגירויים מרתיעים, על ידי הצגת הווידאו. מרווח בין משפט 200 שניות שמפריד בין 5 הניסויים האוויר. כל ניסוי מורכב מטון שניות 20 אחרי עיכוב 20 שניות לאחר מכן הלם.
  5. לאחר הבדיקה תושלם לאפשר החיה להישאר בתא הבדיקה ל1 דקות לפני הסרתו מכלוב הבדיקה.
  6. מניחים את החיה בחזרה בכלוב ההעברה ולהחזיר אותו לכלוב בבית שלה. אם יש עכברים נוספים בכלוב בבית שלהם ואז בנפרד לשכן את העכבר עד שכל הבדיקה המלאה העכברים. זה יקטין את הלחץ לעכברים האחרים שלא נבדקו. פתרון חלופי יהיה לשכן ביחידות כל עכברי שבוע לפני בדיקה כדי להפחית את ההשפעה של רציפות הסרת עכברים מכלוב אחד.
  7. נקה את חדר הבדיקות עם isopropanol 30% לאחר EACבעלי החיים שעות הוא נבדק.
  8. חזור על השלבים 2.2-2.7 לכל העכברים בקבוצת הבדיקה.
  9. להחזיר את כל העכברים לחדר המושבה שלהם אחרי העכבר שעבר בקבוצה נבדק.

3. עקבות יום אוויר פחד 2: בדיקת זיכרון Trace

  1. בדיקת זיכרון Trace תתרחש ביום 2. בפרוטוקול זה יש 3 מצגות טון. מקם את העכברים בהקשר חדש לבדיקת עקבות האוויר.
  2. הכן את התוכנה כדי להפעיל תכנית עם תקופת בסיס 2 דקות ואחריו שלוש מצגות 20 טון שניות. יש sa ITI 220 שניות בין כל מצגת טון.
  3. למצב ההקשר החדש, למקם מוסיף אקריליק ברור על הרצפה של החדר כדי לשנות את הצורה, מרקם וצבע של חדר האוויר.
  4. לשנות את הריח בתא על ידי הצבת תמצית וניל בסירה שוקל מתחת הוספת הקומה.
  5. נקה את החדר עם 70% אתנול במקום isopropanol 30%. הערה: זה יעזור ליכדי ליצור הקשר חדש.
  6. להביא את העכברים לחדר ההמתנה ולתייג מחדש את זנבותיהם לבדיקות במידת צורך.
  7. הכן את כלובי העברת הקשר רומן על ידי החלפת המצעים עם נייר גרוס. הערה: זה יעזור ביצירת הקשר חדש.
  8. מקם את העכברים בחדר הבדיקות ואז להתחיל את התכנית. נקה את החדר עם 70% אתנול לאחר הבדיקה הושלמה.
  9. להחזיר את העכברים לכלוב בבית שלהם אחרי עקבות האוויר הושלם. להחזיר את כל העכברים לחדר המושבה שלהם, כאשר כל העכברים נבדקו.

4. עקבות פחד יום אוויר 3: בדיקת זיכרון הקשר

  1. ביום השלישי אוויר קונטקסטואלי מתנהל. הכן את התוכנה כדי להפעיל תכנית להקליט התנהגות הקפאה במשך 8 דקות.
  2. נקה את החדר עם isopropanol 30% לפני הבדיקה ואחרי הבדיקה של כל עכבר. ההקשר צריך להיות זהה לזה של יום 1. כלובי ההעברה צריכים להיות אותו הדבר כמו ביום 1.
  3. תביא עכברים לחדר ההמתנה ולתייג את הזנבות שלהם לבדיקה.
  4. מניחים כל עכבר בתא הבדיקה ולאחר מכן להפעיל את התכנית. נקה את החדר עם isopropanol 30% לאחר הבדיקה הושלמה.
  5. להחזיר את כל העכברים לחדר המושבה שלהם כאשר הושלמו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לתוצאות הנציג אנו מציגים נתונים מעכברים בוגרים C57BL/6J שליטה שקיבלו את זיווגים גירוי ניטראליים עם הגירוי הבלתי מותנה (מצב הלם) בהשוואה לעכברים שקיבלו את הגירוי הניטרלי אך לא קיבלו גירוי בלתי המותנה (לא במצב הלם). חשוב להפעיל מצב זה, כאשר ראשון הגדרת מבחן התנהגות זו כדי ל?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

היו כמה מחקרים שהובהרו מעגלים העצביים העומדים בבסיס עקבות מיזוג פחד. הוא האמין עקבות מיזוג פחד לערב CA1 של 12-14 היפוקמפוס. יש גם ראיות לכך שקליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי (mPFC) משחקת תפקיד גדול באוויר מצמוץ עקבות 15, וmPFC כבר מצא להיות מעורב בשמץ מיזוג פחד. מחקר אח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מועצת המחקר של האוניברסיטה ביילור וממענק מחקר מקרן אפילפסיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
FreezeFrameCoulbourn
30% IsopropanolPurchase 90% isopropanol and dilute it down to 30%
70% Ethanol
Amp-meterMed-AssociatesENV-420Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only)
Digital Sound Level Meter33-2055
Vanilla ExtractMcCormick Pure Vanilla Extract
Sticky NotesPost-it3 in x 3 in

References

  1. Powell, R. A., Honey, P. L., Symbaluk, D. G. Introduction to learning and behavior. , 4th ed, Wadsworth Cengage Learning. Forthcoming.
  2. Tsaltas, E., Preston, G. C., Gray, J. A. The effects of dorsal bundle lesions on serial and trace conditioning. Behav. Brain Res. 10, 361-374 (1983).
  3. McAlonan, G. M., Dawson, G. R., Wilkinson, L. O., Robbins, T. W., Everitt, B. J. The effects of AMPA-induced lesions of the medial septum and vertical limb nucleus of the diagonal band of Broca on spatial delayed non-matching to sample and spatial learning in the water maze. Eur. J. Neurosci. 7, 1034-1049 (1995).
  4. Chowdhury, N., Quinn, J. J., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus involvement in trace fear conditioning with long, but not short, trace intervals in mice. Behav. Neurosci. 119, 1396-1402 (2005).
  5. Quinn, J. J., Oommen, S. S., Morrison, G. E., Fanselow, M. S. Post-training excitotoxic lesions of the dorsal hippocampus attenuate forward trace, backward trace, and delay fear conditioning in a temporally specific manner. Hippocampus. 12, 495-504 (2002).
  6. Misane, I., et al. Time-dependent involvement of the dorsal hippocampus in trace fear conditioning in mice. Hippocampus. 15, 418-426 (2005).
  7. Quinn, J. J., Loya, F., Ma, Q. D., Fanselow, M. S. Dorsal hippocampus NMDA receptors differentially mediate trace and contextual fear conditioning. Hippocampus. 15, 665-674 (2005).
  8. McEchron, M. D., Bouwmeester, H., Tseng, W., Weiss, C., Disterhoft, J. F. Hippocampectomy disrupts auditory trace fear conditioning and contextual fear conditioning in the rat. Hippocampus. 8, 638-646 (1998).
  9. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Ferguson, C., Homanics, G. E., Fanselow, M. S. Trace fear conditioning is enhanced in mice lacking the delta subunit of the GABAA receptor. Learn. Mem. 12, 327-333 (2005).
  10. Davis, R. R., et al. Genetic basis for susceptibility to noise-induced hearing loss in mice. Hear. Res. 155, 82-90 (2001).
  11. Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses. Hear. Res. 130, 94-107 (1999).
  12. Moyer, J. R., Thompson, L. T., Disterhoft, J. F. Trace eyeblink conditioning increases CA1 excitability in a transient and learning-specific manner. 16, 5536-5546 (1996).
  13. Leuner, B., Falduto, J., Shors, T. J. Associative memory formation increases the observation of dendritic spines in the hippocampus. J. Neurosci. 23, 659-665 (2003).
  14. McEchron, M. D., Disterhoft, J. F. Hippocampal encoding of non-spatial trace conditioning. Hippocampus. 9, 385-396 (1999).
  15. McLaughlin, J., Skaggs, H., Churchwell, J., Powell, D. A. Medial prefrontal cortex and pavlovian conditioning: trace versus delay conditioning. Behav. Neurosci. 116, 37-47 (2002).
  16. Runyan, J. D., Moore, A. N., Dash, P. K. A role for prefrontal cortex in memory storage for trace fear conditioning. J. Neurosci. 24, 1288-1295 (2004).
  17. Gilmartin, M. R., McEchron, M. D. Single neurons in the medial prefrontal cortex of the rat exhibit tonic and phasic coding during trace fear conditioning. Behav. Neurosci. 119, 1496-1510 (2005).
  18. Crow, T., Xue-Bian, J. J., Siddiqi, V., Kang, Y., Neary, J. T. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinase by one-trial and multi-trial classical conditioning. J. Neurosci. 18, 3480-3487 (1998).
  19. Martin, K. C., et al. MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron. 18, 899-912 (1997).
  20. Crestani, F., et al. Trace fear conditioning involves hippocampal alpha5 GABA(A) receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8980-8985 (2002).
  21. Crestani, F., et al. Decreased GABAA-receptor clustering results in enhanced anxiety and a bias for threat cues. Nat. Neurosci. 2, 833-839 (1999).
  22. Moore, M. D., et al. Trace and contextual fear conditioning is enhanced in mice lacking the alpha4 subunit of the GABA(A) receptor. Neurobiol. Learn. Mem. 93, 383-387 (2010).
  23. Cushman, J. D., Moore, M. D., Jacobs, N. S., Olsen, R. W., Fanselow, M. S. Behavioral pharmacogenetic analysis on the role of the alpha4 GABA(A) receptor subunit in the ethanol-mediated impairment of hippocampus-dependent contextual learning. Alcohol Clin. Exp. Res. 35, 1948-1959 (2011).
  24. Raybuck, J. D., Lattal, K. M. Double dissociation of amygdala and hippocampal contributions to trace and delay fear conditioning. PLoS ONE. 6, (2011).
  25. Kwapis, J. L., Jarome, T. J., Schiff, J. C., Helmstetter, F. J. Memory consolidation in both trace and delay fear conditioning is disrupted by intra-amygdala infusion of the protein synthesis inhibitor anisomycin. Learn. Mem. 18, 728-732 (2011).
  26. Gilmartin, M. R., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. Trace and contextual fear conditioning are impaired following unilateral microinjection of muscimol in the ventral hippocampus or amygdala, but not the medial prefrontal cortex. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 452-464 (2012).
  27. Baysinger, A. N., Kent, B. A., Brown, T. H. Muscarinic receptors in amygdala control trace fear conditioning. PLoS ONE. 7, (2012).
  28. Wanisch, K., Tang, J., Mederer, A., Wotjak, C. T. Trace fear conditioning depends on NMDA receptor activation and protein synthesis within the dorsal hippocampus of mice. Behav. Brain. 157, 63-69 (2005).
  29. Smith, D. R., Gallagher, M., Stanton, M. E. Genetic background differences and nonassociative effects in mouse trace fear conditioning. Learn. Mem. 14, 597-605 (2007).
  30. Rudy, J. W., O'Reilly, R. C. Contextual fear conditioning, conjunctive representations, pattern completion, and the hippocampus. Behav. Neurosci. 113, 867-880 (1999).
  31. Wiltgen, B. J., Sanders, M. J., Anagnostaras, S. G., Sage, J. R., Fanselow, M. S. Context fear learning in the absence of the hippocampus. J. Neurosci. 26, 5484-5491 (2006).
  32. Reijmers, L. G., Perkins, B. L., Matsuo, N., Mayford, M. Localization of a stable neural correlate of associative memory. Science. 317, 1230-1233 (2007).
  33. Huerta, P. T., Sun, L. D., Wilson, M. A., Tonegawa, S. Formation of temporal memory requires NMDA receptors within CA1 pyramidal neurons. Neuron. 25, 473-480 (2000).
  34. Jacobs, N. S., Cushman, J. D., Fanselow, M. S. The accurate measurement of fear memory in Pavlovian conditioning: Resolving the baseline issue. J. Neurosci. Methods. 190, 235-239 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved