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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Nel seguente esperimento si descrive un protocollo per la traccia di paura condizionata nei topi. Questo tipo di memoria associativa comprende un periodo di traccia che separa lo stimolo neutro e lo stimolo incondizionato.

Abstract

In questo esperimento presentiamo una tecnica per misurare l'apprendimento e la memoria. Nel protocollo di condizionamento trace paura presentato qui ci sono cinque abbinamenti tra uno stimolo neutro e uno stimolo incondizionato. C'è un periodo di traccia di 20 secondi che separa ogni prova condizionata. Sul seguente congelamento giorno viene misurata durante la presentazione dello stimolo condizionato (CS) e il periodo di analisi. Il terzo giorno è prevista una prova 8 min per misurare memoria contestuale. I risultati sono rappresentativi di topi che sono stati presentati con lo stimolo incondizionato avversivo (shock) rispetto ai topi che hanno ricevuto le presentazioni di tono, senza lo stimolo incondizionato. Trace condizionamento alla paura è stato utilizzato con successo per rilevare i deficit e miglioramenti di apprendimento e memoria sottili nei topi che non si trovano con altri metodi di condizionamento alla paura. Questo tipo di paura condizionata è ritenuta essere dipendente connessioni tra la corteccia prefrontale mediale e l'ippocampo. Una polemica attuale è se questo metodo si crede di essere amigdala-indipendente. Pertanto, è necessario un altro test di condizionamento paura per esaminare apprendimento e memoria effetti amigdala-dipendenti, ad esempio attraverso il ritardo condizionamento alla paura.

Introduzione

In condizionamento alla paura uno stimolo neutro (NS) è accoppiato con uno stimolo incondizionato aversivo (US). Il NS è normalmente un tono e diventa uno stimolo condizionato (CS), attraverso abbinamenti ripetuti con gli Stati Uniti. Il CS può quindi provocare una risposta condizionata (CR), come il congelamento, in assenza del aversive US. Una paura protocollo condizionata comunemente usato è il ritardo condizionata. In questo protocollo l'insorgenza della NS e Stati Uniti è contiguo o con qualche sovrapposizione nella presentazione dello stimolo. Anche se il ritardo condizionamento alla paura è uno dei tipi più comunemente usati di temporale condizionata associativa, ci sono molti altri tipi di condizionamento associativo modalità temporali: il condizionamento simultanea, di condizionamento all'indietro, e la traccia di condizionamento 1. Nella traccia di paura condizionata c'è un intervallo libero da stimolo tra NS e gli Stati Uniti di alcuni secondi con un conseguente periodo di "traccia".

Diversi studi hanno riportato deficits in traccia paura condizionata quando le lesioni neurotossiche sono prodotte nelle strutture che l'input nei ippocampo 2-5 o quando gli agenti farmacologici sono usati per bloccare la funzione del recettore nell'ippocampo. Lesione ai risultati ippocampo in deficit nella traccia di condizionamento e condizionamento contestuale, ma non compromette il ritardo condizionamento alla paura 8. Ci sono molti vantaggi di utilizzare trace fear conditioning. Il protocollo condizionata paura può essere realizzato in un periodo di test di tre giorni e permette memoria ippocampo-dipendente che non è spazialmente dipendente. Tracciare paura condizionata può essere usata come test complementare al labirinto ad acqua di Morris, prova romanzo riconoscimento di oggetti, o altri test del labirinto a indagare memoria ippocampo-dipendente.

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Protocollo

I topi utilizzati nel seguente esperimento sono stati generati e ospitati presso la Baylor University a una temperatura ambiente di 22 ° C, con una luce 14 ore e 10 ore scuro (20:00-06:00 h) ciclo diurno. I topi sono stati dati ad libitum l'accesso al cibo e all'acqua. Tutte le procedure per i topi erano in conformità con il National Institutes of Linee guida per la salute per la cura e l'uso di animali da laboratorio e il protocollo animale è stato approvato dal Baylor University cura degli animali e del Comitato Usa.

Panoramica

Il compito paura traccia condizionata, basato su procedure descritte da Wiltgen e colleghi 9.

1. Preparazione delle attrezzature

Il timore camera di un'apparecchiatura di condizionamento (26 centimetri x 22 cm x 18 cm) costituito da due lati che sono acrilico, due lati che sono metallo ed estremità reticolati che viene utilizzato per erogare la scarica piede lieve. La camera di prova è la casad in un suono da camera attenuato. La camera è anche stretto luce per evitare che la luce esterna da influenzare il software di rilevamento del movimento.

  1. Calibrare i livelli di shock, livelli di luce, e livelli di intensità del suono per la camera di prova. Misurare il livello della camera di prova sfondo. Il rumore di fondo in questa camera è di 65 dB. Utilizzare un fonometro per misurare questo livello. Il contatore deve essere impostato a 70 dB, impostato su C, e al rilevamento impostazione lento.
    1. Calibrare il livello di shock a 0,5 mA. Utilizzare un dispositivo di calibrazione esterno per calibrare correttamente il livello di shock (vedi Materiali Tavolo). La misura interna del generatore scossa non è preciso. Il generatore di shock amministra uno shock criptato che non può essere misurata con precisione da un amperometro standard.
    2. Collocare un cavo su una delle sbarre di griglia e posizionare l'altro cavo 3 o 4 bar sopra. Utilizzare il generatore di shock per somministrare lo shock. Regolare il livello di shock fino a quando il livello corretto è raggiunto. Fate questo per EAch temere camera di condizionamento.
    3. Chiudere la porta alla camera quando si misura il livello di luminosità della camera. Calibrare livello la luce a circa 1,0. Questo è un numero specifico per il software FreezeFrame utilizzato in questo esperimento. Un esposimetro esterno leggerà questo come 2 lux. L'intensità luminosa può essere regolata spostando la posizione della luce casa o regolando il condensatore della lente. Assicurarsi di stringere le viti di regolazione per la lente dopo la regolazione.
    4. Calibrare il livello del suono di decibel a 85 dB. Utilizzare un misuratore di decibel esterno dentro la gabbia di test per calibrare il livello di decibel (vedi Materiali Tavolo). Il suono ha presentato sarà un tono di 2.700 Hz. Nota: Se si utilizzano topi di età superiore ai 6 mesi di età, può essere meglio usare rumore bianco dal momento che i topi più anziani possono avere deficit dell'udito.
  2. Dopo che l'apparecchio è pronto prendere i soggetti in una stanza un'azienda distinta. Nota: non ospitare il mouse nella stessa stanza come sala prove.
  3. Label the coda dei topi che saranno testati in ordine delle prove. E 'meglio ridurre le eccessive manipolazioni prima del test. In alternativa, le code possono essere etichettati il ​​giorno prima dell'esperimento per ridurre lo stress da maneggiamento. Dopo i topi sono stati etichettati permettono loro di acclimatarsi alla camera per 30 min. Avere gabbie in più pulite per alloggiare i topi dopo il test è stato completato.

2. Traccia condizionata Day 1

  1. Rimuovere ogni mouse dalla gabbia e metterli in gabbie individuali per il trasporto alla paura camera di condizionamento. Utilizzare biancheria pulita per ogni gabbia. Mettere una nota adesiva sulla gabbia di trasferimento per mantenere l'ordine dei topi testare il corretto. Nota: se i topi sono alloggiati singolarmente quindi possono essere trasportati nella loro gabbia casa.
  2. Posizionare il mouse nella camera di prova e chiudere la porta. Avviare il programma software.
  3. Il giorno di formazione, consentono ai topi di esplorare la camera per 3 min. Il software presenta poi un secondo tono (85 dB, 2.700 Hz) t 20o l'animale. Dopo un periodo di traccia 20 sec una leggera scossa (2 sec, 0,5 mA) viene somministrato all'animale.
  4. Registrare la reazione del soggetto per confermare che hanno ricevuto i stimoli avversi visualizzando il video. Un intervallo inter-trial 200 sec separa le 5 prove di condizionamento. Ogni prova è costituito da un tono 20 secondi seguita da un ritardo di 20 sec poi uno shock.
  5. Al termine del test consentire agli animali di rimanere nella camera di prova per 1 min prima di rimuoverla dalla gabbia test.
  6. Posizionare l'animale torna nella gabbia trasferimento e tornare alla sua gabbia casa. Se ci sono i topi aggiuntivi nella loro gabbia casa poi ospitare singolarmente il mouse fino a quando tutti i test completo topi. Ciò consentirà di ridurre lo stress all'altra topi che non sono stati testati. Una soluzione alternativa potrebbe essere quella di alloggiare singolarmente tutti i topi una settimana prima del test per ridurre l'influenza di rimuovere in continuo topi da una gabbia.
  7. Pulire la camera di prova con il 30% di isopropanolo dopo each animale è testato.
  8. Ripetere i passaggi 2,2-2,7 per tutti i mouse nella coorte di test.
  9. Rientro tutti i topi nella loro stanza colonia dopo l'ultimo mouse nella coorte è stato testato.

3. Trace paura condizionata Day 2: Prove di memoria Trace

  1. Test sulla memoria Trace avverrà il giorno 2. In questo protocollo ci sono 3 presentazioni di tono. Posizionare il mouse in un nuovo contesto per la prova traccia condizionata.
  2. Preparare il software per eseguire un programma con un periodo di riferimento 2 min seguita da tre presentazioni del 20 tono sec. C'è sa 220 sec ITI tra ogni presentazione di tono.
  3. Per il nuovo condizione di contesto, posizionare inserti acriliche chiare sul pavimento della camera a modificare la forma, la consistenza e il colore della camera di condizionamento.
  4. Cambiare l'odore nella camera posizionando l'estratto di vaniglia in una barca pesare sotto l'inserto pavimento.
  5. Pulire la camera con il 70% di etanolo invece del 30% di isopropanolo. Nota: Questo aiuteràper creare un contesto romanzo.
  6. Portare i topi nella stanza detenzione e relabel loro code per la prova, se necessario.
  7. Preparare nuove gabbie di trasferimento contesto sostituendo le lenzuola con carta straccia. Nota: Ciò contribuirà a creare un ambito romanzo.
  8. Posizionare il mouse nella camera di prova quindi avviare il programma. Pulire la camera con il 70% di etanolo dopo che il test è stato completato.
  9. Riportare i topi per loro gabbia casa dopo la traccia di condizionamento è completata. Rientro tutti i topi nella loro stanza colonia quando tutti i topi sono stati testati.

4. Trace paura condizionata Giorno 3: Prove di memoria contestuale

  1. Il terzo giorno di condizionamento contestuale è condotta. Preparare il software per eseguire un programma per registrare il comportamento di congelamento per 8 min.
  2. Pulire la camera con il 30% di isopropanolo prima delle prove e dopo aver testato ogni mouse. Il contesto deve essere identica a quella del giorno 1. Le gabbie di trasferimento devono essere le stesse in 1 giorno.
  3. Portare i topi nella stanza detenzione ed etichettare le loro code per il test.
  4. Collocare ogni mouse nella camera di prova quindi avviare il programma. Pulire la camera con il 30% di isopropanolo al termine del test.
  5. Rientro tutti i topi nella loro stanza colonia una volta completato.

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Risultati

Per i risultati rappresentativi presentiamo i dati di controllo C57BL/6J topi adulti che hanno ricevuto gli abbinamenti stimolo neutro con lo stimolo incondizionato (condizione di shock) rispetto ai topi che hanno ricevuto lo stimolo neutro, ma non hanno ricevuto lo stimolo incondizionato (nessuna condizione di shock). È importante eseguire questa condizione quando prima configurazione di questa prova comportamentale per determinare se il protocollo è stato eseguito correttamente.

I dati d...

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Discussione

Ci sono stati diversi studi che hanno chiarito i circuiti neurali che sottende traccia paura condizionata. Trace condizionamento alla paura si ritiene di coinvolgere il CA1 dell'ippocampo 12-14. Vi sono anche prove che la corteccia prefrontale mediale (mPFC) gioca un ruolo importante nella traccia occhiolino condizionata 15 e il mPFC è stato trovato per essere coinvolti in traccia paura condizionata. Uno studio ha trovato che i neuroni mPFC forniscono attività sostenuta durante il periodo di ...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è supportato da una concessione Research Council Baylor University e da un assegno di ricerca della Fondazione Epilessia.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
FreezeFrameCoulbourn
30% IsopropanolPurchase 90% isopropanol and dilute it down to 30%
70% Ethanol
Amp-meterMed-AssociatesENV-420Windows XP, Vista, and 7 Compatible (32-bit only)
Digital Sound Level Meter33-2055
Vanilla ExtractMcCormick Pure Vanilla Extract
Sticky NotesPost-it3 in x 3 in

Riferimenti

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